全 文 ：第 19 卷
第 4 期

Vol. 19
No. 4
草
地
学
报
ACTA AGRESTIA SINICA



2011 年
7 月

Jul.

2011
从线粒体序列分异探讨鼢鼠凸颅亚属(Eospalax)
种间差异的有效性
苏军虎1 , 王
静2, 刘荣堂1 , 花立民1 , 吴建平1 , 刘发央1*
( 1. 甘肃农业大学, 甘肃 兰州
730070; 2. 兰州职业技术学院, 甘肃 兰州
730070)
摘要:鼢鼠亚科动物中凸颅亚属鼢鼠的物种界限一直不清楚。研究测定了甘肃境内鼢鼠类线粒体 DNA D- loop 和
ND4 基因序列, 获得了 23 条长度为 414~ 424 bp 的 D- loop和 17 条长度为 425~ 438 bp 的 ND4 基因同源序列, 通
过其序列分异、遗传距离和系统发育分析, 探讨该类群的分类学地位。结果表明: 凸颅亚属鼢鼠序列间变异类型丰
富,单倍型多样度高, 其种间遗传距离大于种内遗传距离;基于邻接法( N J)、贝叶斯推论法( BI)和最大似然法( ML )
构建的分子系统树显示:甘肃鼢鼠、高原鼢鼠、斯氏鼢鼠、秦岭鼢鼠均各自构成单系, 并构成 2 个进化枝, 其中甘肃
鼢鼠最为原始,单独构成一枝; 高原鼢鼠与斯氏鼢鼠为姐妹群, 处于较进化的位置, 后与秦岭鼢鼠聚在一起构成另
一枝,支持 4 个种均为独立种的观点。
关键词:鼢鼠; 线粒体基因;凸颅亚属; 分类地位
中图分类号: Q959. 837



文献标识码: A




文章编号: 1007-0435( 2011) 04-0694-05
Species Validities of Zokors(Mysopalacinae) Inferred
from mtDNA Sequences Variations
SU Jun-hu1 , WANG Jing2 , L IU Rong- tang 1 , HUA L-i min1 , WU Jian- ping1 , L IU Fa-yang1*
( 1. Gansu Agricu altural University, Lanzhou 730070, C hina; 2. Lan zhou Vocat ional technology college , Lanzh ou 730070, Chin a)
Abstract: Zokors are kinds of fossorial, subterr anean rodents. The phylo genet ic relat ionships and status of
Eospalax zokors ( Mysopalacinae) are still unknown. Samples w er e collected from Lintan and Zhuoni of
Gansu prov ince. Mitochondrial cont ro l region and ND4 sequences o f zokors w ere investig ated by PCR and
direct sequencing. T his study obtained D-loop ( 414~ 424 bp) and 17 homologous nucleo tide sequences
( 425~ 438 bp) . T he tax onomic status of Eospalax zokor s w as invest igated based on sequences variat ion,
genet ic distance and phylog enet ic analyses. Results show ed that there w ere greater sequence var iat ion and
haplotypes diver sity among the zokors. Ther e w ere g reater genet ic distances among the species than that
w ithin species. T he phylog enet ic t rees const ructed based on the Neighbor- Joining( NJ) , Bayesian Inference
( BI) and Max imum Likelihood ( M L) methods indicated that Myospalax cansus , M. r uf escens, M. bai ley i,
M. smi th form the monophyletic clades. M. cansus is a basal clade. M. bailey i and M. smith are evo lut ion-
ary and clustered as sister g roups first, and then clustered tog ether w ith M. r uf escens. T his view point sup-
ported that these four species are all independent species.
Keywords:Zokor s; mtDNA; Eospalax ; Taxonomic status


