全 文 ：文章编号: 1007-0435( 2004) 02-0095-03
诱变苜蓿愈伤组织抗寒性研究
李　波, 贾秀峰, 高美玲, 贲文伟
(齐齐哈尔大学生命科学与工程学院, 黑龙江 齐齐哈尔 161006)
摘要: 以 3 个苜蓿品种幼茎诱导产生的愈伤组织为材料, 用叠氮化钠进行诱变处理, 经- 7℃低温筛选后, 测定存活愈伤
组织的可溶性糖含量、过氧化物酶活性以及脯氨酸含量等生理生化指标。结果表明, 草原 2号、准格尔、龙牧 801 三个苜
蓿品种诱变处理后愈伤组织的抗寒性明显高于对照。
关键词: 生物技术; 苜蓿品种; 抗寒性; N aN 3; 诱变处理 ; 愈伤组织
中图分类号: Q813; S332. 5　　　　文献标识码: A
A Research on the Cold-Resistance of Induced Alfalfa Calluses
LI Bo, JIA Xiu-feng , GAO M ei-l ing , BEN Wen-w ei
( Colleg e of L ife Science and Eng ineering , Qiqihar Univ ersit y , Qiqihar , Heilong jiang Province 161006, China)
Abstract: T he stems from induced calluses of three alfalfa variet ies-Caoyuan No. 2, Neimeng Zhungeer , and
Longmu 801--were mutagenized w ith NaN 3 , and screened from mutants af ter culturing in a temperature of
- 7℃. T he liv ing calluses w ere then measured fo r their physio logical and biochemical characters, such as solu-
ble sugar content , per oxidase act ivity , and pr oline content , ect . The result show s that the three alfalfa v ariet ies
boast high cold-resistant capacity than the control.
Key words : Bio logical technique; A lfalfa variet ies; Cold-resistance; NaN 3; Mutagenize; Cal lus
　　利用组织培养方法筛选抗寒性突变体的早期研究
者是 Dix 等[ 1]。随后, Lazar 等在没有施用选择压的前
提下获得更抗寒的冬小麦体细胞无性系突变体[ 2]。
1992年张明鹏等利用逐步低温选择获得葡萄抗寒细
胞系[ 2]。1999年林定波等人对柑橘抗寒细胞变异体进
行筛选,再生植株抗寒性的增强是稳定的[ 2]。在苜蓿体
细胞抗寒变异体筛选方面, 报道尤为少见, 仅见由继红
等( 1996)利用 EMS 对苜蓿愈伤组织进行诱变, 获得
抗寒突变体[ 3]。由于苜蓿是严格的杂交植物,自交结实
率不到 1% ,通过基因重组进行改良十分困难。要进一
步改良品质, 提高质量,利用组织培养技术诱变育种是
有效手段,可以从中筛选出对人类有用的突变体,并育
成新品种。
1　材料和方法
1. 1　以黑龙江省畜牧研究所提供的内蒙准格尔苜蓿
(M edicago sat iva L. cv. Neimeng Zhungeer)、龙牧801
[M elilotoides r uthenicus ( L . ) So jak×M edicago S ativ a
L. cv. Longmu No . 801]、草原 2 号苜蓿 ( Medicago
var ia Mart in cv. Caoyuan No. 2)种子为试验材料。
1. 2　方法
选取子粒饱满、有光泽的准格尔、龙牧 801和草原
2号苜蓿种子,用 70%的酒精浸泡 30 s, 无菌水冲洗 3
～4次后,经 0. 1%升汞溶液消毒 5 min, 用无菌水冲
洗3～4次,除去升汞, 将种子植于 MS 固定培养基, 于
26±2℃ 的培养箱中培养一周后即可得到无菌幼苗。
将幼苗从培养基中取出,置于无菌滤纸上, 切成约
1 cm 的茎段,接种于MS 固体培养基( M S+ 0. 5 mg / L
6-BA+ 0. 5 mg / L 2, 4-D+ 30 g 蔗糖+ 0. 7%琼脂+
0. 25 mg/ L Vc, pH= 5. 8)中,于 25℃下培养, 漫射光
每日照射 12 h [ 4, 5]。
选取培养 20 d 白色、松脆的愈伤组织, 进行继代
培养,培养条件同上。
收稿日期: 2003-08-14; 修回日期: 2004-03-11
基金项目:黑龙江省教育委员会科研计划项目( 10511136)
作者简介:李波( 1962-) ,女,辽宁鞍山人,副教授,生物技术专业,发表论文 30余篇
