全 文 ：第 17 卷
第 2 期

Vol. 17
No . 2
草
地
学
报
ACTA AGRESTIA SINICA



2009 年
3 月

Mar .

2009
SRAP分子标记在假俭草杂交后代
真实性鉴定中的应用
郑轶琦1 , 宗俊勤2 , 薛丹丹1 , 陈
宣2, 刘建秀2*
( 1. 南京农业大学园艺学院,中国 南京
210095; 2. 江苏省中科院植物所,中国 南京
210014)
摘要:以假俭草( Eremochloa op hiur oides ( Munro) H ack)两个杂交组合的 4 个亲本( E022、E142、E102、E092( 1) )及
其杂交后代为材料,从 400 对 SRAP 引物组合中筛选出具有父本特征带的引物, 选取其中带型稳定、清晰的引物组
合进行杂种真实性鉴定。结果表明: ( 1) A( E102
E092( 1) )组合的两个亲本间具有父本特征带的引物组合共有 51
对, B( E142
E022)组合的两个亲本间具有父本特征带的引物组合共有 87 对。( 2)应用 6 对 SRAP引物( 303、297、
283、180、332 和 358)对 A( E102
E092( 1) )组合进行杂种真实性鉴定,其中真杂种数目为 89 个; 应用 4 对 SRAP
引物( 18、199、221 和 288)对 B( E142
E022)组合的杂交后代进行真实性鉴定, 其中真杂种的数目是 83 个。上述
鉴定的假俭草真杂种可以用于构建假俭草遗传连锁图谱及重要性状的 QT L 定位等研究。
关键词:假俭草; 杂种鉴定; SRAP 标记;父本特征带
中图分类号: S336






文献标识码: A





文章编号: 1007
0435( 2009) 02
0135
06
Application of SRAP Markers to the Identif ication of
Eremochloa ophiuroides (Munro) Hack Hybrids
ZHENG Yi
qi1, 2 , ZONG Jun
qin2 , XU E Dan
dan1, 2 , CHEN Xuan2 , LIU Jian
x iu2*
( 1. College of H ort icultur e, Nanjin g Agricultural University, Nanjing, Jiangsu Province 210095, China;
2. Ins t itu te of Botany, Jian gsu Pr ovin ce an d Ch ines e Academy of Sciences, Nanjing, Jiangsu Provin ce 210014, China)
Abstract: The hybr ids status fr om tw o hybr idizat ion combinat ions of E remochloa op hiur oides ( M unr o)
Hack w ith four parents ( E022, E142, E102, E092( 1) ) w ere tested using SRAP primer combinat ions w ith
clear and stabilized paternal character ist ic bands selected from 400 primer combinat ions. T he results show:
( 1) 51 primer combinations w ith paternal char acteristic bands w er e selected in A ( E102
E092( 1) ) and 87
primer combinat ions w ere selected in B ( E142
E022) . ( 2) Six primer combinat ions ( 303, 297, 283, 180,
332 and 358) w ere used to ident ify the hybrids status in A ( E102
E092( 1) ) and of w hich, 89 w ere true
hybr ids. Four primer combinat ions ( 18, 199, 221 and 288) w ere used to ident ify the hybrids status in B
( E142
E022) and of w hich, 83 w ere t rue hybrids. T hese tr ue hybrids could be useful in the genet ic link

age map const ruct ion and QT L mapping of important characters.
Key words: Eremochloa ophiuroides ( M unro ) Hack; Hybrid ident ificat ion; SRAP markers, Paternal char

