全 文 ：第 19 卷
第 5 期

Vol. 19
No. 5
草
地
学
报
ACTA AGRESTIA SINICA



2011 年
9 月

Sep.

2011
多花黑麦草根际解磷菌的分离及解磷能力测定
韩玉竹1, 2 , 赵建军1 , 曾
兵1, 明晓燕1 , 朱全伟1
( 1.西南大学荣昌校区, 重庆 荣昌
402460; 2.西南大学资源环境学院, 重庆 北碚
400700)
摘要:选用 PKO(无机培养基)和蒙金娜有机培养基, 从多花黑麦草( L olium multif lorum L. )根际分离出41株具有
溶磷能力的菌株,利用溶磷圈法和钼蓝比色法对其溶磷能力进行测定, 其中 13 株具有溶解无机磷能力 ,其 D/ d 值
(溶磷圈直径与菌落直径比值)在 1. 13~ 4 之间,用钼蓝比色法测定有效磷增量为 15. 6~ 557. 2 mg
L - 1。28 株在
蒙金娜有机磷培养基上形成明显透明圈,其 D/ d 值在 1. 13~ 16. 4 之间, 有效磷增量分别为 52~ 341. 6 mg
L - 1。
经解磷能力分析, b9, b13, f5 菌株具有较强的解无机磷能力, D/ d 值为 2. 75, 4, 2. 5, 对无机磷的溶磷量为 545,
557
2, 567. 4 mg
L - 1 ;溶解有机磷能力较强的菌株有 2 株( B1和 B3) , D/ d 值分别为 11 和 16. 4,对有机磷的溶磷
量均为 341. 6 mg
L- 1, 这些菌株在后续微生物菌肥研制中具有较大潜力; pH 与解无机磷菌株的溶磷量有显著的
负相关性,而与解有机磷菌株的溶磷量没有显著相关性,这可能与微生物解有机、无机磷的机理不同有关。
关键词:多花黑麦草; 根际;解磷菌; 解磷能力
中图分类号: S154



文献标识码: A




文章编号: 1007-0435( 2011) 05-0766-05
Isolation and the Phosphate Solubilizing Capacity of Italian Ryegrass
Rhizosphere Phosphate-Solubilizing Microorganism
HAN Yu- zhu1, 2 , ZHAO Jian- jun1 , ZENG Bing1 , M IN G Xiao-yan1 , ZHU Quan-w ei1
( 1. Department of An imal S cien ce, Rong chang Campu s of Southw es t University, Rongchan g, Ch on ghqing 402460, China;
2. Col leg e of Resource and Enviroment , S outhw est University, Beibei, Ch on gqing 400700, China)
Abstract: Phosphate-so lubilizing micr oorg anisms w ere isolated f rom Italian ryegr ass r hizo spheres using
PKO inorg anic and Mengjinna org anic culture media. The phosphate solubilizing capacit ies w ere investig a-
ted f rom 41 st rains based on phosphate-solubilizing circle and the molybdenum blue method. Among them,
13 st rains had an ability to solubilize inorg anic phosphate and D/ d ( diameter of phosphate-dissolv ing zone/
diameter of bacter ial clone) value w as f rom 1. 13 to 4; and 28 str ains had an ability to solubilize org anic
phosphate on M engjinna organic culture medium and D/ d value w as f rom 1. 13 to 16. 4. In liquid cultur e,
the available pho sphate increment w as detected using mo lybdenum blue method from 15. 6 mg
L- 1 to
557. 2 mg
L- 1 by inorganic phosphate-solubilizing microorganism and from 52 mg
L- 1 to 341. 6 mg
L- 1 by
org anic pho sphate-solubilizing bacter ia. St rains b9, b13 and f5 had a significant ly higher ability of inorg anic
phosphate-solubilizing than others did. St rains B1 and B3 had a higher ability of or ganic phosphate-disso-l
v ing show ing great potent ial for agricultural use in micr obio logical fer tilizer and deser ve fur ther study.
There w as a signif icant corr elat ion betw een the phosphate solubilizing capacity of inor ganic phosphate dis-
solving micro org anism and the pH of medium , w hereas there w as no such co rrelat ion fo r org anic pho sphate
dissolving bacteria.
Key words: Italian ryegrass; Rhizosphere; Phosphate-solubilizing micr oorg anism ; Phosphate dissolv ing
ability