第 12卷　第 2期
　Vo l. 12　　No. 2
草　地　学　报
ACT A AGRESTIA SIN ICA
　2004 年　6月
　June 　2004
1. 3　愈伤组织诱变处理
选取继代培养 2次的愈伤组织,挑选白色、新鲜、
松脆的部分,切成 5 mm 的小块, 转到含有 NaN 3 ( 400
mg / L )的液体培养基中,用转速为 120 rpm 的振荡器
悬浮振荡 1 h [ 6]。
1. 4　愈伤组织抗寒体筛选
诱变后的愈伤组织转到继代固体培养基中, 在
7℃、0℃条件下分别培养一周后, 放到- 7℃条件下培
养 2周。最后在常温下挑选存活的愈伤组织进行生理
生化指标测定。
1. 5　抗寒性突变体鉴定
1. 5. 1　过氧化物酶( POD)活力测定 　采用张志良的
方法对诱变处理和未处理的愈伤组织进行 POD 活性
的测定[ 7]。
1. 5. 2　可溶性糖含量测定　采用张志良的方法对诱变
处理和未处理的愈伤组织进行可溶性糖的测定[ 7]。
1. 5. 3　脯氨酸含量测定　对诱变处理和未处理的愈
伤组织采用 T roll 的酸性茚三酮显色法测定游离脯氨
酸含量。提纯和纯化脯氨酸时采用磺基水杨酸法浸提
样品中的游离脯氨酸[ 8]。
1. 5. 4　电导率测定　采用丁灿的方法对诱变处理和
未处理的愈伤组织进行电导率的测定 [ 9]。
2　结果与分析
2. 1　过氧化物酶( POD)活性测定
POD可以清除生物体内氧自由基,避免组织细胞
受到伤害的保护作用, 在生物抗逆境胁迫、抗衰老中起
很重要的作用 [ 8]。POD在细胞内含量的升高证明细胞
在逆境中的活力越强。由表1可以看出, POD活性在 3
个苜蓿品种中处理和对照的愈伤组织间差别极显著
( P< 0. 01) , POD值越大, 说明愈伤组织的抗寒性越
强。
表 1　愈伤组织 POD活性和可溶性糖含量(△A470/min·gFW )
Table 1　The peroxidase activity and the content of soluble sugar of alfalfa calluses(△A470/min·gFW )
草原 2号苜蓿
Med icag o varia Mart in
cv. Caoyuan No. 2
内蒙准格尔苜蓿
Med icag o sati va L.
cv. Neimen g Zhungeer
龙牧 801苜蓿
Mel ilotoid es ruthenicus( L. ) Sojak×
Med icag o sat iv a L. cv. Longm u No. 801
对照
CK
处理
T reat
对照
CK
处理
Treat
对照
CK
处理
T reat
POD 活性
Perxidase activity
100. 23±1. 76 199. 38±0. 46 94. 27±0. 060 169. 23±0. 27 88. 21±0. 41 147. 82±0. 39
t 值 105. 04* * 221. 90* * 207. 48* *
可溶性糖含量
Solub te sugar content
0. 70±0. 08 1. 69±0. 03 0. 62±0. 03 1. 61±0. 02 0. 49±0. 04 1. 57±0. 04
t 值 22. 26* * 47. 55* * 37. 66* *
　　注 Note: t0. 05, 8= 2. 306. t 0. 01, 8= 3. 355
注 Note: t0. 05, 4= 2. 776. t 0. 01, 4= 4. 604
表 2　愈伤组织脯氨酸含量与相对电导率( % )
Table 2　The content of proline and the relative conduc tivity of calluses( % )
草原 2号苜蓿
Med icag o varia Mart in
cv. Caoyuan No. 2
内蒙准格尔苜蓿
Med icag o sati va L.
cv. Neimen g Zhungeer
龙牧 801苜蓿
Mel ilotoid es ruthenicus( L. ) Sojak×
Med icag o sat iv a L. cv. Longm u No. 801
对照
CK
处理
T reat
对照
CK
处理
Treat
对照
CK
处理
T reat
脯氨酸含量
Content of prolin e
0. 039±0. 003 0. 336±0. 005 0. 032±0. 003 0. 277±0. 005 0. 024±0. 003 0. 244±0. 014
t 值 101. 54* * 22. 69* * 29. 97* *
相对电导率
Relative conductivity
40. 71±0. 46 7. 84±0. 40 46. 59±1. 35 8. 66±0. 23 51. 52±0. 55 8. 93±0. 05
t 值 127. 78* * 54. 44* * 147. 05* *
　　注 Note: t0. 05, 8= 2. 306. t 0. 01, 4= 3. 355
