全 文 ：第1 0卷
1 4 8 9
第 3期
年 8月
植 物 生 理 学 报
AC T A P HYT O P HY SIO L O GI A SIN I C A
V匕1. 1 0, N o . 了
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19 84
植物苯丙氨酸解氨酶的研究
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P A L 活性与尾穗览黄化苗中览红素积累的相关性 .
应初衍 薛应龙
(复旦大学生物系植物生理教研室 )
提 要
用不同因素诱导与抑制的方法较系统地探讨了尾穗览黄化苗 P A L 活性与览红素 积累 之
间的关系。 根据激动素诱导的时间曲线表明 : P A L 活性高峰较早于览红素积 累高 峰 ; P A L
活性及览红素积累都随激动素浓度上升而上升 。
光对激动素诱导的 P A L 活性有增效作用 , 对觅红素积累也有同样的增效作用 。 不 同 光
质 (蓝 、 红 )对 P A L 活性的诱导结果表明 : 蓝光大于红光 , 同时蓝光下览红素积累也大 于 红
光。
用环己亚胺 、 放线菌素 D 及反式肉桂酸等处理激动素诱导的材料时 ,发现在各种抑制条件
下 P A L 活性受抑的同时 , 览红素合成也受抑制 , 且随着抑制剂浓度增加受抑程度也增加 , 可
见 P A L 活性与览红素积累之间有密切关系 。 本文提出了 P A L 可能参与览红素双氢吼噪部分
合成的设想 , 这与目前一般认为多巴是双氢叫噪直接前体的观点不同。
引 言
激动素 、 光 、 病菌等外界因素可以诱导芡科植物芜红素 a( m ar nt h in 或 b et a cy a n l n )的生物合成 ( iP at et il 1 96 4 , 1 96 9 , 19 70 ) 。 用示踪元素方法研究觅红素的生物合成 , 证
明其双氢毗咤部分来 自多巴 。 但对双氢叫噪部分的来源尚无实验证据 , 仅推测可能也来
自多巴的环化 ( S e i u t o 1 9 7 2 , 19 7 4 , Jm p e l l i z z e r i 19 7 2 ) 。
苯丙氨酸解氨酶 ( P A ;L E . C . 4 . 3 . 1 . 6 . )是苯丙酸类物质代谢的关键酶 , 以苯丙氨酸 、
酪氨酸为底物 , 光 、 激动素 、 机械损伤及病菌侵入等 都可 以 诱 导 P A L 活 性 ( C a m 。
19 73 )
。
Wo d h ae d ( 19 74 )还发现用白光处理尾穗觅黄化苗后 , 不仅 P A L 活性上升 , 而且接
着览红素积累也增加 。 本文较系统地用不同因素诱导或抑制的实验方法 , 阐明了 P A L活
性与觅红素积累之间的相互关系 , 并根据实验结果探讨了 P A L 参与觅红素生物合成 的
可能性 。
材 料 与 方 法
尾穗览 ( A m a ar n ht o ca an 而 t us )种子由上海植物园提供 。 种子置冰箱中黑暗保存 ,用时在室温下浸胀
过夜 , 放于培养皿中2 5 O C黑暗培养 。 各种诱导处理 (蓝、 红光除外 ) 都用72 小时黄化苗。 在微弱的绿光
下取子叶及胚轴上半部放入含有各种处理液的培养皿中 , 黑暗培养 (光处理除外 ) , 18 小时后 (时间进
19 8 3 年 1 1 月 10 日收到 .
. 本研究系中国科学院科学基金资助项目 。
缩写 : 多巴 ( D O P A ) : 弓 4二猩基苯丙氨酸 .