acteristic band


假俭草 ( Er emochloa ophiuroides ( M unr o )
Hack)隶属于禾本科蜈蚣草属 ( E remochloa) , 是该
属中唯一用作草坪草的一种多年生草种。该草以耐
瘠薄、病虫害少及养护水平低而著称,可广泛用于公
共绿地、运动场草坪、水土保持和公路边坡草坪的建
植。假俭草为二倍体,其染色体数目为 2n = 18, 能
够进行正常的有性繁殖[ 1~ 3]。目前市场上商业化的
假俭草品种大多来自美国,这些品种主要是通过系统
收稿日期: 2008
05
28; 修回日期: 2008
09
08
基金项目:国家自然科学基金( 30670200)资助
作者简介:郑轶琦( 1977
) ,女,河南洛阳市人,讲师,博士研究生, 研究方向为假俭草种质资源及遗传育种, E
mail: botanyzyq@ yahoo.
com . cn; * 通讯作者 Author for cor resp ond ence, E
mail: turfunit@ yah oo. com. cn
草
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报 第 17卷
选育、杂交育种及诱变育种选育而出[ 4~ 6] 。尽管我
国拥有丰富的假俭草种质资源,但由于起步较晚, 假
俭草的品种选育研究落后于美国。充分利用我国丰
富的假俭草种质资源, 培育拥有自主知识产权的假
俭草新品种是我国草坪业可持续发展的一个重要方
向。
杂交育种有利于综合双亲的优良性状, 可以针
对目标性状进行有目的的育种, 是植物育种中常用
的方法。假俭草虽具有自交不亲和性, 但也存在一
定程度的自交, 其自交结实率为0
58% [ 3] ,所以有必
要对假俭草的杂交后代进行真实性鉴定。传统的杂
交后代鉴定方法多是基于形态鉴定,该方法要求鉴
定者具有丰富的经验, 而且幼苗期很难区分其真假
杂种。为缩短育种周期, 随着分子生物学的发展, 许
多分子标记技术应用于杂交后代的真实性鉴定, 如
同工酶 [ 7, 8]、RAPD[ 8 ~ 13]、SSR[ 13~ 15]、ISSR [ 11~ 13]、
AFLP[ 16, 17] 等,均表明分子标记技术在进行杂种鉴
定方面具有快速、准确等优点。
SRAP 标记 ( sequence
related amplif ied po ly

morphism,序列相关扩增多态性)是 2001 年由 Li
和 Quiro s[ 18]开发的一种基于 PCR 的新型分子标记
技术。该标记具有操作简便、快速,多态性丰富, 重
复性好,不需预知物种序列信息以及成本较低等优
点,目前已广泛应用于遗传图谱构建、基因定位及
QTL 分析[ 19~ 24] 、遗传多样性分析[ 25~ 29]、品种鉴
定[ 30, 31]、杂种优势预测[ 32, 33]、比较基因组学[34]等诸多
领域。目前尚未有SRAP标记在杂种后代真实性鉴定
方面的相关报道,在草坪草的研究方面也很少[ 29~ 37]。
本研究以假俭草的 4份代表性种源为亲本, 制
定了两个杂交组合, 应用 SRAP 标记对 4个亲本进
行多态性筛选, 得到亲本间的多态性 SRA P 标记,
并从中选取父本的特征标记对杂种进行真实性鉴
定,鉴定得到的真杂种可以用于构建假俭草遗传图
谱、重要性状的 QT L 定位等研究。
1
材料与方法
1. 1
供试材料
F1 杂交后代来自于两个杂交组合 A ( E102

E092( 1) )和 B( E142
E022) , 其中 A( E102
E092
( 1) )组合有 96份杂交后代( A1~ A96) , B( E142

E022)组合有 87份杂交后代( B1~ B87)。杂交后代
和亲本均种植于江苏省中科院植物研究所草坪草种
植资源圃(表 1)。
表 1
亲本及其来源
Table 1
Sources o f par ents
亲本


Par ent


来源
S ou rce
经度
Longitude
纬度
Lat itude
E022 江苏无锡 Wuxi, Jiangsu Province 120
20
30
20

E142 安徽霍邱 H uoqiu, Anhui Province 116
06
31
45

E092( 1) 重庆渝北 Yubei, Chongqing 106
33
29
32

E102 美国佐治亚州 Georgia, USA


1. 2
基因组 DNA提取
以假俭草的幼叶为材料, 采用 CTAB 法提取基
因组 DNA, 并用 0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA
的质量和浓度。最后将样品浓度稀释至 50 ng/
l,
置于- 20
冰箱保存。
1. 3
SRAP 分析
SRAP 引物采用 Li 等[ 18] 、Lin 等 [ 22] 及 Riaz
等[ 2 7]发表的引物序列,随机选取 20 条正向引物及
20条反向引物, 两两组合成 400对 SRAP 引物组
合,对 4个亲本进行 SRA P 引物组合的父本特征带
筛选,引物序列及 SRAP 引物组合序号分别见表 2、
3。PCR反应体系包括: 2
l 10
PCR buffer、60 ng
模板 DNA、Mg2+ 1. 50 mmol
L- 1、dNT P260
mo l