磷是植物营养中的 3大要素之一, 又是植物体
内有机化合物的重要组成成分,对其生长发育都起
着不可忽视的作用。土壤中的磷素主要以磷灰石、
磷酸钙和有机磷的形式存在,植物难以吸收利用[ 1]。
土壤与植物根际中存在着大量的溶磷菌,包括细菌、
放线菌和真菌 [ 2]。解磷菌能够将植物难以吸收利用
收稿日期: 2010-10-27;修回日期: 2011- 02-20
基金项目:重庆市科技攻关计划重大项目( 2008AA1020) ;西南大学青苗基金( 08QMr09) ; 西南大学荣昌校区动物营养重点学科建设基金
资助
作者简介:韩玉竹( 1982- ) ,女,山西绛县人,博士研究生,讲师,主要从事农业微生物与草业科学方面的研究, E-mail: hyz_gs@ 163. com
第 5期 韩玉竹等:多花黑麦草根际解磷菌的分离及解磷能力测定
的难溶性或不溶性磷转化为可利用的形态, 提高土
壤中磷素的利用效率,减少化学肥料的施用量,降低
农业投入成本, 对环境进行微生物修复,提高作物产
量,是解决土壤磷素缺乏的重要途径之一 [ 3, 4] 。
溶磷菌的研究也一直受到植物学、微生物学以及
农学等不同领域学者的重视,并进行了大量的溶磷菌
接种研究[ 5]。由于不同种类的溶磷菌或同种不同菌
株之间的溶磷能力都有明显的差异, 所以筛选出具有
高效溶磷能力的菌株显得尤为重要。本研究以多花
黑麦草根际土壤为研究对象,对多花黑麦草根际解磷
细菌进行了分离, 测定了各菌株的解磷能力, 筛选出
具有较强解磷能力的菌株,并对其溶磷特性及机理进
行测定和探索,以期为后续研制多花黑麦草根际溶磷
菌肥提供高效稳定的菌种及基础资料。
1
材料与方法
1. 1
土样的采集与解磷细菌的分离
选择重庆市荣昌县不同肥力不同品种的多花黑
麦草( Lolium multi f lorum L. )草地, 其品种为特高、
长江2号、沃土。采用 5点取样法, 采样时铲去表土,
深挖 10~ 20 cm,将多花黑麦草根系及黏附其上的根
际土壤一同装入无菌袋中,注明采集地点、日期、土样
号,取回,立即进行解磷细菌的分离筛选[ 6, 7]。
1. 2
解磷菌培养基的成分
解无机磷微生物分离培养基( PKO 培养基) : 葡
萄糖 10. 0 g, ( NH 4 ) 2 SO4 0. 5 g, N aCl 0. 3 g, KC1
0. 3 g, M gSO 4 0. 3 g, FeSO4 0. 03 g , M nSO4 1. 0 g ,
Ca3 ( PO 4 ) 2 5. 0 g ,水 1000 mL, Agar 15 g。
解有机磷微生物分离培养基(蒙金娜有机培养
基) :蛋白胨10. 0 g,牛肉膏 3. 0 g, NaCl 5. 0 g, Agar
15 g ,水 1000 mL, pH 7. 0。将配制的培养基分装灭
菌,试验用时每 50 mL 加入新鲜蛋黄液 3 mL(蛋黄
液与 0. 9%生理盐水等比例配制)。
1. 3
解磷菌的分离
利用解无机磷微生物分离培养基和解有机磷微
生物分离培养基进行分离与纯化。称取混合土样
10 g,置于已灭菌的研钵内, 加入少量无菌水, 研磨
后放入装有 90 mL 已灭菌的 0. 85% NaCl溶液的
250 mL 三角瓶中, 振荡 10 min, 制成土壤悬浮液。
用 1 mL 微量加样器从中吸取 1 mL 土壤悬液注入
盛有 9 mL 0. 85%无菌 NaCl溶液的试管中, 充分混
匀, 再从此试管中吸取 1 mL, 注入另一盛有 9 mL
0. 85%无菌 NaCl溶液的试管中, 以此类推, 制成土
壤含量( g ) 与 NaCl 溶液 ( mL) 比例依次为 10- 3 ,
10- 4 , 10- 5 , 3种稀释度的土壤溶液, 涂布, 并作好标
记。
1. 4
解磷菌的形态特征观察
用接种环取上述分离到的纯分离物以平板划线
法分别将其培养于 PKO(无机培养基)和蒙金娜有
机培养基上, 置于 28
培养箱中培养 24~ 48 h, 观
察并记录菌落形状、大小、高度、透明度、色素等。
1. 5
解磷菌的解磷能力测定
1. 5. 1
定性测定
采用溶磷圈法对溶磷菌的溶磷性能进行定性测
试。将分离获得的纯菌株分别点接种于蒙金娜有机
培养基和 PKO 无机培养基上,置于 28
培养箱中
培养 5 d时观察, 观察有无溶磷圈, 并根据溶磷圈
直径( D)与菌落直径( d)的比值( D/ d)初步确定菌株
解磷能力。将有溶磷作用的分离物接种于斜面培养
基上保存备用 [ 8, 9]。
1. 5. 2
定量测定
利用钼蓝比色法测定培养液中的有效含磷量,
进行溶磷能力强弱的测定。将在上述步骤中获得的
有溶磷作用的透明圈菌株制备成悬浮液, 取 1 mL