4 2 2 植 物 生 理 学 报 `0 卷
程曲线测定除外 )测定 P AL 活性 , 24 小时后测定觉红素含量 。
蓝光及红光诱导用 24 小时黄化苗 , 在蓝 、 红光下分别照射 4 小时 , 然后再放回到 黑 暗 中。 P A L
活性及觉红素测定时间同前。
激动素 ( K i en t in , K T )上海东风试剂厂产品 。 用 0 . 1 万 H CI 配成母液置冰箱中保存 , 临 用 前 稀
释 。 一般浓度 2 . 弓x 10一 SM 。
含酪氨酸或苯丙氨酸的培养液 : 20 m M 的 L 一酪氨酸用磷酸钾钠缓冲液配制 (P H 6 . 9 ) 。 根据 实验
浓度需要再加入适量的激动素母液 。
放线菌索 D ( A c t加。 m y c加 功 : iS ga lan 产品 。 进行处理时用真空渗入法。
环己亚胺 (C y d o h e石 ” d d e ) : 上海东风试剂厂产品 。
光派 : 20 W x 4 荧光灯 。 波长范围蓝光为 47 0 n m 左右 , 红光为 6 50 一 6 60 n m 。 (复旦大学电光源
实验室协助测定 ) 。
P A L 活性测定 : 鲜苗称重后 , 以 1 : 10 加水冰冷的 0 . I M 硼酸缓冲液 (P H 8 . 8 含 20 mM 琉基乙
醇 、 l m对 E D T )A , 研磨及抽滤后 , 冷冻离心 9 , 50 9 /分 , 30 分钟 后 , 取上清液作为测定酶源 。 活 性
测定参照王敬文等( 1 981 )方法 。
览红紊测定: 根据 oK hc h ar ( 198 1) 方法 , 取 0
.
2 9 左右苗加入 s ml 含 I M H CI 的甲醇水溶 液
( V : v 一 1 : 1 ) , 低温下研磨 , 经抽滤 、 离心后取上清液部分于 54 0 n m 处测定吸收 。 在无诱导条件 下 ,
P A L 活性为 0 . 32 犷 IF W . h性 , 览红素为零 。
实 验 结 果
一 、 笨丙橄酸一激动素与醉氮酸一激动案诱导的 P A L 活性和览红亲积累的特点
用含 20 m M 酪氨酸或苯丙氨酸一激动素溶液分别处理黄化苗 , 并于不同时 间 测 定
r A L 活性及芡红素的含量 。 结果表明 : 两种底物对 P A L 活性 ( 以克鲜重表示 )的诱导差
别很小 , 但在含酪氨酸的条件下 , 觅红素的积累明显地较含苯丙氨酸的多 。 在两种处理
条件下 , P A L 的活性高峰与觅红素积累高峰之间有一个时相差 ,而 P A L 高峰较先出现 。
此现象说明 P A L 与宽红素积累可能有因果关系 。 ( 图 1 )
二1 .5
已、 .。 / ` 尹 产一 ,
图 1 含酪氨酸及苯丙氨酸的激动素诱导
下 , 览红素积累与 P A L 活力时间
进程曲线
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览红素含量 ;
含酪氨酸 )
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根据苯丙氨酸与酪氨酸对激动素诱导的 P A L 活性的影响差别不大的事实 , 为测定色
素方便起见 , 以下实验都用 20 m M 酪氨酸一激动素为培养液 。
二 、 不同浓度激动素诱导 P A L 与积爪宽红素的关系
用不同浓度激动素诱导黄化苗 , 一定时间后分别测定 P A L 活性与觅红素含量 。 结果
表明 : 在一定浓度范围内 , 随激动素浓度上升 (0 ~ 6 x 10 一 “ g /m l) P A L 活性及觅红素含
量都线性上升 。 (图 2 )
3 期 应初衍等 :植物苯丙氨酸解氨酶的研究
图 2
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不同浓度激动素诱导下觅红素积累
与 p AL活性的关系
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激动素浓 度
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当激动素浓度大于 2 . 6 X 10 “ 7 9 / m l 时 , 觅红素积累增加的斜率明显小于 P A L 活性增
强的斜率 (图 2 ) 。 这与丁静等 ( 19 7 9) 所报道的结果类似 。
三 、 不同光照时间和不同光质对激动素诱导 P A L 活力与览红素的影晌
用激动素溶液处理黄化苗的同时 , 给以不同时间的白光照射 , 然后再放回黑暗培养 ,
一定时间后分别测定 P A L 活性及觅红素含量 。 结果表明 ,照光后兑红素积累与 P A L活性
水平都比在黑暗中诱导的要高 , 并随着照光时间的延长 , 二者水平相应增加 (表 l ) 。
表 1 不同时间的照光对滋动素诱导的P A L活性与览红素积累的增效作用
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处理条件 C皿d i t io n of t r e a t m e n t 觅 红 素 含 量