鼢鼠亚科动物( M yo spalacinae)是终年独居营
地下生活的啮齿动物, 该类群中的甘肃鼢鼠
(Myospalax cansus )、高原鼢鼠(M . bai ley i)等是我
国草地鼠害中的主要害鼠[ 1]。依头骨枕部的形式,
该类群明显地分为 3类: 凹颅型(已绝灭) ,如丁氏鼢
鼠 ( M. g osp alax t ingi ) ; 凸颅型, 如中华鼢鼠 ( M .
f ontanieri ) ;平颅型,如东北鼢鼠(M. p si lur us)。平
颅鼢鼠分布于我国、蒙古和原苏联西伯利亚南部,凸
颅鼢鼠仅见于我国。然而就凸颅鼢鼠中甘肃鼢鼠、
秦岭鼢鼠 ( M . r uf escens )、高原鼢鼠、斯氏鼢鼠
(M. smith)的物种的有效性一直不清楚。樊乃昌等[ 2]
认为甘肃鼢鼠和高原鼢鼠为独立种。李保国和陈服
收稿日期: 2010-04-16;修回日期: 2011- 04-21;
基金项目:公益性行业(农业)科研专项经费项目( 201003019)资助
作者简介:苏军虎( 1981- ) ,男,甘肃西和人,博士研究生,研究方向为分子生态学, E-m ail: s ujh@ gsau. edu. cn ; * 通讯作者 Author for cor-
respondence, E-mail: liufy@ gsau. edu . cn
第 4期 苏军虎等:从线粒体序列分异探讨鼢鼠凸颅亚属( E osp alax)种间差异的有效性
官[ 3]认为甘肃鼢鼠和高原鼢鼠未达到种级地位, 仍
可作为中华鼢鼠的 2个亚种。李晓晨和王廷正[ 4] 支
持甘肃鼢鼠、秦岭鼢鼠和中华鼢鼠独立种的观点。
Wu等[ 5] 基于毛髓质指数的研究支持甘肃鼢鼠、高
原鼢鼠、秦岭鼢鼠各自独立为种的观点。由于该类
群形态特征的地域分化, 明显的年龄差异以及可能
的个体变异,加之其独特生活方式导致的趋同进化
( 3个头骨类型是平行进化的很好例证) , 给依据形
态学和生态学方面的物种划分带来了很大困难。至
今,关于其系统分类学地位一直存有争议。
线粒体 DNA 由于具有分子量小、结构简单、一
级结构进化速度快等特征, 作为一种优良的分子标
记广泛应用于动物群体遗传学和系统进化研究中,
其中控制区( D- loop)为非编码区, 因缺乏编码的选
择压力而比其他基因的进化速率更快[ 6] ,编码蛋白
质的 ND4基因变异适中, 含有准确的系统发育信
息,是系统进化和种群遗传研究中的理想标记基因,
在近缘物种和快速形成的物种间系统进化关系研究
以及种群研究等方面已有广泛应用 [ 7]。形态观察发
现 Eospalax 亚属以脑颅枕部隆起显著区别于My-
osp alax 亚属。苏军虎等[ 8] 就 Eosp alax 亚属部分
物种系统演化关系进行了研究。Tsvirka等 [ 9] 采用
RAPD-PCR技术就分布于俄罗斯的鼢鼠亚科动物
遗传多样性和系统演化关系进行了研究。然而就分
子水平探讨物种有效性的研究至今未见报道。为方
便研究种级及以下的分类问题, 本研究认同大多数
研究者观点: 鼢鼠现存 1 属, 即鼢鼠属( Myosp al-
ax ) , 2亚属,即凸颅鼢鼠亚属 ( Eosp alax ) 和平颅鼢
鼠亚属(Myosp alax ) ,采集凸颅鼢鼠部分类群,测定
了 23只鼢鼠线粒体 DNA D-loop序列和 17只鼢鼠
线粒体 ND4序列,从分子水平探讨我国凸颅亚属鼢
鼠物种的有效性及其种间演化关系,以期为理清鼢
鼠亚科动物的分类地位提供分子标记方面的依据。
1
材料与方法
1. 1
试验材料
试验动物于 2006年 3- 7月,从甘肃省境内山丹
县、临潭县、卓尼县等地采集。采集肝脏后, 95%乙醇
保存,带入实验室- 70
冰箱冷冻保存待用。按照李
华等[ 10]的分类特征,通过参照标本对比鉴别, 先将样
本归为凸颅鼢鼠亚属( Eospalax ) ,并分为 4个种。
1. 2
基因组 DNA的提取
称取研磨的肝脏组织 0. 5~ 1. 0 g ,采用碱变性
法提取线粒体 DNA [ 11]。
1. 3
DNA的 PCR 扩增、PCR产物的纯化及序列
测定
参考序列来自 N CBI 上发表的鼹形鼠( N anno-
spalax ehrenberg i ) (登录号为: NC005315)线粒体
DNA 全序列。利用 Clustal X ( 1. 83 ) 软件[ 12] 和
BLA ST 软件[ 13] 进行序列对比后,用 Primer Prem-i
er 5. 0[ 14]设计用于扩增 D-loop和 ND4序列的特异
性引物,所用引物由上海生工生物技术有限公司合
成。引物序列为:
D- loop: 上 游 5
T CCCCAAAGCA TCAAG-
GAAG; 下游 5
GGCAT GGGCT GATT AGA CAT T
ND4: 下 游 5
-A AACCAT AGCCT ACCCCT-
TC;下游 5
-CACGGT AGCAT GAGT TA GCA
PCR扩增反应体系为: DNA 模板 1
L, PCR
buf fer (含 Mg2+ 20 mmo l
L- 1 ) 2. 5
L, dNTP
( 10 mmol
L- 1 )0. 5
L,上下游引物( 10 pmol

