全 文 ：塞隆骨原动物高原鼢鼠核基因 t{≥ µ• ‘„
序列测定与分析
曹 晖t o刘玉萍t o张绍来u o周开亚v
kt1 中国中医研究院 中药研究所 o北京 tsszss ~
u1 中国北京同仁堂集团公司 北京同仁堂药酒厂 o北京 tsttw| ~
v1 南京师范大学 遗传资源研究所 o江苏 南京 utss|zl
≈摘要  目的 }测定仓鼠科动物高原鼢鼠 Μψοσπαλαξ βαιλεψι的核µ⁄‘„基因序列 o为塞隆骨正品基原检定提供
分子依据 ∀方法 }采用 °≤ • 直接测序技术测定高原鼢鼠 t{≥ µ• ‘„ 基因核苷酸序列并作序列特征分析 ∀结果 }高
原 鼢鼠的 t{ ≥µ• ‘„序列长度为 t{xt¥³ ∀根据排序比较 o高原鼢鼠与 u种鼠科动物间的 ⁄‘„序列同源性
为 zu qsw h ∗ zu qt{ h ∀结论 }通过基因序列分析 o⁄‘„测序技术可成为塞隆骨正品基原检定的准确有效手段 ∀
≈关键词  塞隆骨 ~高原鼢鼠 ~t{≥ µ• ‘„基因 ~⁄‘„测序
≈中图分类号  • u{u qzws qv ≈文献标识码  … ≈文章编号  tsst2xvsukusstlsu2ss|s2sx
我国 {s年代中期发现青藏高原地区治疗风湿
性疾病的藏药塞隆骨k为哺乳动物啮齿目仓鼠科高
原鼢鼠 Μψοσπαλαξ βαιλεψι ׫²°¤¶的干燥骨骼≈t l
是目前较理想的虎骨代用品≈u  ∀t||s年/塞隆骨药
材及塞隆风湿酒0获得卫生部颁发的中药一类新药
证书 ot||x年塞隆风湿酒在北京同仁堂药酒厂投入
正式生产 ∀但是北京同仁堂药酒厂在收购塞隆骨
时 o发现商品中有其它动物骨骼混淆的现象 ∀而现
有的鉴别方法准确性 !实用性差k如外观鉴别要求全
架骨骼 o操作困难较大l o专属性不强k如理化质控指
标仅作总骨蛋白质含量 !总磷量等测定l o因此 o塞隆
骨品质评价方法尚需进一步改进和完善 ∀
现代分子生物技术的迅猛发展 o尤其是古运行
骨骼及化石标本 ⁄‘„ 微量提取技术和聚合酶链反
应技术k°≤ • l的发明 o使 ⁄‘„ 测序技术k⁄‘„ ¶¨2
∏´¨ ±¦¬±ªl在中药材品质鉴别等领域具有广阔的应
用前景 ∀由于 ⁄‘„ 是生物的遗传信息载体 o所以
分析结果不受环境因素 !样品形态k无论原品 !粉状
或片状l和材料来源的影响 o同时测序方法还具有重
复性好 !灵敏度高的优点 ∀
目前用于动物类 ⁄‘„ 测序的基因主要是线粒
≈收稿日期  usss2sw2sx
≈基金项目  北京市自然科学基金资助课题kz|{usu{l
体 ⁄‘„k°·⁄‘„l的 ¦¼·2¥和 tu≥ µ• ‘„ 基因 o°·⁄2
‘„具有快速进化 !缺少重组以及严格的母系遗传
等特点 o是鉴定动物种有效的遗传标记 kª¨ ±¨ ·¬¦
°¤µ®¨ µl ∀许多学者已将 °·⁄‘„ 测序方法应用于
动物类中药如蛇类药材≈v ow  !海马类药材≈x  !鹿类药
材≈y oz  !龟甲与鳖甲类药材≈{ ∗ ts  !鸡内金类药材≈tt  !