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( 10解 g /m l 激动素 K i n e t i n )
P A L 活性 P A L ac t iv i t y
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将苗龄为 2 4 小时黄化苗 ( K oc h h ar 1 9 8 1此时对光敏感性较强 ) , 分别置于蓝光或红
光下照射 4 小时后移至黑暗培养 , 定时分别测定 P A L 活性与芜红素含量 。 结果为蓝光对
P A L 的诱导较红光有效 , 同时蓝光照射后的览红素积累也高于红光 (表 2 ) 。
裹 2 蓝光与红光诱导 P A L 活性与积爪览红紊的关系*
T a b l e 2 C o r r e la t io n b e twe
e n P A L a e it v i yt a n d a m ar a n面 n a e e u m u la t io n
in d u e e d b丫 b lue l i hg t a n d r e d l ig h t
·
犷A L 活 性 相对增加 拓 觅红素含量 相对增加 多
E气L a e t iv i t y R e l a t i代 i n e r e a s e Am o u n t of a m a r a n ht i n R e la t l v e in c r e a ` e人 , o9 l/ 0 0支h 拓 A 。 `。 }10 0支 男
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. 由于红 、 蓝光波长不同, 两种处理 后苗鲜重不同而干重相同 , 为避免水分带来的误差 , 故用 10 0支苗为单 位
表示 。
植 物 生 理 学 报 0 1卷
四 、 反式肉桂酸 、 环已亚胶和放线菌素 D 对激动案诱导的 P A L活性与宽红素积累
的抑制作用
反式 肉桂酸是 P A L催化反应的产物 , 对 P A L 有反馈抑制作用 。 将黄化苗置于含反
式肉桂酸的酪氨酸一激动素培养液中处理 , 发现在 P A L活性受抑的同时 , 觅红素的积累亦
受抑制 , 二者的受抑程度与反式肉桂酸的浓度有关 , 为 s m M > l m M (表 3 ) 。
裹 3 反式肉桂咬对滋动素诱导 P A L 与积从览红紊的抑制作用
T a b le 3 I n h ib i t i o n o f k i n e t i n
一
in d u e e d P A L a e tiv i yt
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反式肉桂酸浓度 PA L 活 性 PA L ac t iv iyt 览 红 素 量
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4 5
蛋白质合成阻遏剂环己亚胺 ( 10 灿g /m l) 可以完全抑制激动素对 P A L 活性和觅红素
积累的诱导作用 。 (表 4 ) 。
表 4 环己亚胶对滋动众诱导 P A L 活性与览红寮的抑制作用
T a b le 4 I n h i b i t io n of k ien t in
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i n d u c e d P A L a e t i v i t y a n d a m a r a n t h i n a e e u mu l
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处 理 条 件
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PA L 活 性 PA L a e t iv i t y
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览 红 素 含 量
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(A 5 4 0 g J F W )
对 照 C o n t r o l
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10
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15
放线菌素 D 可以抑制激动素的诱导作用 , 但即使浓度高至 1 50 户 g / m l , 亦不能完全
抑制 。
当激动素培养液中加入 2 5 灿 g /m l 浓度的放线菌素 D 时 , P A L 活性及觅红素积累开
始受抑 , 随着放线菌素 D 浓度的增加 , 二者受抑程度也 同时增加 (表 5 ) 。
表 5 放线菌素 D 对滋动寮诱导 P A L 活性与览红寮积工的抑制作用
T a b l e 5 I n h ib i t i on or k玩 e t i n一n d u e e d PA L a e t iv i yt a n d a m a r a n t h i n