L- 1 )
各1
L, T aq DNA 聚合酶 ( 2U

L - 1 ) 0. 5
L, 加
水补足 25
L。以 94
预变性 5 m in, 94
变性
40 s, 57
退火 40 s, 72
延伸 40 s, 35个循环,最后
72
延伸 10 min, 然后于 4
保存。
扩增得到的 PCR 产物用 1. 5%的琼脂糖凝胶
电泳检测,用 DNA胶回收试剂盒( TaKaRa)进行纯
化、回收,对扩增效果良好的样品送往上海生工生物
工程有限公司进行双向测定。
1. 4
DNA序列数据处理
通过 Chromas ( V1. 45)软件获得原始序列数
据,同时进行人工校对, 用 Clustal X( 1. 83) [ 12]程序
对所得的 DNA 序列进行比对。通过 DAN SP 4
0[15]
比较分析,检测多态位点, 划分单倍型, 测定单倍型
多样度。基于 Kimura 双参数法估算遗传距离, 应
用 MEGA 4. 0[ 16]、PAUP * 4. 0b8[ 17] 和 M rBayes
3
0[ 18]进行系统发育分析, 以鼹形鼠为外群构建亲
缘关系树,自引导( bo otst rap)检验估计系统树中结
点的置信度(重复次数为 1000次)。
1. 5
系统发育树构建
利用 MEGA 4. 0软件, 基于 Kimura 双参数法
估算遗传距离,以鼹形鼠为外群应用邻接法( NJ)构
建亲缘关系树,自引( boo tst rap)检验估计系统树中
结点的置信度(重复次数为 1000次) ,其他采用默认
数值。
695
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报 第 19卷
用 ML 方法构建系统发育关系时, 采用 MOD-
ELT EST 3. 06
[ 19]检验确定数据集在何种模型和参
数下产生最高的似然率, 选择适合目前序列数据的
最佳 DNA 替换进化模型。在 PAUP* 4. 0b8 软件
中根据选定的模型和参数构建 ML 树。
采用 MrBayes 3. 0B4软件来进行数据的贝叶斯
分析[ 20]。贝叶斯分析中所用的核苷酸序列进化模型
与 ML 方法中使用的模型相同,而且允许不同基因数
据有不同的进化速率。贝叶斯分析都以随机种子树
进行搜索,在默认热值( heating values)条件下用 4条
马尔可夫链(M arkov chains)同时进行 2
106 代的循
环运算。每隔 1000代进行样本抽样, 通过检验似然
值是否趋于稳定,确定将要被忽略的树的数量( burn
in period) ,剩下的树将用于一致性分析。
2
结果与分析
2. 1
序列变异分析
将扩增出的 4种鼢鼠线粒体 D-loop 序列片断,
重复 2次,挑取比较稳定的扩增产物,双向测序。所
测定的序列片段大小为 630 bp, 根据鼹形鼠序列及
密码子特征确定其位置, 共扩增出 tRNA-T hr 和
tRNA-Pro 完整序列及 D- loop 5
端 630 bp。ND4
基因序列片段大小为 727 bp, 其位于 ND4 基因 3

