全 文 ：第 18 卷
第 5 期

Vol. 18
No. 5
草
地
学
报
ACTA AGRESTIA SINICA



2010 年
9 月

Sep.

2010
盐胁迫对碱地风毛菊苗期脯氨酸代谢的影响
夏方山 , 董秋丽, 董宽虎*
(山西农业大学动物科技学院, 山西 太谷
030801)
摘要: 通过对碱地风毛菊( Saussur ea runcinata) 苗期分别以 NaCl和 Na2 SO4 进行胁迫, 设 6 个浓度和1 个对照, 测
定其脯氨酸含量及

氨基转移酶、吡咯啉
5
羧酸合成酶和脯氨酸脱氢酶活性, 以探讨其苗期耐盐性及脯氨酸代谢
途径,并为盐碱地植被恢复与改良提供依据。结果表明: NaCl 和 Na2 SO4 胁迫下, 碱地风毛菊的脯氨酸含量随
NaCl和 Na2 SO 4 胁迫浓度增加而增高,在盐胁迫下, 碱地风毛菊的脯氨酸合成途径以鸟氨酸途径为主; 且在 300
mmol
L - 1的盐浓度胁迫下碱地风毛菊苗期的脯氨酸代谢最为旺盛,其对 NaCl胁迫的耐性较高。
关键词:盐胁迫; 碱地风毛菊;脯氨酸代谢;

氨基转移酶; 吡咯啉
5
羧酸合成酶; 脯氨酸脱氢酶
中图分类号: Q945. 78



文献标识码: A




文章编号: 1007
0435( 2010) 05
0689
05
Effect of Salinity on Proline Metabolism of Saussurea runcinata Seedling
XIA Fang
shan, DONG Qiu
li, DONG Kuan
hu*
( College of Animal Science and Techn ology, S hanx i Agricultural University, T aigu, S hanxi Province 030801, Ch ina)
Abstract: Proline( Pro ) , Py rroline
5
carboxy late synthetase( P5CS ) , Ornithine
oxo
acid t ransaminase (


OA T) , and Proline dehydr agenase ( Pr oDH ) o f leaves and r oots f rom S aussur ea r uncinata were analyzed
to assess the proline metabolism and salinity tolerance of Saussurea r uncinata seedlings. T he study design
includes six t reatments and one contro l with varying levels o f either NaCl or Na2SO4 . Results show that
the proline content increased w ith increasing the concentration of either NaCl or Na2SO4 . T he pathw ay of
Or nithine is a main synthesis pathw ay for pro line metabolism in Saussurea r uncinata seedling under salt
st ress. Proline metabolism o f Saussurea r uncinata seeding is most vigo rous under 300 mmol/ L salt st ress
( either NaCl or Na2SO4 ) , w hile S aussur ea runcinata seeding s have more tolerant to NaCl st ress than to
Na2 SO 4 str ess. These r esults also pro vide a database for restorat ion and improvement of Saline
alkali so il.
Key words: Salt str ess; Saussurea r uncinata ; P roline metabolism;

OAT ; P5CS; ProDH


植物组织中脯氨酸( Pro)含量的多少,直接关系
到其抗逆性的强弱,与植物对干旱和盐胁迫适应性
之间表现出正相关[ 1] 。植物的 Pro 合成、累积及代
谢是一个受非生物胁迫和细胞内 Pr o浓度调控的生
理生化过程。Pro 积累主要通过 3种不同的途径实
现:从头合成;降解减少; 特异性转运系统作用,实现

源
(效应细胞等)
库
(靶细胞等)分配 [ 2]。从头合
成方面,已证明植物体内存在 2条 Pro 合成途径,根
据起始氨基酸分别命名为谷氨酸( Glu)途径和鸟氨
酸( Orn)途径 [ 3] ,分别以吡咯啉
5
羧酸合成酶( Pyr