注 Note: t0. 05, 4= 2. 776. t 0. 01, 4= 4. 604
　　在不利条件下, 植物大都积累可溶性糖和一些其
他有机物。可溶性糖可通过渗透调节作用降低冰点, 也
可在植物遭受寒冷时通过阻止细胞质胶体凝聚而避免
细胞质脱水 [ 10]。从表 1可以看出, 供试苜蓿在诱变处
96 草　地　学　报 第 12卷
理和对照的愈伤组织之间可溶性糖含量相差极显著
( P< 0. 01) , 可溶性糖含量高, 表明愈伤组织抗寒
性强。
2. 3　脯氨酸含量测定
脯氨酸能防止水分散失,保护膜结构的完整性。所
以细胞脯氨酸的升高可作为植物抗寒的指标。从表 2
可以看出:供试苜蓿脯氨酸含量在诱变处理与对照的
愈伤组织之间差异极显著( P< 0. 01)。脯氨酸含量越
高,说明愈伤组织越抗寒。
2. 4　电导率测定
低温导致植物细胞膜选择透性改变或丧失, 细胞
内大量物质向外渗漏,组织浸泡液的电导率增高[ 10]。
电导率的增加反映出质膜的伤害程度和所测材料的抗
寒性大小,因此电导法测植物细胞电解质渗透率也可
作为植物抗寒的指标[ 10]。从表2中可以看出, 3个苜蓿
品种之间处理与对照的愈伤组织的相对电导率差别极
显著( P< 0. 01)。电导率越小,细胞膜被破坏的程度越
低,说明愈伤组织的抗寒性越强。
3　讨论
3. 1　筛选突变体材料
作为筛选突变体的供试材料主要有原生质体, 悬
浮培养单细胞以及愈伤组织等。采用原生质体培养可
以避免嵌合体的产生, 但原生质体再生比较困难,实验
技术难度大; 以愈伤组织为材料, 培养程序简单, 而且
再生植株较易。本试验采用愈伤组织作为筛选突变体
的材料较为合适。另外在愈伤组织处理过程中发现, 愈
伤组织的诱导时间、继代次数对诱变效果有影响。愈伤
组织的诱导时间在一个月左右,继代次数不超过 3代
的愈伤组织都可作为理想的供试材料, 这可能与愈伤
组织的生理状态有关。
3. 2　NaN3诱变剂的作用
自从 Spence[ 6]在 1995 年首先发现 NaN 3 对大麦
的诱变以来,国内外已有许多研究者对 NaN 3 在农作
物上的诱变作用进行研究。前人研究表明它是一种对
植物诱变效果良好的化学诱变剂,主要通过改变 DNA
的化学结构而发挥作用 [ 6]。在诱发大麦、水稻等作物上
都获得了相当高的诱变率。福建农业大学作物学院张
书标等人研究了 NaN 3对花生丛芽诱导的影响 [ 6]。本
实验用 NaN 3处理苜蓿愈伤组织进行筛选抗寒性突变
体的尝试,测定诸项生理生化指标表明:处理后的愈伤
组织抗寒性明显高于对照组, 而且与原品种抗寒性顺
序一致, 说明 NaN 3作为苜蓿愈伤组织的诱变剂效果
很好。
3. 3　准确鉴定苜蓿愈伤组织抗寒性的生理指标
植物的抗寒性受遗传基础和环境因素的影响, 愈
伤组织的抗寒性也是一样, 所以用单一的指标评价抗
寒性往往不能得出正确的结果,需要把几项指标进行
综合评定[ 11]。本试验采用的4个生理指标对诱变处理
的愈伤组织及对照组分别进行测定, 而且准确地测出
苜蓿愈伤组织抗寒性的强弱。各项指标所得结果一致,
无论是诱变处理后的突变体还是对照组, 抗寒性的顺
序为:草原2号> 准格尔> 龙牧801苜蓿。因此认为将
电导率、POD 活性、脯氨酸含量及可溶性糖含量这 4
个指标综合评定苜蓿愈伤组织抗寒性的效果很好。
参考文献
[ 1]　Dix P J , et al. Select ion of plant cell l ine w ith enh an ced chill ing
resis tance[ J] . Ann Bot , 1976, ( 40) : 903～910
[ 2]　林定波,颜秋生,沈德绪.柑橘抗寒变异体的获得及其抗性遗传稳
定性的研究[ J] .植物学报, 1999, ( 2) : 136～141
[ 3]　由继红,杨文杰,李淑云.紫花苜蓿抗寒性突变体的筛选[ J ] .东北
师范大学学报自然科学版, 1999, ( 2) : 84～87
[ 4]　李波.苜蓿抗性愈伤组织诱导的初步研究 [ J] . 草地学报, 2003,
( 1) : 63～66
[ 5]　李波.植物组织培养基本技术 [ M ] . 哈尔滨地图出版社, 2002 .
12: 157～170
[ 6]　张书标. NaN3对花生丛生芽诱导的影响[ J ] .花生科技, 2000,
( 1) : 12～13
[ 7]　张志良.植物生理实验指导[ M ] .高等教育出版社, 1999. 2: 154～
165
[ 8]　朱广廉.植物体内游离脯氨酸的测定[ J ] .植物生理学通讯, 1983,
( 1) : 35
[ 9]　丁灿. 电解质渗透法在植物抗寒性鉴定中的应用 [ J ] .思茅师范高
等专科学校学报, 2000, ( 3) : 8～10
[ 10] 王荣富.植物抗寒指标的种类及其应用[ J] . 植物生理学通讯,
1987, ( 3) : 49～55
[ 11] 由继红, 杨文杰,李淑云.不同品种紫花苜蓿抗寒性的研究 [ J ] .东
北师范大学学报自然科学版, 1995, ( 2) : 102～104
97第 2期 李　波等:诱变苜蓿愈伤组织抗寒性研究