全 文 ：第 16 卷 第 6 期
Vol. 16 No . 6
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2008 年 11 月
Nov. 2008
接种后柱花草防御酶活性变化及
PAL基因表达分析
赵 英1, 2 , 付海天3 , 田维敏1, 蒋昌顺1*
( 1. 中国热带农业科学院农业部热带作物栽培生理学重点开放实验室, 海南 儋州 571737;
2. 海南大学农学院, 海南 儋州 571737; 3. 广西亚热带作物研究所, 广西 南宁 530001)
摘要: 在抗病 Miner iao和感病 CIAT2312柱花草( S ty losanthes spp. )叶片接种炭疽病病原菌后, 测定苯丙氨酸解氨
酶( PAL )、多酚氧化酶( PPO )和超氧化物歧化酶( SOD)的活性。结果表明:接种后两种柱花草种质 3 种酶活性均先
升后降,其中抗病株高于感病株, 酶活性与柱花草对炭疽病的抗性密切相关; 从 Mineirao 柱花草中克隆出 PAL 基
因,半定量 RT - PCR分析表明, 其表达量高于 CIAT2312柱花草, 初步推测柱花草 PAL基因对柱花草具有抗炭疽
病作用。
关键词: 柱花草; 苯丙氨酸解氨酶;多酚氧化酶; 超氧化物歧化酶; PAL 基因
中图分类号: Q946. 5 文献标识码: A 文章编号: 1007-0435( 2008) 06-0585-05
Changes in Defendant Enzyme Activity and Expression of PAL Gene of
Sty losanthes after the Vaccination with Anthracnose
ZHAO Ying 1, 2 , FU Ha-i t ian3 , T IA N We-i m in1 , JIANG Chang-shun1*
( 1. Key Laboratory for Tropical Crop Physiology, M inist ry of Agricu lture and C hinese Academy of T ropical Agricultu ral Science, Danzhou,
Hainan Province 571737, China; 2. College of Agronomy, Hainan University, Dan zhou, Hainan Pr ovin ce 571737, Ch ina;
3. Guangxi Sub t ropical Cr ops Research Inst itute, Nanning, Gu angx i Province 530001, China)
Abstract: Leaves of anthr acno se r esistant cultivar Sty losanthes guianensis ( Aubl. ) Sw . cv. M ineirao and
anthracnose sensit ive cultiv ar S. guianensi s cv . CIAT2312 w ere tested for activit ies of phenylalanine am-
monialy ase ( PAL) , polypheno l ox idase ( PPO) , and superox ide dismutase ( SOD) after inoculat ion o f Col-
lectotr i chum gloeosp orioides ( Penz. ) Sacc. T he results show ed that the act ivit ies o f the three enzymes
w ere similar in M ineriao and CIAT2312. After inoculat ion, the act ivit ies of the three enzymes increased at
first and declined afterw ard, the increment of Mineriao w as more than CIAT 2312. It was concluded that
the variation of PAL, PPO, SOD act ivities in the inoculated leaves w ere clo sely co rrelated w ith the
Sty losanthes cultivar resistance against anthracnose. PA L gene w as cloned fr om M ineirao and its expres-
sion level w as higher than CIAT2312 af ter inoculat ion by the test o f sem-i quant itat ive RT-PCR. We specu-
lated that PA L gene had function in the anthracnose resistance of S ty losanthes.