r oline
5
carboxy late synthetase, P5CS)为关键酶和
以鸟氨酸

氨基转移酶 ( Ornithine
oxo
acid t rans

am inase,

OAT )为关键酶。Pro 合成过程中究竟
是哪一条途径居于主导地位, 有待进一步研究 [ 1]。
而脯氨酸脱氢酶( ProDH )是催化盐胁迫下 Pro 降
解反应中限速步骤的关键酶,对逆境条件下植物体
内 Pro 的积累起重要作用。目前对碱地风毛菊
( S aussur ea r uncinata)的耐盐性研究报道甚少, 因
此,本试验以碱地风毛菊为材料, 参照沙伟等[ 4] 的实
验设计略作增加, 将浓度设为 0, 60, 120, 180,
240, 300和 360 mmo l
L- 1共 7个梯度, 以探讨其
盐胁迫的致死浓度, 并对其苗期盐胁迫下 Pro 代谢
途径进行研究,以期明确在盐胁迫下碱地风毛菊的
Pro 代谢途径, 为盐碱地植被恢复与改良提供依据。
1
材料与方法
1. 1
种子来源
试验用碱地风毛菊种子于 2008 年秋采自山西
省右玉县威远镇后所堡村东的盐碱化草地, N39
59

收稿日期: 2010
01
08;修回日期: 2010
09
27
基金项目:国家
十一五
科技支撑计划项目( 2007BAD56B01)资助
作者简介:夏方山( 1983
) ,男,山东潍坊人,硕士研究生, 研究方向为牧草抗逆性, E
mail: xiafangshang1213@ 163. com; * 通讯作者 Au

thor for correspondence, E
mail: don gkuanhu@ 126. com
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报 第 18卷
26. 2
, E112
19
19. 8
,海拔高度为 1329 m。
1. 2
试验方法
本试验在山西农业大学草业科学系日光能温室
进行,温度 14~ 30
, 湿度 65% ~ 80%。采用直径
25 cm、高 20 cm 的塑料盆,装入 1
1的蛭石与珍珠
岩( v / v) , 插入 PVC 管以便浇水及营养液。采用完
全随机区组设计,播种量为 100粒/盆,播种 75盆,
胁迫前每隔 3 d 用 Hoagland 营养液浇灌一次, 于
17: 00- 20: 00时进行。其他时间每日用自来水补
充失水,以称重法确定失水量。出苗后一个月选取
长势相对均匀的定苗, 定苗 2 周后对其进行盐分胁
迫。试验分别以 NaCl 和 Na2 SO 4 胁迫, 浓度为 0
( CK) , 60 mmo l
L - 1 , 120 mmol
L - 1 , 180 mmol

L - 1 , 240 mmo l
L- 1 , 300 mmo l
L- 1 , 360
mmo l
L - 1共 7 个梯度, 3 次重复。以含有相应浓
度盐分的营养液为处理液, 胁迫组每天按 60 mmol

L - 1的浓度梯度进行递增, 直至达到指定的浓度
为止, 对照组只浇灌 H oagland 营养液。盐胁迫 2
周后,分别采集其叶片和根系, 置于- 80
冰箱保
存,进行相关指标分析。
1. 3
测定指标及方法
1. 3. 1
Pro 含量的测定
采用紫外可见分光光度
计法(磺基水杨酸
酸性茚三酮) ,按照邹琦 [ 5]的方法
进行。
1. 3. 2
P5CS 活性测定方法
P5CS 的抽提方法按
照 Kavi等[ 6] 的方法进行。蛋白含量以牛血清蛋白
为标准蛋白质, 按照 Br adfo rd[ 7] 的方法进行。P5CS
活性测定按照 Garcia
Rio s 等[ 8]的方法进行。
1. 3. 3


OAT 活性测定方法


OAT 粗酶提取
按照 Roosens等[ 9] 的方法进行, 蛋白含量以牛血清
蛋白为标准蛋白质, 按照 Bradford[ 7] 的方法进行。


OAT 活性的测定参照 Kim 等[ 10] 的方法, 略
做改动。反应体系为: 50 mmo l
L - 1的磷酸缓冲
液、35 mmol
L- 1的 L
鸟氨酸、5 mmo l
L - 1的