L- 1、引物 0. 25
mol
L - 1、Taq DNA 聚合酶
0. 5U, 总体积为 20
l。PCR扩增程序为: 94
预变
性 4 min; 94
变性 1 min, 37
退火 1 m in, 72
延
伸 10 s, 5个循环; 94
变性 1 m in, 50
退火1 min,
72
延伸 10 s, 35个循环; 循环结束后 72
延伸 7
m in, 4
保存, 扩增反应在英国 TECHNE 公司的
T C
412型 PCR 仪上进行。扩增产物用 10%聚丙
烯酰胺凝胶分离, 快速银染检测。
1. 4
杂种鉴定
参照 Hulya[ 12] 的方法, 从上述筛选得到的具有
父本特征带的引物组合对两个杂交组合的 F1 代逐
一进行筛选,具有父本特征带的杂种鉴定为真杂种,
反之则为假杂种。
2
结果与分析
2. 1
具有父本特征带的 SRAP 引物筛选
应用分子标记技术对杂种后代进行真实性鉴定
的研究中,一般是选择具有父本特征带(父本有带,
而母本缺失)的引物对供试杂种后代进行鉴定, 具有
父本特征带的后代为真杂种,父本特征带缺失的被
认为是母本的自交后代, 即假杂种 [ 12] 。所以本研究
136
第 2期 郑轶琦等: SRAP 分子标记在假俭草杂交后代真实性鉴定中的应用
表 2
SRAP 引物序列
Table 2
Pr imer sequences used for SRAP analy sis
编号
Code
正向引物
Forw ard prim er
编号