a e e u m u la t io n b y a e t in o m y c i n D
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放线菌素 D浓度 P A L 活性的相对抑制
C o n e e n t r a iot n
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(解 g }m l)
R e l a t iv e In h ib i t io n o f P A L a e it vi t y
(拓 )
览红素含量的相对抑制
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(拓 )
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J.二
3 期 应初衍等 :植物苯丙氨酸解氨酶的研究
据 P i a te tl 等 (9 1 71 )报道 , 10 ” g /m l 放线菌素 D 可以抑制激动素诱导的览红素合成
的 70 % 以上 ( 以 A m a ar nt h us tr t’co lo ; 为材料 ) , 而在我们的实验中 , 10 ” g /m l 几乎不能影
晌二者的水平 。
讨 论
在光诱导觅红素合成时 , Wo 曲 ae d ( 19 7 4) 发现 P A L 活性也有上升的现象 , 但并 没
有将 P A L 与芜红素合成联系起来 。 本文较系统地从诱导与抑制两个方 面 研 究 P A L 活
性与览红素积累的关系 , 结果表明二者之间有紧密的相关性 。
在光照试验中 , 我们观察到白光对激动素诱导的 P A L 活性与觅红素积累有增效 作
用 , 这与红光对激动素诱导甘薯切片 P A L 活性的增效作用是相似的 (王敬文等 19 8 1 ) 。
另外 , 蓝 、 红光照射后 P A L 活性与觅红素积累也表现出相关性 , 因此可以推测 P A L 与
觅红素生物合成有着直接关系 。
从环己亚胺 , 放线菌素 D 能抑制激动素的诱导作用表明 , 激动素的诱导作用是通过
转录和翻译二个水平实现的 。 ( K o e h l e r 1 9 7 2 )多 但高浓度的放线菌素 D ( 16 0” g /m l ) 尚
不能完全抑制激动素的诱导提示体内可能存在一种长寿命的 m R N A 。 我们关于抗代谢物
处理的实验结果符合 K oc h le r ( 1 9 7 2) 提出的设想 , 并进一步证明了 P A L 与觅红素合成
的关系 。 有人证明 , 在光诱导下 , P A L 活性的增强是通过增加有关的 m R N A 的转录速
度 以及酶蛋白的合成速度实现的 (S e ll r o d er 19 7 6 , R a g , 1 9 7 7 , 王敬文等 1 9 8 1 ) 。 根据
在激动素诱导下 P A L 活性与觅红素积累的时间进程不同 , 我们认为抗代谢物首先抑 制
了 P A L 合成 , 然后导致觅红素积累受阻 。
关于觅红素的双氢叫噪部分 , 目前流行的意见是来源于多 巴 的 环 化 (S ic ut o 1 9 7 4,
I m P e l li z z e r i 1 9 7 2 )
, 而呱 ll e r ( 1 9 0 8 )指出双氢呜}垛部分不直接来源于多 巴的环化 , 另外
F r e n e h ( 1 9 7 3 )
、
p ia t t e l l ( 1 9 7 3 )也认为酪氨酸 、 多巴进入觅红素的行为有所不同 。 我们
根据 P A L 与览红素合成相关的事实推测苯丙氨酸 、 酪氨酸除了经经基化形成多巴并 进
一步转变成双氢毗吮外 (M il er 1 96 8) , 还通过 P A L 的解氨作用经肉桂酸 、 香豆酸 、 咖
啡 酸的途径转变成双氢叫噪 。 W o d h ea d ( 19 7 4) 也报道了在览红素积累增加的同时有 游
离咖啡酸增加的现象 。
外源性的多 巴 、 酪氨酸可以增加光诱导的觅红素积累 , 而外源性的双氢叫噪并不增
强光诱导作用 ( F r e n o h 19 7 3 , 1 9 7 4 , iP a t t e l li 1 9 7 5 ) , 说明在诱导 条 件 下 , 由 P A L 催
化而生成的双氢叫噪是满足的 , 而 由酪氨酸 、 多巴转化成双氢毗陡的过程是限制步骤 。
我们的实验表明 : 在激动素一酪氨酸与激动素一苯丙氨酸两种培养液中 , P A L 活性相同而
觅红素含量则前者大于后者 ( 图 1 ) , 这可能是由于酪氨酸是双氢毗吮更为直接的前体所
致 。 而当激动素浓度达一定程度后 ( 2 . 5 x 10 ” g /m l) 出现随着激动素浓 度 上 升 P A L 活
性上升斜率较觅红素积累增加斜率大的现象 (图 2 ) , 这可能由于酪氨酸不够过量造成双
氢毗吮合成较慢所致 。 这些实验结果符合 P A L 参与双氢叫噪合成的设想 。
觅红素是中央种子目植物所特有的色素 , 含觅红素 的 植 物 不 含 花 青 素 ( sa xt o n
1 97 4)
。
P A L 催化花青素的合成早已得到证明 ( N ie hs 1 9 6 0 ) 。 因此 , 我们根据实验事实