紫河车≈tu 等的真伪鉴别中 ∀但是 °·⁄‘„ 属单拷
贝基因 o序列重排事件频繁 o增加了分析难度 ∀而
µ• ‘„是编码核糖体 ⁄‘„的基因 o以连续排列方式
存在所有生物细胞内 o含量达 {s h ∀它作为高度重
复串联序列 o包含进化速率不等的编码区 !非编码转
录区和转录区 o并由 t{≥ ox q{≥和 uy≥ µ• ‘„组成一
个转录单位 ∀其中 t{≥ µ• ‘„ 基因序列长度较保
守 o约 t {ss ¥³o由于协同进化k¦²±¦¨µ·¨§ √¨²¯∏·¬²±l
关系使该序列片断在核基因组不同拷贝间趋于相
近 o而这种大量的重复序列正可用来弥补由于中药
材的加工和储藏所导致的 ⁄‘„降解的缺陷 ∀
本文用 °≤ • 直接测序技术对高原鼢鼠的 t{≥
µ• ‘„基因进行测序并分析其序列特征 o试图通过
⁄‘„分子标记技术来探讨塞隆骨药材的真伪鉴别
方法 o增加其正品基原检验的科学性和准确性 ∀
1 材料与方法
111 样品
本实验所用高原鼢鼠动物于 t||{年 z月捕自
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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青海 o学名经北京同仁堂药酒厂张绍来鉴定 ∀
112 试剂
°≥…2∞⁄× „ 液 }tws ° °²¯ # pt ‘¤≤¯ou qz °
°²¯#pt Ž≤¯o{ qt ° °²¯#p t ‘¤u ‹°’w ot qx ° °²¯#
pt Ž‹u°’w ox qw ° °²¯#p t ∞⁄× „k³‹ z qsl ∀
×∞‘提取缓冲液 }tss ° °²¯#p t ×µ¬¶2‹≤ k¯³‹
{ qsl ows ° °²¯ #pt ∞⁄× „k³‹ z qsl ouxs ° °²¯ #
pt ‘¤≤¯∀
×∞缓冲液 }ts ° °²¯#p t ×µ¬¶2‹≤ k¯³‹ { qsl ot
° °²¯#pt ∞⁄× „k³‹ { qsl ∀
°≤ • 试 剂 } §‘×°¶k §× „° o §× Š° o §× ≤° o
§× ×°l oΤαθ⁄‘„聚合酶 ot¬Ταθ缓冲液kts ° °²¯
#p t ×µ¬¶2‹≤ k¯³‹ { qvl oxs ° °²¯#p t Ž≤¯ot qx °
°²¯ # pt  ª≤ u¯ os qst h 明胶l ∀为 ° µ¨®¬±2∞¯ ° µ¨r
≤ ·¨∏¶公司产品 ∀
t¬×…∞电泳缓冲液 }{| ° °²¯ #pt ×µ¬¶2硼酸
盐 o{| ° °²¯ # pt硼酸 ou ° °²¯ # pt ∞⁄× „ k³‹
{ qsl ∀
§r§§‘×° 混和试剂 }§‘×°≥ o§§‘×°≥ o×µ¬¶2
‹≤ k¯³‹ | qxl o ª≤ u¯ o‘²±¬§¨·°2ws o吐温2us ou2巯基
乙醇 o耐热焦磷酸酶 o测序酶等成分 ∀为 „ ° µ¨¶«¤°
公司产品 ∀
终止缓冲液 }去离子甲酰胺 o∞⁄× „k³‹ { qsl o
品红或二甲苯蓝k„ ° µ¨¶«¤°l ∀
⁄‘„ 长度标记物 }¯ ¤°¥§¤ Ηινδ ¶和 t ®¥
⁄‘„ ¤¯§§¨µ∀为 °«¤µ°¤¦¬¤公司产品 ∀
113 引物设计
t{≥ µ• ‘„基因 °≤ • 扩增的通用引物据 ≥²ª¬±
设计的序列≈tv 合成 ∀
t{≥ƒ }x. 2≤ „„≤≤ × ŠŠ× × Š„× ≤≤ × Š≤≤ „Š×2v.
t{≥• }x. 2≤ × Š„× ≤≤ × × ≤ × Š≤ „ŠŠ× × ≤ „≤≤ × „≤2v.