端 1054 ~ 1780 bp 的位置。经人工和 Chromas
( V1. 45)校对,确认变异位点。
对比分析截去 tRNA-Thr 和 tRNA-Pro, 选取
起始于 D- loop的 5
端 414~ 424 bp大小的片段, 其
中有 179个可变位点, 含 123个简约信息位点, 56
个单碱基可变位点, 有效信息位点为 358。23只个
体定义了 15 个单倍型, 变异类型丰富, 有缺失、插
入、转换、颠换。其中转换 34, 颠换 25,转颠换比为
1. 4, 所发现的单倍型已提交到 GenBank, 登录号为
EF570420-EF570432;选取起始于 ND4基因 3
端,
将 17条序列对比,得 425~ 438 bp大小不等的同源
序列。其中有 183个可变位点, 含 101个简约信息
位点, 59 个单碱基可变位点, 有效信息位点为 160。
17只个体定义了 15个单倍型,变异类型丰富, 有插
入、转换、颠换。其中转换 38, 颠换 13,转颠换比为
3. 0, 所发现的单倍型已提交到 GenBank。
2. 2
遗传距离分析
基于 D-loop序列的 Kimura双参数模型得出的
遗传距离表明: 所采集的甘肃鼢鼠 3个地理种群, 天
祝种群与合水种群遗传距离最小,而与临洮种群遗
传距离最大为 0. 11(表 1)。
表 1
基于 D-loop序列 Kimura 2-parameter模型的
甘肃鼢鼠 3 个地理群体之间的遗传距离
Table 1
Genetic distance bet ween three populations
o f Gansu pro vince based on D- loop sequences
and K imura 2- parameter model
甘肃鼢鼠种群
Population of M. cansus
临洮群体
Lint ao population
天祝群体
T ianzhu population
临洮群体 L lintao populat ion
天祝群体 T ianzhu population 0. 11
合水群体 Heshui populat ion 0. 08 0. 07