提出的觅红素生物合成与 P A L 直接有关的论点对进一步探讨这两种色素生物合成 的 内
在联系与演化过程有着一定的参考价值 。
2 6 4植 物 生 理 学 报 10卷
参 考 文 献
丁 静等 , 19 79 。 植物内源激素提取分离和生物鉴定 。 植物生理学通讯 , :2 27 一3 .9
王敬文 、 薛应龙 , 19 81 。 苯丙氨酸解氨酶的研究 。 1 . 植物激素对甘著块根苯丙氨酸解氨酶和内桂酸 4 一独化酶
活性变化及其伴随性的影响。 植物生理学报 , 7 : 3 74 一 3 8氏
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i n A m a ; a n th u s t ,女o lo r i n d a r k n e s s . 尸句 ot hc e切 . , 1 0 : 2 8 9一 2 9 3 .
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1 9 7 5
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e o n t or l o f a m a r a n t h in s y n th e s i s i n i s o la t e d A , a , a n ht u s c o t y l e d o n s
.
尸推,心“ 而潮 . , 1 4 : 4 7 9一 4 8 1 .
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1 9 7 5
.
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e h a n g e s in e n z y m e a e t iv yt i
n P a r s l即 c e l l s u s P e ns i o n e u l t u r e s ,
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e t o f i n h i b i t o r o f R N A
a n d P r o t e i n s” th e s is . A chr . B io ch , . B泣oP勺 5 . , 16 : 4 1一 4 6 .
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1 9 7 4
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P ia t et ll i
,
M
. ,
1 9 7 2
.
B e t a n id i n g lo e o sy la t i o n in OP
u n t纽 翻iln `1 . 尸勺 t o c h白m . , 1 1 : 2 2 5 9 .
S e i u t o
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r i e n t e
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G
· ,
P i a t t e l li
,
M
. ,
1 9 7 4
.
B io s y n th es i s o f a m
a r a n t h i n in eC l
o s ia P lu m o as
. 尸推,如动。 . , 13 :
9 4 7一 9 5 1 .
S e h r 6 d e r
,
J
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B e t z
,
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H a h lb r o e k
,
K
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1 9 7 6
.
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in d u e e d e n z y m e s y n th e s i s in e e ll s u s P e sn io n e u l t u r e of
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u m h o r t胡 s亡. D e m o n s t r a t io n i n h e t e r o lo g o u s e el l fr e e s y s t e m o f r a p id e h a n g e s in t h e r a t e of p h e -n
y a la n in
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6 7 : 5 2 7一5 4 1 .