由于 t{≥ µ• ‘„基因长度为 t q{ ®¥左右 o利用
单个引物进行一次 °≤ • 测序反应无法测得此区段
全部序列 o因此我们还根据 • «¬·¨ 等设计的内引
物≈tw 合成了 v 对荧光测序引物 t{≥ƒt ot{≥• t o
t{≥ƒu ot{≥• u和 t{≥ƒv ot{≥• v进行双向测序 o°≤ •
扩增及测序引物的相关位置和方向见图 t ∀
图 t t{≥ µ• ‘„基因扩增及测序引物位置及方向
方框为编码区 o箭头示核苷酸链合成方向及相关位置
114 总 ⁄‘„制备
实验样品经酒精消毒和蒸馏水洗净后 o切取动
物尾巴皮毛组织少许在乳钵中用液氮冷却粉碎成细
粉 ∀采用 °≥…微量提取法分离总基因组 ⁄‘„ ∀取
uss °ª细粉加入 v倍 °…≥2∞⁄× „液洗 v次 o于台式
离心机以 |sss ª离心 x °¬±∀离心脱钙等杂质后 o
残渣加 v倍 ×∞‘提取缓冲液 os qv倍 ts h十二烷基
骨氨酸钠及 u Λ¯ xs °ª# °¯ p t蛋白酶 Žo在台式调温
振荡器中于 vz ε 振荡保温反应 tu «o以 x sss ªts
°¬±离心后上清液加入 s qx倍酚2氯仿2异戊醇kuxΒ
uwΒtl于离心机上以 | sss ª离心 x °¬±∀取上清液
加 s qt倍ts h 十六烷基三甲基溴化铵k≤ × „…l和
s qt倍 x °²¯#pt‘¤≤¯o室温下放置 ts °¬±o再用氯
仿2异戊醇kuwΒtl提取 t次 ∀取上清液加 s qt倍 v
°²¯#pt‘¤’„¦和 u qx倍冰乙醇于 p us ε 放置 u «
后以 ts sss ª离心 tx °¬±∀倾去上清液 o粗 ⁄‘„
沉淀用适量双蒸水溶解后 o加入 t °ª# °p t • ‘„
酶于 vz ε 保温 vs °¬±o然后加等量酚2氯仿ktΒtl混
匀提取 t次 o| sss ª离心 x °¬±o吸出上清液用冰乙
醇沉淀法沉淀 ⁄‘„ ∀ ⁄‘„ 沉淀用 yx h和 {x h乙
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯ quy o‘²qu
ƒ ¥¨qousst
醇各洗 u次 o然后于 ys ε 烤箱中干燥 vs °¬±∀加入
xs Λ¯ ×∞缓冲液溶解 ⁄‘„ o存于 p us ε 备用 ∀
115 °≤ • 扩增反应及产物检测
取 xs ∗ tss ±ª⁄‘„作模板 o加入 §‘×°¶各 uss
Λ°²¯#pt o引物各 s qux Λ°²¯#p t ot qx ˜ Ταθ ⁄‘„
聚合酶及 t¬Ταθ 缓冲液使最终反应体积为 xs Λ¯ o
覆盖几滴矿物油后置于 °× ≤2tss型 °≤ • 仪中k美
国  • ¶¨¨¤µ¦«公司l o按下述参数进行 °≤ • 反应 }
|w ε ov °¬±~yx ε o{ °¬±ot个循环 ∀|w ε ows ¶~yx
ε o{ °¬±ovx个循环 ∀zu ε ovs °¬±ot个循环 ∀
取 °≤ • 反应液 x Λ¯ 于 t qs h琼脂糖凝胶上用
s qx¬×…∞电泳缓冲液于 …¬²2• ¤§电泳仪中电泳 o∞…
染色 o˜ ∂ 灯光下照相 ∀
116 °≤ • 产物的纯化
°≤ • 扩增产物用 ±„ ∏´¬¦®×  °∏µ¬©¬¦¤·¬²± Ž¬·
k德国 ±¬¤ª¨ ±公司l按试剂盒操作手册进行 o纯化后
直接用于测序循环反应 ∀
117 测序反应
利用双脱氧末端终止法测序 o按 ׫¨ µ°² ≥¤´ ∏¨2
±¤¶¨ ×  ≤¼¦¯¨ ≥¨´ ∏¨ ±¦¬±ª Ž¬·k英国 „ ° µ¨¶«¤° ¬©¨
≥¦¬¨±¦¨ 公司l实验指南操作 ∀测序反应分 w管 o每
管反应体积为 y qzx Λ¯ o内含 t qx Λ¯ 纯化的 °≤ • 产
物 os qux ³°²¯#p t荧光测序引物 ot qx Λ¯ §r§§‘×°
混合试剂 o于 °≤ • 仪进行测序反应 }|x ε ox °¬±ot
个循环 ∀|x ε ovs ¶~xs ε ovs ¶~zs ε ot °¬±ows个
循环 ∀测序反应结束后加 w Λ¯ 终止缓冲液离心混
匀 ∀点样于 z °²¯ #p t尿素 p w h聚丙烯酰胺测序