4种鼢鼠之间的遗传距离为: 高原鼢鼠与秦岭
鼢鼠之间遗传距离最大( 0. 25) , 而与斯氏鼢鼠之间
最小( 0. 16) (表 2)。
表 2
基于 D-loop序列 Kimura 2-parameter模型的
4 种鼢鼠种间的遗传距离
T able 2
Genetic distance between four species
o f Gansu pro vience based on D- loop sequences
and K imura 2- parameter model
物种
Species
甘肃鼢鼠
M. cansu s
高原鼢鼠
M. bail ey i
秦岭鼢鼠
M. ru f e sc en
甘肃鼢鼠 M. cansus
高原鼢鼠 M. bail eyi 0. 19
秦岭鼢鼠 M. ru f e sc en 0. 22 0. 25
斯氏鼢鼠 M. smi th 0. 18 0. 16 0. 23
2. 3
系统发育树构建分析
以鼹形鼠为外群, 基于 D-loop 和 ND4序列,进
行系统发育和遗传距离分析,分别构建了 NJ树、BI
树和 ML 树, 都得到了相同的拓扑结构(图 1) , 系统
发育树显示:甘肃鼢鼠、高原鼢鼠、斯氏鼢鼠、秦岭鼢
鼠均各自构成单系,其中甘肃鼢鼠最为原始,单独构
成一枝,其 3个地理群体, 得到 3 个稳定的分支, 分
别与采集的地理种群相吻合(图 1-A )。高原鼢鼠与
斯氏鼢鼠为姐妹群,支持率均很高,处于较进化的位
置,后与秦岭鼢鼠聚在一起构成另一枝(图 1)。
3
讨论
3. 1
序列变异分析
线粒体 DNA 具有进化速率快、缺少重组、严格
的母系遗传、基因组小、易于测序和分析等特点, 其
中 D-loop (控制区)是 mtDNA 上的一段非编码区,
所受选择压力小, 在进化过程中积累了较多变异,被
认为是线粒体基因组上进化最快的部分。编码蛋白
的ND 4基因(脱氢酶第四亚基)进化速率适中, 两
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第 4期 苏军虎等:从线粒体序列分异探讨鼢鼠凸颅亚属( E osp alax)种间差异的有效性
图 1
基于 D-loop ( A)和 ND4 (B) 序列 Kimura 双参数模型的 4 种鼢鼠 NJ/ BI/ ML树
F ig . 1
Molecular phy lo genetic trees based on D- loop ( A) and ND4 ( B) sequences constr ucted by NJ/ BI/ ML methods
注:不同的序号表示采集的标本号
Note: Num ber mean s sam ples
number
者作为有效的分子标记在系统发育、分子进化领域
得到了广泛的应用[ 6]。依据序列分析, D- loop 序列
中有 134个可变位点, 含 110个简约信息位点, 56
个单碱基可变位点, 有效信息位点为 358。单倍型
多样度( Hd)为 0. 941
0. 340, 变异类型丰富; 而
ND4基因序列, 有 183个可变位点, 含 101 个简约
信息位点, 59个单碱基可变位点,有效信息位点为
160。单倍型多样度( Hd)为 0. 980
0. 024。表明
凸颅鼢鼠遗传多样性丰富, 这也与啮齿动物的繁殖
率高、个体小、种群大、世代间隔短积累了较多的突
变相一致[ 21] ,符合啮齿动物线粒体变异大的现象。
尽管鼢鼠是终年独居地下掘土的啮齿类, 迁移能力
有限,选择压力小,但地下稳定的环境保留了较多的
突变[ 22] 。此外,丰富的遗传变异与其自身的生物学
特性有关:甘肃鼢鼠的种群数量主要受降雨量和气
温的影响[ 21] ,其主要分布在农田等气温比较适宜的
地带,食物来源丰富,导致繁殖率增高, 数量上升, 使