酮戊二酸和0. 05 mmol
L- 1的磷酸吡哆醛混合, 总
体积为 0. 9 mL,再加入 0. 1 mL 酶液, 在 25
条件
下反应 20 m in后加入 0. 3 mL 3 mo l
L - 1的高氯
酸终止反应,然后加入 0. 2 mL 2%茚三酮沸水中加
热 20 min染色, 冷却后 10261 g 离心弃去上清液;
用 1. 5 mL 无水乙醇溶解红色沉淀物, 离心后取其
上清液于 510 nm 测定吸光值。产物吡咯啉
5
羧酸
( P5C)与茚三酮生成的红色物质摩尔消光系数为
16. 5 L
mmol- 1
cm- 1。以每分钟生成 0. 001
mmol P5C 的量为一个

OAT 活性单位( U )。
1. 3. 4
ProDH 活性测定方法
参照 Lutts等 [ 11]的
方法提取,略做改动。样品加 4倍体积提取缓冲液
( w / v )于冰浴中研磨,提取缓冲液为 0. 1 mol
L- 1
的 Na2HPO4
KH 2PO4 ( pH7. 8) , 内含 1. 0 mol
L - 1
的 EDTA , 10 mol
L- 1的巯基乙醇。匀浆液经3层
纱布过滤后 4000 g 离心 15 min。上清液加 T ri

tonX
100至终浓度 0. 15%, 涡悬后于冰浴中放置
30 min, 后于 20000 g 离心 20 min, 上清液测酶
活性。
活性测定反应混合液体积为 2. 5 mL, 内含
0. 15 mol
L - 1的 N a2 CO 3
NaHCO 3 ( pH10. 3)缓冲
液 1. 6 mL, 0. 2 mL 0. 1 mol
L- 1的 L
Pr o, 0. 2
mL 0. 9 mmol
L - 1的 2, 6
二氯酚靛酚。30
水浴
中保温 5 min, 加入 0. 5 mL 酶提取液(蛋白含量为
0. 8 mg
mL - 1 ) ,混合均匀后加入 0. 2 mL PM S试
剂( 9 mg
mL - 1 , 现配) , 摇匀后立即于 600 nm 下
检测光密度变化。以每分钟 A600减少 0. 001为一
个 ProDH 酶活单位( U )。
1. 4
数据处理方法
脯氨酸及其代谢酶的试验数据通过 Excel 2003
和 SAS 8. 0统计分析软件处理。
2
结果与分析
2. 1
对 Pro含量的影响
不同浓度 NaCl和 Na2SO 4 胁迫下碱地风毛菊
根系和叶片中 Pro 含量的变化见表 1。


由表 1可知, 在 N aCl和 Na2SO 4 胁迫下, 不同
盐浓度之间 Pro 含量差异显著 ( P< 0. 05) , 碱地风
毛菊叶片中 Pro 含量随盐浓度的增加而增加,根系
中 Pro 含量随盐浓度的增加而增加, 在 300 mmol

L - 1盐浓度时根系中 Pro 含量达到最大值, 之后下
降;碱地风毛菊根系中 Pr o 含量明显高于叶片中
Pro 含量;在 NaCl和 Na2 SO4 的相同浓度胁迫下,
碱地风毛菊叶片之间以及根系之间差异明显。
2. 2
对 P5CS活性的影响
不同浓度 NaCl和 Na2SO 4 胁迫下碱地风毛菊
根系和叶片中 P5CS活性的变化见表 2:
690
第 5期 夏方山等:盐胁迫对碱地风毛菊苗期脯氨酸代谢的影响
表 1
盐胁迫下碱地风毛菊的根系和叶片的脯氨酸含量变化
T able 1
Changes o f proline content in the ro ots and leaves of Saussurea runcinata under salt st ress,
g
g - 1 FW
浓度 Concent rat ion
mm ol
L- 1
NaCl
叶片 L eaves 根系 Roots
Na2SO4
叶片 L eaves 根系 Roots
0( CK) 22. 93
1. 61g 241. 42
1. 69g 22. 93
1. 61g 241. 42
1. 69g
60 102. 40
4. 20f 698. 10
0. 81f 148. 65
1. 51f 325. 95
2. 48f
120 121. 77
2. 58e 1365. 42
4. 54e 167. 16
3. 19e 403. 68
3. 17e
180 370. 28
2. 81d 2112. 19
0. 73d 327. 66
1. 28d 1354. 23
2. 73d
240 405. 51
4. 10c 2601. 26
1. 61c 548. 76
0. 62c 2223. 06
1. 51b
300 731. 44
4. 15b 2828. 64
3. 64a 873. 51
1. 35b 2307. 41
2. 25a
360 937. 50
0. 64a 2641. 90
2. 53b 908. 62
1. 50a 2204. 39
5. 08c