菌株的悬浮液接种于 50 mL 无机和有机液体培养
基中(对照则接种无活菌液) ,每一菌株设 5次重复,
以基础培养基(不接种菌株)为对照。置于摇床上培
养 10 d 之后在 4
下离心 ( 10000 r
min- 1 ) 15
min, 取上清液用钼酸铵比色法测定有效磷的含量
(扣除对照后的值/ mg
L - 1 )。
计算公式如下: P= K
V/ V 1
其中: P 为有效磷增量; K为从标准曲线查得显
色液的磷含量( mg
L- 1 ) ; V 为显色时溶液定容的体
积( mL) ; V 1为显色时吸取上清液的体积( mL) [ 8,9] 。
1. 6
菌株培养液 pH值变化测定
用酸度计测定培养 10 d后的各菌株培养液 pH
值变化情况。
2
结果与分析
2. 1
多花黑麦草根际解磷菌分布
利用 LB, PKO和蒙金娜培养基从多花黑麦草
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根际共分离获得 41株具有解磷能力的菌株, 解无
机磷菌有 13株,其中细菌 8株、真菌 3株、放线菌 2
株,解有机磷菌有 28株, 均为细菌。
2. 2
多花黑麦草根际解磷菌菌落特征
多花黑麦草根际解磷细菌除 b4 和 B12 菌株
外,其余菌株都是革兰氏阴性杆菌, 无芽孢; 大多数
菌落颜色呈乳白色或黄色, 菌落圆形, 边缘整齐, 表
面湿润光滑,不透明或半透明,隆起或扁平。少数呈
现粉红色; 形状不规则, 中凹的隆起;绝大多数菌落
生长速度较快, 在 12 h 后即可观察到生长; 另有部
分生长速度中等, 24 h后可观察到生长。分离到的
3株真菌 f5和 f14为青霉属( Penicil l ium sp. ) , 另
一株 f2 待定, 菌落小型、扁平、乳白色、边缘整齐。
放线菌 4株, 3株小型、1株中型,圆形, 乳白色、乳黄
色到黄色,边缘整齐或有皱褶。分离所得的 41株溶
磷菌在 PKO培养基与蒙金娜有机培养基上都没有
产生色素。
2. 3
多花黑麦草根际解磷菌的溶磷特性
2. 3. 1
解无机磷菌株的定性测定
由表 1可知, 13株解无机磷菌株在培养 5 d后在
PKO固体平板上产生了不同程度大小的溶磷圈,其
直径位于0. 3~ 4. 9 cm之间,其中溶无机磷真菌( f2,
f5, f14)的溶磷圈直径均较大, 为 1. 4, 4. 5, 4. 9 cm,细
菌为 0. 45~ 1 cm,放线菌为 0. 25~ 0. 6 cm; D/ d值(溶
磷圈直径与菌落直径比值)在 1. 13~ 4之间[ 8, 9] , 6株
解无机磷菌 b1, b4, b6, b9, b13, f5溶解无机磷的 D/ d
值大于 2. 00,溶磷效果较好;用钼蓝比色法测定有效
磷增量为 15. 6~ 557. 2 mg
L- 1 , b9, b13和 f5 的溶
磷量大于500 mg
L- 1 ,为 545, 557. 2, 567. 4 mg
L- 1
远高于其他解无机磷菌株( 15. 6~ 213. 62 mg
L- 1 ) ;
培养 10 d 后的各解无机磷菌株培养液 pH 值均有
所下降, 为 4. 71~ 6. 76。
表 1
解无机磷菌株的解磷能力测定数值
Table 1
Phosphate solubilizing capacity of Italian Ryeg rass rhizosphere inor ganic pho sphate- solubilizing micr oo rg anism
菌种号
St rain s number
溶磷圈直径
D/ cm
菌落直径
d/ cm
比值
D/ d
溶磷量/ mg
L- 1
Ph osphate solubil izat ion capacity
酸碱度
pH
b1 1 0. 25 4 147 5. 88
b4 0. 7 0. 45 2. 5 108. 6 5. 90
b6 0. 5 0. 2 2. 5 213. 62 5. 67
b7 0. 55 0. 4 1. 38 120. 8 4. 97
b8 0. 5 0. 4 1. 25 60 5. 42
b9 0. 55 0. 2 2. 75 545 4. 96
b13 1 0. 25 4 557. 2 4. 71
b15 0. 45 0. 4 1. 13 86. 4 5. 64
f2 1. 4 0. 9 1. 56 80. 2 5. 82
f5 4. 5 1. 8 2. 5 567. 4 5. 82
f14 4. 9 3. 5 1. 4 141. 4 5. 82
a3 0. 25 0. 15 1. 56 120. 8 5. 88
a12 0. 6 0. 5 1. 2 15. 6 6. 76