得它们保留了较多的突变; 而单倍型多样度与群体
之间基因交流有关,对甘肃鼢鼠同一采样地区不同
单倍型与不同采样地区的单倍型比较显示, 不同地
理来源的单倍型之间存在较大的区别, 这可能是鼢
鼠的遗传分化与地理距离成正相关有关[ 22] 。也与
鼢鼠受着河流、荒漠以及温度的影响和食物条件的
限制而成规律分布有关[ 23] 。
3. 2
物种分类地位
本研究结果表明,在甘肃鼢鼠不同群体之间, 其
遗传距离在 0. 07~ 0. 11( D-loop)之间, 明显小于种
间的0. 16~ 0. 25( D-loop)和 0. 13~ 0. 19( ND4) [ 24]。
在建立的分子系统进化树中, 甘肃鼢鼠、高原鼢鼠、
斯氏鼢鼠、秦岭鼢鼠均各自构成单系,其中甘肃鼢鼠
最为原始,高原鼢鼠与斯氏鼢鼠为姐妹群,处于较进
化的位置,后与秦岭鼢鼠聚在一起,本研究中 4个物
种均为有效种。樊乃昌等[ 2] 对所搜集的分布于甘
肃、宁夏、青海、陕西、四川等地凸颅鼢鼠诸种标本进
行了整理,对甘肃鼢鼠、高原鼢鼠的分类地位进行了
订正。李华[ 10] 将凸颅鼢鼠亚属鼢鼠分为 6个种,认
为本亚属鼢鼠的二额顶嵴在中线处合并 (斯氏鼢
鼠) ,二额顶嵴在中线处极靠近(秦岭鼢鼠、高原鼢
鼠)、二额顶嵴在中线处不合并(中华鼢鼠、甘肃鼢
鼠、罗氏鼢鼠)的分类特征稳定。王廷正等[ 25] 首次
报道了甘肃鼢鼠和秦岭鼢鼠的染色体组型和 C 带
带型,发现 2种鼢鼠在染色体组型及 C 带带型上均
有一定差异,认为甘肃鼢鼠、秦岭鼢鼠和中华鼢鼠是
凸颅鼢鼠亚属的 3个独立种。Wu等[ 5] 用目镜测微
尺分别测量和计算其 5个部位毛发的毛髓质指数,
结果表明甘肃鼢鼠与中华鼢鼠除胡须髓质指数无显
著性差异外,其他部位及各部位综合均有显著差异,
研究结果支持甘肃鼢鼠、高原鼢鼠、秦岭鼢鼠各自独
立为种的观点。本研究首次从分子水平支持该 4个
物种为独立种的观点。
凸颅亚属鼢鼠仅分布于我国, 甘肃地区是多种
凸颅鼢鼠的模式标本产地,对其进行分子系统学研
究,扩充分子遗传学数据,有助于进行鼢鼠亚科动物
697
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的系统学分类和起源进化研究 [ 8]。本研究采集了甘
肃境内所有分布地的鼢鼠, 构建了凸颅亚属鼢鼠的
系统发育树, 结合化石和地质学资料 [ 26~ 28] , 推测甘
肃鼢鼠是鼢鼠亚科动物祖先种从起源中心扩散到黄
土高原的后裔, 而斯氏鼢鼠、秦岭鼢鼠和高原鼢鼠是
甘肃鼢鼠在演化过程中适应寒冷气候而分化出的物
种,代表着向西部演化的一枝。本研究支持高原鼢
鼠和斯氏鼢鼠有较近的亲缘关系,且比甘肃鼢鼠和
秦岭鼢鼠的关系都近,处于较进化的位置,甘肃鼢鼠
最先分化出来。这与李晓晨等[ 4] 基于化石、形态特
征和地理区系等所建立的演化途径基本一致。
4
小结
4. 1
鼢鼠亚科动物mtDNA D-loop, ND4序列变异类
型丰富,单倍型多样度高,与自身的生物学特性有关。
4. 2
4种鼢鼠种间遗传距离大于种内遗传距离; 分
子系统树显示: 甘肃鼢鼠、高原鼢鼠、斯氏鼢鼠、秦岭
鼢鼠均各自构成单系,并构成 2个进化枝,其中甘肃
鼢鼠最为原始, 单独构成一枝;高原鼢鼠与斯氏鼢鼠
为姐妹群,处于较进化的位置,后与秦岭鼢鼠聚在一
起构成另一枝, 4种鼢鼠均为独立种。
4. 3
结合化石和地质学资料,推测甘肃鼢鼠是鼢鼠
的祖先种从起源中心扩散到黄土高原的后裔, 秦岭
鼢鼠、斯氏鼢鼠和高原鼢鼠是甘肃鼢鼠在演化过程
中适应寒冷气候而分化出的物种。
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邵新庆)
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