注:同列不同字母表示差异显著( P< 0. 05) ,下同
Note: Different let ters in th e sam e colum n denote signif icant dif f erences ( P< 0. 05) , the same as below
表 2
盐胁迫下碱地风毛菊的根系和叶片的 P5CS活性变化
Table 2
Changes o f P5CS in the ro ots and leaves of S aussur ea runcinata under salt st ress, U
mg - 1 Protein
浓度 Concent rat ion
mm ol
L - 1
NaCl
叶片 L eaves 根系 Roots
Na2SO4
叶片 Leaves 根系 Roots
0( CK) 4. 42
0. 19a 2. 83
0. 17 c 4. 42
0. 19a 2. 83
0. 17g
60 1. 81
0. 21d 2. 08
0. 03 d 2. 43
0. 01c 4. 83
0. 04d
120 1. 56
0. 03d 1. 87
0. 01 e 1. 12
0. 01f 4. 42
0. 12e
180 2. 23
0. 19c 2. 67
0. 10 c 1. 65
0. 01e 3. 73
0. 03f
240 3. 35
0. 20b 2. 67
0. 10 c 1. 76
0. 01e 4. 98
0. 01c
300 2. 14
0. 20c 3. 66
0. 09 b 2. 30
0. 03d 5. 16
0. 04b
360 1. 55
0. 20d 4. 46
0. 06 a 3. 06
0. 05b 5. 84
0. 05a


由表 2可知, 在 NaCl和 Na2 SO 4 胁迫下, 碱地
风毛菊叶片中 P5CS 活性均显著低于对照 ( P <
0. 05) ;根系中 P5CS活性均随盐浓度的增加呈先下
降后上升趋势, 在 300 mmol
L - 1和 360 mmol

L- 1 NaCl 胁迫下 P5CS 活性显著高于对照 ( P <
0. 05) , 60 mmol
L - 1和 120 mmol
L- 1 NaCl胁迫
下,根系中 P5CS活性显著低于对照( P< 0. 05) , 在
Na2 SO 4 胁迫下碱地风毛菊根系中 P5CS 活性均显
著高于对照( P< 0. 05) , 且在 360 mmo l
L - 1的浓
度下酶活性最高; 同种盐胁迫下碱地风毛菊根系和
叶片中 P5CS活性差异明显,在 NaCl和 Na2 SO 4 相
同浓度胁迫下碱地风毛菊叶片之间以及根系之间的
P5CS活性差异明显。
2. 3
对

OAT活性的影响
不同浓度 NaCl和 Na2SO 4 胁迫下碱地风毛菊
根系和叶片中

OAT 活性变化见表 3。
表 3
盐胁迫下碱地风毛菊的根系和叶片的

OAT活性变化
Table 3
Changes of

OAT in the ro ots and leaves of S aussur ea runcinata under salt stress, U
mg - 1 P rotein
浓度 Concent rat ion
mm ol
L - 1
NaCl
叶片 L eaves 根系 Roots
Na2SO4
叶片 Leaves 根系 Roots
0( CK) 9. 33
2. 37cd 9. 92
1. 75 a 9. 33
2. 37e 9. 92
1. 75c
60 20. 25
3. 11a 13. 75
1. 83 c 12. 88
0. 80d 11. 32
2. 78cd
120 11. 24
0. 98bc 14. 16
4. 69 c 20. 02
5. 38b 30. 34
0. 30a
180 13. 75
2. 85b 16. 63
1. 87 b 20. 58
4. 14b 24. 24
0. 39b
240 12. 84
1. 11b 13. 88
4. 95 c 20. 65
0. 34a 12. 60
2. 92c
300 19. 24
1. 27a 15. 78
3. 52 b 21. 83
4. 61a 11. 73
1. 80c
360 8. 39
0. 92d 19. 77
2. 87 a 17. 44
4. 25c 11. 46
2. 78d