Code

反向引物
Reverse prim er
Me 1 5

TGAGTCCAAACCGGAT A
3
Em 1 5

GACTGCGT ACGAAT T CAA
3

Me 2 5

T GAGT CCAAACCGGAGC
3
Em 2 5

GACT GCGT ACGAATT CT G
3

Me 3 5

TGAGTCCAAACCGGACC
3
Em 3 5

GACTGCGT ACGAAT T GAC
3

Me 4 5

T GAGT CCAAACCGGACA
3
Em 4 5

GACTGCGTACGAAT TT GA
3

Me 5 5

T GAGT CCAAACCGGTGC
3
Em 5 5

GACTGCGT ACGAAT T AAC
3

Me 6 5

TGAGTCCAAACCGGAGA
3
Em 6 5

GACTGCGT ACGAAT T GCA
3

Me 7 5

T GAGT CCAAACCGGACG
3
Em 7 5

GACTGCGTACGAAT TGAG
3

Me 8 5

TGAGTCCAAACCGGAAA
3
Em 8 5

GACT GCGTACGAAT TGCC
3

Me 9 5

T GAGT CCAAACCGGAAC
3
Em 9 5

GACT GCGT ACGAATT TCA
3

Me 10 5

TGAGTCCAAACCGGAAT
3
Em 10 5

GACT GCGT ACGAATT CAT
3

Me 11 5

TGAGTCCAAACCGGAAG
3
Em 11 5

GACTGCGTACGAAT TAAT
3

Me12 5

TGAGT CCAAACCGGT AG
3
Em 12 5

GACT GCGT ACGAATT TGC
3

Me13 5

T GAGT CCAAACCGGTT G
3
Em 13 5

GACTGCGT ACGAAT T CGA
3

Me14 5

T GAGT CCAAACCGGTGT
3
Em 14 5

GACTGCGTACGAAT TAT G
3

Me 15 5

T GAGT CCAAACCGGTCA
3
Em 15 5

GACTGCGT ACGAAT T AGC
3

Me 16 5

T GAGT CCAAACCGGGAC
3
Em 16 5

GACTGCGT ACGAAT T ACG
3

Me17 5

TGAGT CCAAACCGGGT A
3
Em 17 5

GACTGCGTACGAAT TT AG
3

Me18 5

T GAGT CCAAACCGGGGT
3
Em 18 5

GACT GCGT ACGAATT TCG
3

Me 19 5

T GAGT CCAAACCGGCAG
3
Em 19 5

GACT GCGT ACGAATT GTC
3

Me 20 5

T GAGT CCAAACCGGCAT
3
Em 20 5

GACTGCGT ACGAAT T GGT
3

表 3
待筛选的 400对 SRAP 引物组合
Table 3
T he 400 SRAP primer combinations selected in the study
Me1 Me2 M e3 Me4 Me5 M e6 Me7 Me8 Me9 Me10 M e11 Me12 Me13 M e14 Me15 Me16 M e17 Me18 Me19 M e20
Em1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Em2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
Em3 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60
Em4 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80
Em5 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100
Em6 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120
Em7 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140
Em8 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160
Em9 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180
Em10 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200
Em11 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220
Em12 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240
Em13 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258 259 260
Em14 261 262 263 264 265 266 267 268 269 270 271 272 273 274 275 276 277 278 279 280
Em15 281 282 283 284 285 286 287 288 289 290 291 292 293 294 295 296 297 298 299 300
Em16 301 302 303 304 305 306 307 308 309 310 311 312 313 314 315 316 317 318 319 320
Em17 321 322 323 324 325 326 327 328 329 330 331 332 333 334 335 336 337 338 339 340
Em18 341 342 343 344 345 346 347 348 349 350 351 352 353 354 355 356 357 358 359 360
Em19 361 362 363 364 365 366 367 368 369 370 371 372 373 374 375 376 377 378 379 380
Em20 381 382 383 384 385 386 387 388 389 390 391 392 393 394 395 396 397 398 399 400
应用上述 400 对 SRAP 引物组合对两个杂交组合
的 4 个亲本进行了分析, 结果表明: ( 1) 在筛选的
400对引物中, A( E102
E092( 1) )组合的两个亲本
间具有父本特征带的引物组合共有 51对,占总数的
12. 75%, 分别是 22、25、27、32、35、39、46、51、52、
61、74、83、94、110、115、126、144、156、159、162、174、
180、185、193、199、203、206、214、218、225、234、235、
253、261、273、274、283、299、302、303、321、322、333、
356、358、364、371、380、381、387、395; ( 2)在 B( E142