注:小写字母 b、f、a分别表示细菌、真菌、放线菌
Note: b-bacteria; f-fungi; a- actin omycete
2. 3. 2
解有机磷菌株的解磷能力测定
由表 2可知, 28株解有机磷菌株培养 5 d 后在
蒙金娜有机磷培养基上均能形成明显透明圈, 其直
径位于 0. 7~ 4. 2 cm之间; D/ d值(溶磷圈直径与菌
落直径比值)在 1. 13~ 16. 4之间, 除 B4和 B17外,
其他解有机磷菌菌株 D/ d 均大于 3,其中 B1 和 B3
的 D/ d值> 10,分别为 11和 16. 4;用钼蓝比色法测
定有效磷增量为 52~ 341. 6 mg
L - 1 , 其中菌株
B1, B3对有机磷的溶磷强度均为 341. 6 mg
L - 1 ,
远远高于其他解无机磷菌株 52~ 264. 2 mg
L - 1 ;
培养 10 d后, 蒙金娜有机磷液体培养基 pH 为 5. 91
~ 8
16, 10株解有机磷菌株的 pH 值呈酸性, 18 株
呈碱性。
2. 4
解磷菌溶磷能力指标的相关性分析
本试验中,解无机磷菌株 13 株和解有机磷菌
株 28株的溶磷圈直径与溶磷量的相关分析表明,
溶磷圈直径与菌落直径均与溶磷量没有显著的相
关性; D/ d与溶磷量均有显著相关性,解无机磷菌
株 D/ d与溶磷量相关性达到显著水平( P< 0. 05) ,
与解有机磷菌株达到极显著水平( P< 0. 01) ; pH
与解无机磷菌株的溶磷量有显著的负相关性( P<
0
05) ,而与解有机磷菌菌株的溶磷量没有显著相
关性。
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第 5期 韩玉竹等:多花黑麦草根际解磷菌的分离及解磷能力测定
表 2
解有机磷菌株的解磷能力测定数值
Table 2
Phosphate so lubilizing capacit y of I talian Ryegr ass rhizo sphere o rg anic phosphate- so lubilizing bacter ia
菌种号
St rain s number
溶磷圈直径
D/ cm
菌落直径
d/ cm
比值
D/ d
溶磷量/ mg
L- 1
Ph osphate solubil izat ion capacity
酸碱度
pH
B1 1. 1 0. 1 11 341. 6 7. 37
B2 0. 77 0. 083 9. 28 155 7. 25
B3 0. 82 0. 05 16. 4 341. 6 7. 35
B4 0. 83 0. 32 1. 13 104. 6 7. 54
B5 0. 3 0. 3 3. 33 84. 4 7. 37
B6 1. 05 0. 23 4. 57 118. 6 7. 96
B7 1. 3 0. 32 4. 06 52 5. 91
B8 1. 3 0. 4 3. 25 173. 2 7. 81
B9 1. 23 0. 23 5. 35 157 7. 84
B10 1. 65 0. 4 4. 13 209. 6 6. 43
B11 1. 5 0. 3 5 264. 2 6. 94
B12 1. 2 0. 3 4 70. 2 6. 22
B13 2. 2 0. 4 5. 5 173. 2 7. 89
B14 4. 2 1. 2 3. 5 155 8. 16
B15 0. 7 0. 18 3. 89 74. 2 6. 89
B16 2 0. 6 3. 33 138. 8 6. 44
B17 0. 8 0. 3 2. 67 72. 2 6. 44
B18 4. 6 1 4. 6 205. 6 8. 31
B19 1. 4 0. 3 4. 67 88. 4 8. 29
B20 1 0. 3 3. 33 96. 4 8. 13
B21 0. 9 0. 25 3. 6 264. 2 7. 72
B22 1. 3 0. 27 4. 81 134. 8 8. 13
B23 0. 95 0. 28 3. 39 76. 2 6. 47
B24 0. 8 0. 2 4 219. 8 8. 06
B25 1. 8 0. 4 4. 5 70. 2 7. 90
B26 4 1 4 236 8. 20
B27 1. 5 0. 45 3. 33 52 6. 07
B28 1. 5 0. 5 3 151 6. 42