由表 3可知, 在 NaCl和 Na2 SO 4 胁迫下, 除了
360 mmol
L - 1 NaCl胁迫下碱地风毛菊的叶片中


OAT 活性低于对照外, 其他均高于对照, 且都呈
现随盐浓度的增加而先升高后下降的趋势。总体
上, 根系与叶片之间差异显著 ( P < 0. 05 ) , 且
Na2 SO 4 胁迫下碱地风毛菊中

OAT 活性明显高
于 NaCl胁迫下

OAT 活性。
2. 4
对 ProDH活性的影响
不同浓度 NaCl和 Na2SO 4 胁迫下碱地风毛菊
根系和叶片中 ProDH 活性变化见表 4。
691
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表 4
盐胁迫下碱地风毛菊的根系和叶片的 ProDH活性变化
Table 4
Changes o f ProDH in the r oo ts and leaves of Saussur ea runcinata under salt str ess, U
g- 1 FW
浓度 Concent rat ion
mm ol
L - 1
NaCl
叶片 L eaves 根系 Roots
Na2SO4
叶片 Leaves 根系 Roots
0( CK) 175. 37
1. 21a 193. 74
3. 02d 175. 37
1. 21a 193. 74
3. 02d
60 87. 94
2. 07d 184. 41
0. 26e 42. 39
0. 19d 208. 07
2. 82c
120 72. 26
0. 40e 160. 35
2. 47f 43. 88
1. 12cd 235. 33
2. 14b
180 61. 95
0. 62f 159. 57
2. 26f 44. 71
1. 10bc 246. 43
1. 29a
240 62. 70
1. 90f 280. 76
4. 20a 44. 56
0. 94bc 150. 34
1. 08e
300 141. 62
1. 30c 257. 33
3. 78b 46. 64
1. 43b 111. 73
2. 30f
360 165. 58
1. 32b 230. 47
1. 26c 45. 52
1. 23bc 72. 07
0. 13g


由表 4可知, 在 NaCl和 Na2 SO 4 胁迫下, 碱地
风毛菊叶片中 ProDH 活性显著低于对照 ( P <
0. 05) ,而根系中 ProDH 活性明显高于叶片, 2种盐
胁迫下差异明显。在 NaCl胁迫下, 碱地风毛菊叶
片中 ProDH 活性先下降后升高, 根系中 ProDH 活
性先下降后升高,当浓度大于 240 mmol
L - 1时显
著高于对照( P< 0. 05) ; 在 Na2SO 4 胁迫下, 碱地风
毛菊叶片中 ProDH 活性先下降后升高, 根系中
ProDH 活性开始随胁迫浓度增加而增高,当浓度为
180 mmol
L - 1时 ProDH 活性最大 ( 246. 43 U

g- 1 FW) ,之后下降。
3
讨论
3. 1
对 Pro含量的影响
研究表明, 在逆境条件中植物体内 Pro 含量会
大量积累[ 12] 。盐胁迫下,碱地风毛菊苗期 Pro 含量
显著增加,说明碱地风毛菊受到的逆境胁迫增大, 渗
透调节能力增强,所受胁迫强度高,适应能力强。徐
春波等[ 13] 对转基因冰草( Agr opy r on cr i statum )植
株耐盐性的研究表明, 叶片游离脯氨酸的含量随盐
浓度增高而增加; 张振铭等[ 14] 研究表明,盐处理组
的獐毛( A eluropus sinensi s)叶片 Pro 含量从胁迫的
第 3 d开始就明显高于对照,且呈逐渐增加趋势; 杜
利霞等[ 15] 研究表明, 盐胁迫下新麦草 ( P sathy

rostachy s j uncea)幼苗中 Pro 含量大幅度的增加, 这
均与本试验结果相一致。
3. 2
对 P5CS活性的影响
P5CS是 Pro 合成中 Glu 途径的限制酶, P5CS
的反馈调节在控制植物处于正常和胁迫条件下 Pro
的水平起着重要作用 [ 16]。在 NaCl 胁迫下, 碱地风
毛菊叶片中 P5CS 活性显著低于对照, 说明 P5CS
在盐胁迫下对碱地风毛菊的 Pro 合成影响不大, 即
盐胁迫下碱地风毛菊合成不以谷氨酸合成途径为
主,可能因为 P5CS受 Pro 的反馈调节有关, 盐胁迫
强度增大,导致碱地风毛菊体内 Pro 大量含量增加,
反馈调节抑制了碱地风毛菊中 P5CS 活性。
3. 3
对