E022)组合的两个亲本间具有父本特征带的引物
组合共有 87 对, 占总数的 21. 75% ,分别是 15、16、
17、18、20、21、23、25、42、46、50、51、52、63、64、72、
137
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报 第 17卷
78、80、81、86、94、119、121、125、126、133、137、141、
146、158、160、164、172、177、178、179、184、185、199、
201、204、205、206、216、221、227、234、236、239、241、
252、257、261、266、271、274、279、288、290、294、297、
299、302、306、312、315、320、322、325、327、334、336、
338、339、343、349、354、356、357、358、359、371、375、
386、389、392、397,部分扩增结果见图 1。上述具有
父本特征带的 SRAP 引物组合可以用于下一步的
杂种真实性鉴定。
2. 2
杂种真实性鉴定
从上述筛选得到的具有父本特征带的多态性引
物组合中选取扩增带型清晰、稳定的引物组合分别
对两个杂交组合的杂种后代进行真实性鉴定, 鉴定
结果如下: ( 1)在杂交组合 A ( E102
E092( 1) )中共
应用 6对 SRAP 引物对后代进行了真实性鉴定, 所
用引物分别是 303 ( Me3 + Em16)、297 ( M e17 +
Em15)、283( M e3+ Em15)、180( M e20+ Em9)、332
( M e12+ Em17)和 358( Me18+ Em18) ,其父本特征
带的大小分别是 108 bp( 303)、281 bp( 297)、227 bp
( 283)、164 bp( 180)、100 bp( 332)和 123 bp( 358) ,
该组合的真杂种数目为 89个, 假杂种为 7个,其中
A3、A6、A39、A50、A54、A67、A76为假杂种, 其余
均为真杂种; ( 2)在杂交组合 B( E142
E022)中共
应用 4 对 SRAP 引物对杂交后代进行了真实性鉴
定,所用引物分别是 18( Me18+ Em1) , 199( M e19+
M e10) , 221( M e1+ Em12)和 288( Me8+ Em15) ,其
父本特征带的大小分别是 169 bp 和 233 bp( 18)、
152 bp( 199)、126 bp( 221)和 173 bp( 288) ,真杂种
的数目是 83个, 假杂种为 4 个, 即 B16、B42、B50、
B61。鉴定结果参见图 1、2和表 4。
图 1
四个亲本的引物筛选结果
Fig. 1
P rimer selection r esults o f the four parents
注: M :DNA Mar ker; 181, 184, 185, 186, 17分别为表 4编号对应的引物组合;每个引物组合的试验材料从左
至又依次为 E
022、E
142、E102、E
092( 1) ;箭头所指为父本特征带
Note: M : DNA Maker; 181, 184, 185, 186, and 17 repres ents the number of the primer com bination s ( s ee table 4) , respect ively;
the experimen tal material of each prim er combinat ion is E
022, E
142, E102, an d E
092( 1)
fr om left t o righ t, respect ively; the arrow s in dicate th e paternal characterist ic bands
图 2
283 号引物在 A( E102
E092(1) )组合的双亲及部分杂种后代的 SRAP扩增结果
F ig. 2
SRAP amplification result of the parents and partial F1 hybr ids of A ( E102
E092( 1) ) by the primer combinations 283
注: M : DNA Marker;箭头所指为父本特征带
Note: M : DNA Mak er; the arrow indicates th e paternal characterist ic band
138
第 2期 郑轶琦等: SRAP 分子标记在假俭草杂交后代真实性鉴定中的应用
表 4
两个杂交组合的杂种鉴定结果
Table 4
Hybr id identification r esult s o f two hybridized combinations
杂交组合(
 )
H ybridiz ed combin at ion
引物组合
Primer combinat ion
未鉴定出的杂种后代
H ybrid progen ies that couldn
t be ident ified
A ( E102
E 092( 1) ) 303 A2, A3, A4, A6, A7, A8, A13, A14, A15, A20, A23, A24, A26, A27, A29, A30, A31, A32,
A36, A37, A38, A39, A41, A44, A46, A47, A48, A49, A50, A52, A53, A54, A55, A56, A60,
A61, A63, A65, A67, A69, A72, A73, A76, A78, A79, A80, A81, A82, A88, A89, A95, A96
297 A2, A3, A6, A7, A8, A13, A14, A15, A20, A23, A24, A26, A27, A29, A30, A31, A32, A36,
A37, A38, A39, A41, A44, A47, A48, A49, A50, A52, A54, A61, A63, A67, A76, A80
283 A2, A3, A6, A8, A14, A20, A26, A27, A29, A30, A31, A32, A36, A37, A38, A39, A48, A50,
A52, A54, A61, A63, A67, A76180A2, A3, A6, A8, A29, A39, A50, A52, A54, A63, A67,
A76332A3, A6, A8, A39, A50, A54, A63, A67, A76
358 A3, A6, A39, A50, A54, A67, A76
B ( E142
E022) 18 B1, B2, B3, B5, B6, B7, B12, B16, B30, B37, B38, B39, B42, B49, B50, B51, B56, B57, B61,
B67, B68, B69, B74, B77, B78, B80, B81, B83, B84, B87
199 B1, B2, B3, B6, B7, B12, B16, B30, B39, B42, B50, B51, B56, B57, B61, B67, B68, B77, B78,
B80, B84, B87
221 B16, B42, B50, B61, B68, B80
288 B16, B42, B50, B61
3
讨论与结论
本研究中, 杂交组合( E102
E092( 1) )的供试
杂交后代为 96 个, 鉴定出的真杂种为 89 个, 占
92. 7%;杂交组合 B( E142
E022)的供试杂交后代
为 87个, 鉴定出的真杂种为 83 个, 占 95. 4%。假
俭草属于高度杂合的自交不亲和植物, 尽管本研究
的杂种后代是通过控制杂交的方法得到的, 但仍存
在着少量的自交后代,即存在一定的自交结实率, 与
前人研究的结果一致[ 3] , 表明自交不亲和植物虽具
有自交不亲和性,但仍存在一定的自交结实现象,所
以在进行杂交育种工作中,仍要进行杂种真实性鉴定。
杂种真实性鉴定是杂交育种工作中的一个重要
环节,快速、准确地鉴定出真杂种是杂交育种工作的
重要前提和基础。DNA分子标记技术以其快速、准
确的优点近年来已广泛地应用于杂种真实性鉴定的
研究。目前杂种鉴定研究中应用最多的分子标记是
RAPD [ 8~ 13]标记,但该标记的重复性较差, 所以近年
来一 些新的 标记开 始应 用于 此类 研究, 如
SSR [ 13~ 15]、AFLP [ 16, 17] 等。SSR 标记具有多态性
高、重复性好、表现为共显性等优点,但由于假俭草
目前尚未开展基因组研究,还未开发特异性的 SSR
标记, 限制了此类标记在假俭草研究中的应用;
AFLP 虽具有多态性丰富, 一次可检测到大量多态
性位点等优点, 但该技术操作步骤繁琐, 对模板
DNA 质量及仪器设备的要求较高。SRAP 标记是
近年来新开发的一种分子标记, 目前尚未应用于杂
种真实性鉴定的研究, 该标记不需预知基因组序列
信息, 具有简便、快速、稳定、多态性丰富等优点,弥
补了上述分子标记的不足,本研究的结果表明该标
记适于进行杂种鉴定研究。
杂种鉴定研究多是基于单一分子标记鉴定的结
果, L iu等[ 13]应用 RAPD、ISSR和 SSR三种标记对
杂交后代进行了鉴定, 认为同时应用多种标记鉴定
比单一标记鉴定的结果更准确、可靠,所以还有必要
应用其他分子标记对本研究的杂种后代。
本研究首次应用 SRAP 分子标记技术对假俭
草的杂交后代进行了杂种真实性鉴定, 这些真杂种
可以用于构建假俭草的分子遗传图谱及定位重要性
状的 QTL,从而为假俭草的分子标记辅助育种研究
打下重要的基础。
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