Key words: Sty losanthes; Pheny lalanine ammonialy ase; Polyphenol oxidase; Superox ide dismutase; PAL
gene
柱花草( Sty losanthes spp. )是热带、南亚热带
的重要牧草, 但其推广利用受到炭疽病( Sty lo an-
thracnose )的极大限制,由于该病原菌具有高度遗传
和致病多样性, 很难获得长期的柱花草抗病性[ 1]。
目前的防治手段主要是化学防治, 耗时耗工且不经
济,生物防治研究至今尚未见报道 [ 2]。易克贤[ 3]等
收稿日期: 2008-01-15; 修回日期: 2008-03-04
基金项目: 国家自然科学基金( No. 30460087) ;华南热带农业大学科技基金( No. Rnd0407 ) ;热带作物栽培生理学重点实验室开放课题基
金( KLOF0510)资助
作者简介: 赵英( 1980-) ,女,河南信阳人,硕士研究生,研究方向为热带牧草分子生物学, E- mail: zhaoying-222@ 163. com ; * 通讯作者 Au-
th or for corresponden ce, E- mail : chan gshun j@ yahoo. com . cn
草 地 学 报 第 16卷
综述柱花草抗病育种方面表明:分子育种显示出巨大
优势,从表型选择到基因型选择, 使育种具有更强的
可操作性,并提高了育种的可预见性[ 4]。
据报道,苯丙氨酸解氨酶( Phenylalanine ammo-
nialyase, PAL) [ 5~ 10]、多酚氧化酶 ( Po lyphenol ox-i
dase, PPO)
[ 11~ 13]、超氧化物歧化酶( Superox ide dis-
mutase, SOD) [ 14, 15]等防御酶在植物抗病中具有重要
作用。目前已有关于用矮柱花草过氧化酶基因转化
增强烟草耐黑枯病能力 [ 16]的报道, 以及从矮柱花草
中克隆出苯丙氨酸解氨酶基因、阳离子过氧化酶基
因、咖啡酸邻甲基转移酶基因[ 16] 的报道。而关于
Mineirao 柱花草,却未有 PAL 基因以及这 3种酶与
抗病性关系的报道。
1 材料与方法
1. 1 供试材料
抗病 M ineirao 柱花草 ( S . guianensis ( A ubl. )
Sw . cv. M ineirao ) 和感病 CIAT 2312 柱花草 ( S.
guianensis cv . CIAT 2312)由哥伦比亚国际热带农业
中心 Segenet Kelemu博士提供。胶孢炭疽病病原菌
( Col lectotr ichum gloeosp or ioides ( Penz. ) Sacc. )从
中国热带农业科学院热带牧草研究中心的柱花草植
株上收集分离并保存。
1. 2 接种处理
柱花草炭疽菌孢子悬浮液, OD600= 0. 12,约 106
个孢子,按蒋昌顺等 [ 17]的方法接种病菌于植株叶片,
分别于接种前 1 d,接种后 2、4、6、8、10、12、14 d对抗
感植株采集相同部位的叶片, 分别处理,重复 3次,用
去离子水冲洗干净后,制备酶液,参照袁庆华等[ 18] 的
方法,稍加修改。
1. 3 酶活性测定
分别利用不同的酶提取液提取经过炭疽病病原
菌诱导前后的柱花草抗感植株的叶片中提取 PAL、
PPO及 SOD,对其活性进行比较。
1. 3. 1 制备酶液 分别称取不同处理的叶片
( mg) , PAL 提取液加入 0. 05 mol/ L 硼酸缓冲液
( pH 8. 7) , 7 mmo l/ L-巯基乙醇, 1 mmo l/ L EDTA-
Na。PPO提取液加入蒸馏水。SOD 提取液加入
0. 05 mol/ L磷酸缓冲液 ( pH 7. 8)。再分别加入少
许石英砂和聚乙烯吡咯烷( PVPP) , 冰浴研磨成匀
浆, 4 18000 r/ min, 离心 25 min, 取上清液, 即为
酶提取液。
1. 3. 2 PAL 活性测定 参考现代植物生理学实验
指南中的实验方法 [ 19] , 稍有改动。以每分钟使
OD290增加 0. 01 的酶量定为一个酶活单位 U , 计算
酶活性。
1. 3. 3 PPO 活性测定 参照李靖的实验方法[ 20] ,稍
有改动。以每分钟使 OD398值变化 0. 01为酶量定为
一个酶活单位 U ,计算酶活性。
1. 3. 4 SOD 活性测定 参考现代植物生理学实验
指南实验方法 [ 19] ,稍有改动。采用 N BT 光化还原法
测定,于 560 nm 下测光密度值, 以抑制 NBT 光化还
原 50% 的酶液量( mL)定为一个酶活性单位 U, 计算
总酶活性。
1. 4 引物设计