注:大写字母 B表示细菌
Note: B-bacteria


因此,研究认为 D/ d值与溶磷量均有显著相关
性,可作为表征溶磷菌相对溶磷能力的指标, 用于初
步确定菌株的溶磷能力。但溶磷圈直径的大小与溶
磷量没有显著的相关性, 而且试验中,具有较强解有
机磷能力的菌株 ( B1, B3) , 虽然溶磷圈直径不大
( 0
82, 1. 1 cm ) , 但 D/ d值却相对较大 ( 11, 16. 4) ,
溶磷量也相对较高( 341. 6 mg
L- 1 ) , 故溶磷圈直
径的大小作为解磷菌解磷能力的恒定指标有待商
榷。pH 与解无机磷菌株的溶磷量有显著的负相关
性, 而与解有机磷菌菌株的溶磷量没有显著相关性,
这可能与微生物解有机、无机磷的机理不同有关。
培养介质的 pH 能作为衡量解无机磷菌解磷能力强
弱的指标,但不能作为衡量解有机磷菌解磷能力强
弱的指标。
表 3
溶磷圈、D/ d值及 pH值与溶磷量的相关系数
T able 3
Cor relation between diameter of phosphate-dissolving zone, D/ d, pH and available pho sphate increment
解磷能力测定指标








Phosphate-dis solving capabil it y indexes








溶磷圈直径
D/ cm
菌落直径
d/ cm
比值
D/ d
酸碱度
pH
与解无机磷菌株溶磷量的相关系数 Correlat ion 0. 302 0. 044 0. 621* - 0. 554*
与解有机磷菌株溶磷量的相关系数 Correlat ion 0. 178 - 0. 014 0. 631** 0. 294


注: * 显著水平( P < 0. 05) , ** 极显著水平( P < 0. 01)
Note: * Sign ificant diff erence at the 0. 05 probab ilit y level , ** S ignif icant dif feren ce at the 0. 01 probabilit y level
3
讨论
解磷微生物的种类繁多, 解磷机制不尽相同且
很复杂, 深入研究解磷菌施于土壤后的活动规律和
消长动态以及解磷作用的发挥条件, 可以更好地挖
掘微生物的解磷潜能。通过开发高效微生物肥料,
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对减少化学肥料的使用、提高土壤中有效磷的含量、
改善土壤环境及降低环境污染具有积极作用 [ 10]。
多花黑麦草是我国南方畜牧业发展的主要牧
草,尤其是在重庆地区表现出极强的适应能力和极
高的生产性能。本试验从多花黑麦草根际土壤中筛
选出 41株具有解磷能力的细菌,采用溶磷圈法和钼
蓝比色法,对菌株的解磷能力进行了研究,获得具有
较强解无机磷能力的细菌 2株和真菌 1 株, 具有较
强解有机磷能力的细菌 2株。关于高效溶磷菌株的
解磷机制和在土壤中的活动规律有待于今后进一步
研究。
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邵新庆)
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子已达 1. 0以上,并进入到中国科技期刊 CSCD影响因子 300名排行表。据 2010年版中国学术期刊影响因
子年报, 2009年本刊总被引频次为 3798,复合影响因子为 1. 535。双月刊,大 16开 A4版本,内文 120页,国
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