OAT活性的影响


OAT 是 Pro 合成途径中 Orn 途径中的关键
酶,它的活性不受 Pro 的反馈抑制。试验中碱地风
毛菊中

OAT 活性显著高于对照,说明中性盐胁迫
下碱地风毛菊的 Pro 合成途径以 Orn 途径为主,一
般认为 Pro 合成的 2条途径因植物和生长时期不同
而各自起着重要的作用 [ 1] , 在渗透胁迫条件下,
PSCSmRNA和

OAT mRNA 表达与植物体内的
氮素水平有关,在渗透胁迫条件和低氮条件下谷氨
酸途径占主导地位, 而在非胁迫条件及高氮条件下
鸟氨酸途径又居于主导地位 [ 3]。本试验结果可能由
于营养液供应充足, 导致植物体内氮素水平过高有
关。赵福庚等[ 17] 的研究结果也表明高胁迫强度时
P5CS活性下降, 故高胁迫强度时 Orn 途径对 Pr o
的积累起主导作用。另外,本试验结果也可能与碱
地风毛菊胁迫时间过长, 胁迫强度高有关。余光辉
等[ 1 8]对于假俭草 ( Pennisetum clandest inum )的研
究表明,在水分胁迫条件下, Pro 累积的规律性与


OAT 的活性变化呈现出很好的相关性, 而与 P5CS
的活性呈负相关, 这说明假俭草植物 Pro 的累积主
要受到

OAT 的活性调节,在长期自然干旱的条件
下, P5CS 酶的活性也呈下降的趋势, 而

OAT 的
活性有不同程度的增加, 这与本试验结果相一致。
P5CS活性下降与植物本身对盐碱的耐受性也有
关,碱地风毛菊是典型的耐盐植物,在长期的进化过
程中形成了较强的耐盐碱能力, 盐胁迫下 Pro 含量
增加,反馈抑制了 P5CS活性, 但碱地风毛菊为适应
盐渍环境,有需要继续增加体内 Pro 含量,这就必须
依靠不受 Pro 的反馈抑制的 Orn途径, 所以碱地风
692
第 5期 夏方山等:盐胁迫对碱地风毛菊苗期脯氨酸代谢的影响
毛菊中

OAT 活性升高。
3. 4
对 ProDH活性的影响
ProDH 是 Pro 降解途径中的关键酶,在渗透胁
迫时其表达活性受到抑制。试验中碱地风毛菊叶片
中 ProDH 活性下降, 是由于渗透胁迫需要碱地风
毛菊中 Pro 积累, 抑制了 ProDH 活性,以减少 Pro
的降解,说明 Pr o的积累是合成增加和降解减少共
同作用的结果。这与黄诚梅等[ 19] 的研究一致, 研究
发现甘蔗 ( Sacchar um ) 在 PEG 胁迫 72 h 以前,
ProDH 活性呈降低趋势。本试验中根系 ProDH 活
性总是高于叶片 ProDH 活性, 这可能是因为根系
中 Pro 含量高于叶片中 Pro 含量的原因。
4
结论
4. 1
300 mmol
L- 1 NaCl和 Na2SO4 胁迫下碱地
风毛菊苗期的脯氨酸代谢最为旺盛, 且对 NaCl 胁
迫的耐性较强。
4. 2
随 NaCl和 Na2 SO4 胁迫浓度的增加, 碱地风
毛菊苗期 Pro 含量增高; P5CS 活性呈现出先下降
后升高的趋势;

OAT 活性呈现出先升高后下降的
趋势; ProDH 活性除 Na2SO4 胁迫下根系呈现出先
升高后下降的趋势外, 其余均呈现出先下降后升高
的趋势。
4. 3
在 NaCl和 Na2 SO4 胁迫下,碱地风毛菊苗期
的 Pro 合成途径以 Orn途径为主。碱地风毛菊苗
期 Pro 的积累是 P5CS,

OA T 和 ProDH 三者共同
作用的结果。
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