根据矮柱花草( Sty losanthes humil is Kunth. )的
PAL 基因 [ 21] ( NCBI 网上注册号为 L36822) 序列设
计引物, 引物序列见表 1。
1. 5 RNA的提取
RNA 的提取方法参照申建斌等的方法 [ 22]。
表 1 研究所用引物
Table 1 Pr imer sequences used in this study
编号 序列
No. S equence( 5- 3)
P1上游 P1 forw ard AACTAACAT GGACACTCACGCT AAC
P2下游 P2 reverse CCAGT GAGCAGAGT GACG
P3上游 P3 forw ard AGAAT TCATGGACACTCACGCT AACGCTGAT G
P4下游 P4 reverse CGAAT TCCTAACAT AAT GGAAGAGGAGCACC
P5上游 P5 forw ard AAGCAAGCCT ACGCTCT G
P6下游 P6 reverse GCT CCACCAACT AAGAACGG
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第 6期 赵英等:接种后柱花草防御酶活性的变化及 PAL 基因表达分析
1. 6 PAL基因扩增
反转录酶选用 M-MLV, 按说明书操作。以反
转录的 cDNA 为模板, 以 P1和 P2, P3和 P4为引物
进行巢式 PCR 扩增。将琼脂糖凝胶电泳目的条带
切胶回收, 连接到 T-载体, 转化大肠杆菌, 提取质
粒、酶切鉴定,然后测序分析。
1. 7 PAL基因的半定量 RT- PCR分析
对经过炭疽病诱导前后的抗感病柱花草分别提
取叶片总 RNA, 反转录的 cDNA 第一链直接用做
RT-PCR模板。以 18S 的 P5, P6为引物, 94 预
变性 3 min, 94 变性 50 s, 59 退火 50, 72 延
伸 1 min, 20 个循环, 72 延伸 7 min。调整内
参,确定各个样品的模板量。
2 结果与分析
2. 1 抗感炭疽病柱花草品系 PAL、PPO及 SOD活
性比较
2. 1. 1 PAL 活性变化 两种不同种质柱花草接种
炭疽病原菌后 PA L 活性均比接种前高,抗病株增加
明显高于感病株。接种后 8 d 两者达到最高峰, 抗
病株比感病株酶活高 29. 1%。随着时间的延长, 抗
病与感病株酶活性均下降, 14 d 后接近一致(图 1)。
图 1 抗感病柱花草叶片中 PAL活性变化
F ig . 1 Variat ion in PAL act ivities in Sty losanthes leav es
after inoculation w ith S ty lo anthracnose
2. 1. 2 PPO活性变化 两种不同种质柱花草接种
炭疽病原菌后 PPO活性均比接种前高,抗病株增加
明显高于感病株,其差异在第 6、10、12 d 较大,抗病
株比感病株分别高 57. 4%、94. 8%、137. 6% , 第
14 d时抗感病株 PPO 活性接近一致(图 2)。
2. 1. 3 SOD活性变化 两种不同种质柱花草接种
炭疽病原菌后SOD活性均比接种前高,抗病株增加
高于感病株,第 4、10 d 差异较大, 抗病 Mineriao 柱
花草比感病 CIAT2312 柱花草酶活分别高 58. 9%、
49. 1% (图 3)。
图 2 抗感病柱花草叶片中 PPO活性变化
Fig. 2 Var iation in PPO act ivities in Sty losanthes
leav es after inoculation wit h S ty lo anthracnose
图 3 抗感病柱花草叶片中 SOD活性变化
Fig. 3 Var iation in SOD activities in Sty losanthes
leav es after inoculation wit h S ty lo anthracnose
2. 2 PAL基因扩增
根据 NCBI网上基因 L36822设计了 4条引物
P1, P2, P3, P4(表 2) , 对所提取的 RNA 进行反转
录,以反转录的 cDNA 产物为模板以 P1、P2 为引
物进行第一轮扩增, 将第一轮所得产物稀释 100
倍作为模板,以 P3、P4 为引物进行第二轮 PCR 扩
增,得到的 PCR 产物经电泳检测, 在 2000 bp 上方
有一特异亮带。对片断进行回收、连接、转化及测
序,得到 1条长为 2154 bp 核苷酸序列(图 4)。
对所测的序列在 NCBI网站( ht tp/ / www . nc-