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1 9 7 4
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。动才to . 咫 ,勿动二· , 13 : 9 5 3一 9 5 .6
3期 应初衍等 :植物苯丙氨酸解氨酶的研究 2 4 7
S T UD E IS ONP LA N TP H E NY A LA LN IN EA M M O卜江A一
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V
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T H E E R LA T IN OS H IP B E T W E E NP A LA CT IV T IY A ND
A M A RA N T H IA N C C UM UA LT I ON N IE T I O LA T ED
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y a n a n d X u e iY n g
一
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(D eP
a r tm en t of B切才卿 , uF da n nU i。曰该泣夕)
T h e r e l a ti o n s h i P b e wt
e e n P A L a e t i v i yt a n d a m a r a n t h i n a e e u m u l a it o n i n e t i o
-
l a t e d A m a ar n ht u s c a u da t us s e e d li n g w a s s y s t e m a t i e a l ly i n v e s t ig a t e d b y i n d u e t i o n a n d
i n h ib i ti o n e x P e r im
e n t s
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T h e fo l l o w i n g r e s u l st w e r e o b t a i n e d :
A n e x a m i n
a t i o n o f t h e t im e
一 e o u r s e o f k i n e t i n
一
i n d u e e d P A L a c t i v i yt a n d a m a r a n
-
t h i n a e e u m u l
a t i o n s h o w e d t h a t t h e P e a k o f P A L a e t i v iyt a P P e a r e d e a r l i e r t h a n t h a t
o f a m a r a n t h i n
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T h e P ig m
e n t e o n t e n t w i t h k i n e t h i n
一
t y r o s i n e t r e a t m
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u e h
h ig h e r t h a n t h a t iw t h k i
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一
p h e n y l a l a n i n e t r e a tm
e n t , w h e r e尽5 p A L a e t ivi t i e s w e r e
is m i l a r w i t h b o t h t r e a tm
e n t s
.
P A L a e t i v i t y a n d a m
a r a n t h i n a e e u m u l
a t i o n i n e r e a s e d g r a d u a l ly a n d l i n e a r l y
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e r e a is n g k i n e it n c o n e e n t r a it o n
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a it o n e n h a n e e d k i n e ti n
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i n d u e e d P A L a e t i v i t y a n d a m a -ar n t h i n a e e u m u l a t i o n s im u l t a n e o u s l y
.
T h e d e g r e e
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e n h a n e e m e n t i n e r e a s e d iw t h t h e it m
e o f i l l u m i n
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B l u e Iihg t i n d
u e e d b o t h
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L a n d P ig m
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e t i v e ly t h a n r e d l ihg t
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C yc l
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e , a e t i n o m y
c i n D a n d e i n n a m i e a e i d (
a fe e d b a e k i n h ib i t o r of P A L )
i n h ib i t e d k i n e t i n
一
i n d u e e d P A L a e t i v i t y a n d a m a r a n t h i n a e e u m
u l a t i o n s im u l t a n e o u s ly
.
A e ti n o m y
e i n D
,
i n e o n t r a s t iw t h
e y e l o e e x im i d e d id n o t i n h i b i t P A L a e ti v i yt a n d
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e t e l y e v e n a t a e o n e e n t r a t i o n a s h i g h a s 15 0 9 /m l
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A l l e x P e r i m e n t a l r e s u l t s P r e s e n t e d h e r e s h o w e d t h a t k i n e t i n
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u l a i o n w e r e P a r a l l e l a n d e o r r e l a t e d P h e n o m
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s t h a t t h e b i o s y n t h e s i s o f d i h y d r o i n d o l e o f t h e Pig m
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一 e a t a l邓 e d P a t h w ay . T h i s P o s t u l a t i o n 15 d i fe r e n t fr o m t h e
e u r r e n t o P i n i o n t h a t d i h y d r o i n d o l e 15 d i r e e t l y d e r i v e d fr o m t h
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