胶在 „…Œ vzz 型 ⁄‘„ 自动测序仪k美国 „³³¯¬¨§
…¬²¶¼¶·¨°¶公司l进行测序 ∀
118 序列分析
所测正反向单链序列经测序仪序列阅读软件及
人工校阅后 o采用 „∏·²„¶¶¨¥¥¯ µ¨× 程序kt1v1s 版
本 o美国 „³³¯¬¨§…¬²¶¼¶·¨°¶公司l进行 ⁄‘„双向排
序 o并以手工适当调整以减少空位kª¤³l数目 ∀排好
的序列运用 Š ±¨¨ ·¼¬2≥∂ r• 软件kts1t 版本 o日本
≥²©·º¤µ¨ ⁄¨ √¨¯²³° ±¨·公司l进行 ⁄‘„ 序列同源性
比较及其特征分析 ∀
2 结果与讨论
在本研究中 o高原鼢鼠的干燥骨骼标本材料用
我们改进的 °≥…微量提取法到总基因组 ⁄‘„ o其分
子长度在 uv qt ®¥左右k图 ul ∀ °≤ • 扩增能得到预
期 t q{ ®¥的双链产物k图 vl ∀我们同时采用一个
⁄‘„微量提取试剂盒 ⁄‘¨¤¶¼×  ׬¶¶∏¨ Ž¬·k德国
±¬¤ª¨ ±公司l进行比较实验 o所提总 ⁄‘„ 及 °≤ •
扩增结果非常一致 ∀
图 u 高原鼢鼠 ⁄‘„提取电泳图谱
t q°≥…微量提取法 u q±¬¤ª¨ ±微量提取试剂盒法
 q¯¤°¥§¤ Ηινδ ¶分子标记物
图 v 高原鼢鼠 t{≥ µ• ‘„基因 °≤ • 扩增电泳图谱
t ou q°≥…微量提取法 v ow q±¬¤ª¨ ±微量提取试剂盒法
 qt®¥ ⁄‘„ ¤¯§§¨µ分子标记物
高原鼢鼠样本的 t{≥ µ• ‘„基因的核苷酸序列
经过 v对测序引物双向测序及计算机程序排列 o其
长度为 t {xt ¥³k图 wl ∀另外我们从国际基因库
kŠ ±¨…¤±®l检索到 u种易混动物即鼠科小家鼠 Μυσ
µ υσχυλυσk登录号 ÷ssy{yl和褐家鼠 Ραττυσ νορϖεγι
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2¦∏¶k登录号  ttt{{l的t{ ≥µ• ‘„基因 o前者
长度 t {y| ¥³o后者 t |us ¥³∀根据这 v种动物 t{≥
µ• ‘„基因排序比较 o高原鼢鼠与小家鼠和褐家鼠
同源性 zu qsw h ∗ zu qt{ h o其保守区在 t sus ∗ t
xs|号核苷酸位置 ∀
图 w 高原鼢鼠 t{≥ µ• ‘„基因核苷酸序列
x. ψ v.方向 o方框内为引物区
在我国的啮齿类骨骼中 o易与高原鼢鼠骨骼相
混淆的有甘肃鼢鼠 Μ. χανσυσ!罗氏鼢鼠 Μ. ροτη2
σχηιλδι !黑唇鼠兔 Οχατονα χυρζονιαε 等≈tx  ∀在确定
高原鼢鼠的 t{≥ µ• ‘„基因序列是否可作为一种鉴
别塞隆骨的 ⁄‘„ 分子标记之前 o还需要做以下两
方面的研究工作 ∀一是再测定 w ∗ x只高原鼢鼠的
t{≥ µ• ‘„基因序列 o检验不同个体间的序列差异
程度 ∀二是对易与高原鼢鼠相混淆的各种鼠类的骨
骼进行测序研究 o查明它们的 t{≥ µ• ‘„ 基因序列
与高原鼢鼠的序列间的差异 ∀因此 o本文只是试图
在 ⁄‘„分子水平解决塞隆骨药材真伪鉴别问题的
第一步 ∀
≈参考文献 
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≈z  ‹¤¼¤¶«¬°²·² „ o ‘¬¶«¬°∏µ¤ ‘oŽ²¥∏¶¨±¼¤ ≠ o ·¨¤¯ qo≥·∏§¬¨¶²±
0¶¬ª±¤¯0 ≤²±¶·¬·∏¨ ±·¶©²µ∞√¤¯∏¤·¬²± ²© „±¬°¤¯ ≤µ∏§¨ ⁄µ∏ª¶qŒ∂ q
„³³¯¬¦¤·¬²± ²© ⁄‘„ „±¤¯¼·¬¦¤¯ × ¦¨«±¬´∏¨ ·² ±∏¤¯¬·¼ ∞√¤¯∏¤·¬²± ²©
 §¨¬¦¬±¨ ¶≤²±·¤¬±¬±ª „±¬°¤¯ ≤µ∏§¨ ⁄µ∏ª¶q ‘¤·∏µ¤¯  §¨ot||{ o
xuktl }v{1
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°≤ • 鉴定研究 1 药学学报 ot||| ovwktul }|wt1
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≈tt  王建云 o王 文 o宿 兵 o等 1⁄‘„序列分析技术鉴定鸡内金的