bi. nlm. nih. gov/ )进行 BLAST 分析, 发现该基因
与矮柱花草 PAL 基因(序列号 L36822)的同源性
达到 95%。
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草 地 学 报 第 16卷
图 4 PAL基因的 RT-PCR扩增;
F ig. 4 RT-PCR amplification o f the PAL gene
M:分子量标准 DL2000; l: PAL 基因
M: DL2000 M ark er; 1: PAL gene
2. 3 半定量 RT-PCR结果
对经过炭疽病(浓度 OD 600= 0. 12(约为 106个
孢子/ mL ) ) , 诱 导 后 的 M ineirao 柱 花 草 和
CIAT 2312柱花草提取叶片总 RNA,反转录的 cD-
NA 第一链直接用做 RT-PCR的模板。以18S的基
因表达为 RT-PCR 的内参,确定各个样品的模板量
(图 5)。通过凝胶扫描系统软件进行结果分析表明
诱导后 CIAT 2312柱花草 PA L 基因表达量为诱导
前的47. 45%,而诱导后 M ineirao 柱花草 PAL 基因
表达量为诱导前的 179. 14% (图 5)。
图 5 炭疽病诱导 PAL基因表达影响
Fig . 5 Expression o f PAL genes wit h C. gloeos p or ioides
treatment detected by RT- PCR
1: CIAT 2312柱花草 1: S . g uianensis cv. CIAT2312
2: M ineirao柱花草 2: S . g uianensis cv. M inei rao
3: 处理后 CIAT 2312柱花草 3: S . guianensi s cv. CIAT2312
t reated w ith C. g loe osp or ioide s
4: 处理后 Mineirao柱花草 4: S . g uianensis cv. M inei rao t reated
w ith C. g loe osp or ioide s
3 讨论
3. 1 在植物体内 PAL 作为苯丙烷类代谢定速酶,
与植物抗病性有重要关系。可由花生锈病菌、水稻
稻瘟菌、棉花枯萎菌、小麦白粉病、豇豆锈病菌、葡萄
白腐病[ 23]、苜蓿白粉病 [ 24]等研究得此结论。本试验
通过对抗感病两种柱花草种质接种炭疽病病原菌后
PAL 活性变化分析,得出其活性变化与品种抗病性
呈正相关。PPO 活性抗病株增加高于感病株,可能
是由于抗病株受病原菌浸染后能快速促进酚类化合
物和木质素的合成与积累,以抵抗病原菌的浸染和
扩展, 从而提高寄主的抗病能力。在不同病害中
SOD活性变化差异不大, Buonario 等认为, 在抗病
品种中 SOD 活性一般呈下降趋势,而在感病品种中
基本不变甚至升高, 而王雅平等认为抗感品种接种
后 SOD 活性均升高,抗病品种升高辐度高于感病品
种[ 2 0]。本试验与其结果相同。
PA L、PPO 与 SOD 的活性高低可以作为筛选
抗性植株的生化指标之一, 为抗病育种提供理论
依据。
3. 2 Manner 等从矮柱花草 cDNA 文库中筛选出
PAL 的 cDNA,并研究表明其在植物防卫反应中起
作用。Kazan 等证明过氧化物酶基因( Shpx6a)在
植物防卫中起重要作用, Heather 等研究表明转矮
柱花草 Shp x2 基因的烟草增强了寄主对烟草黑胫
节病的抗性。目前对防卫反应尤其是分子反应所知
甚少,对这方面开展系统研究将有利于探讨抗性机
理,并为我国柱花草生产研究及育种研究提供理论
基础[ 4]。
本试验成功地克隆出 Miner iao 柱花草 PAL,并
通过半定量 RT-PCR 诱导后抗病 M ineir ao 柱花草
PAL 基因的表达量明显高于感病 CIAT2312 柱花
草 PAL 基因,由于基因表达受到复制、转录、翻译、
修饰加工和降解等多个过程的调控, 一级基因的表
达受到上一级基因的调控及环境因素的影响,在细
胞分化的不同阶段, 表达基因的种类和基因表达的
水平不同,因此,不同的柱花草类型, PAL 基因的表
达水平有可能存在差异。另外, 诱导后的感病和抗
病品种之间的病害指数与 PAL 基因表达的差异是
一致的。所以,初步推测PAL 基因在柱花草中具有
抗炭疽病的作用, 能够为柱花草转基因体系的建立
提供一定基础。
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(责任编辑 李 扬 梁艳萍)
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