方法学研究 1 中国药科大学学报 ot||y ouzk{l }wzt1
≈tu  熊丽娟 o王建云 o易建文 1⁄‘„ 序列测定鉴定紫河车 1 中国药
学杂志 ot||z ovuk增刊l }wt1
≈tv  Œ±±¬¶  o Š¨¯©¤±§ ⁄o ≥±¬±®¶®¼ o ·¨¤¯ q §¨¶q °≤ • °µ²·²¦²¯¶} „
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≈tx  寿振黄 1 中国经济动物志 1 兽类 1 北京 }科学出版社 o
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Νυχλεαρ Ριβοσοµ αλ Ρ ΝΑ Σµ αλλ Συβυνιτ (t{Σ ρΡ ΝΑ) Νυχλεοτιδε Σεθυενχινγ
ανδ Χηαραχτεριζατιον οφ Σαιλονγγυ( Ωηολε Βονε οφ Μψοσπαλαξ βαιλεψι Τηοµ ασ)
≤„’ ‹∏¬t oŒ˜ ≠∏2³¬±ªt o ‹ „‘Š ≥«¤²2¯ ¤¬u o ‹ ’ ˜ Ž¤¬2¼¤v
kt qŒ±¶·¬·∏·¨ ²© ≤«¬±¨ ¶¨ ¤·¨µ¬¤  §¨¬¦¤o≤«¬±¤ „¦¤§¨ °¼ ²© ×µ¤§¬·¬²±¤¯ ≤¬±¨ ¶¨  §¨¬¦¬±¨ o
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[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε: ≥¨´ ∏¨ ±¦¬±ª ·«¨ ±∏¦¯ ¤¨µµ¬¥²¶²°¤¯ • ‘„ ¶°¤¯¯ ¶∏¥∏±¬·kt{≥ µ• ‘„l ª¨ ±¨ ²©
Μψοσπαλαξ βαιλεψι k≤µ¬¦¨·¬§¤¨ l ·² §¨ √¨¯²³¤± ∏¯·¬°¤·¨ ¤±§§¨©¬±¬·¬√¨ ° ¤¨±¶©²µ²µ¬ª¬±¬§¨ ±·¬©¬¦¤·¬²± ²© ª¨ ±∏¬±¨
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º¤¶¤°³¯¬©¬¨§¥¼ °≤ • ∏¶¬±ª¤¦²±¶¨±¶∏¶³µ¬° µ¨¶¨·¤±§¬·¶±∏¦¯¨ ²·¬§¨ ¶¨ ∏´¨ ±¦¨ º¤¶§¨·¨µ°¬±¨ §¥¼ °≤ • §¬µ¨¦·¶¨2
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• ∂ µ¨¶¬²± ts qt q Ρεσυλτσ: ׫¨ ±¨·¬µ¨ t{≥ µ• ‘„ ª¨ ±¨ µ¨ª¬²± ²© Μ. βαιλεψι ¶³¤±±¨ §t{xt ¥³¬± ¯¨ ±ª·«q „ 2¯
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∏³¶·µ¨¤° ²©x. 2 ±¨§oº«¬¦«¦²∏§³µ²√¬§¨ ¤±²√¨¯ ¬±©²µ°¤·¬²±©²µ°²¯ ¦¨∏¯¤µµ¨¦²ª±¬·¬²± ²©≥¤¬¯²±ªª∏qΧονχλυσιον :
⁄‘„ ¶¨ ∏´¨ ±¦¬±ª¦²∏¯§¥¨ ¤∏¶¨©∏¯ ¤±§µ¨ ¬¯¤¥¯¨·²²¯ ¬±·«¨ ²µ¬ª¬±¬§¨ ±·¬©¬¦¤·¬²± ²©ª¨ ±∏¬±¨ ≥¤¬¯²±ªª∏q
[ Κεψ ωορδσ] ≥¤¬¯²±ªª∏~ Μψοσπαλαξ βαιλεψι ~t{≥ µ• ‘„ ª¨ ±¨ ~⁄‘„ ¶¨ ∏´¨ ±¦¬±ª
≈责任编辑 袁桂京 
本刊已加入5中国学术期刊k光盘版l6和中国期刊网 !万方数据k≤«¬±¤Œ±©²l系统科技期刊群等 o来稿一
经刊用 o本刊即拥有其在上述及所有媒介再次发表的权利 o作者如不同意可作声明 ∀作者著作权使用费与本
刊稿酬将在我刊刊用后一次性给付 o并赠样刊 t本 o单行页若干份 ∀
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