全 文 ：第 18 卷 第 1 期
Vol. 18 No. 1
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2010 年 1 月
Jan. 2010
草地早熟禾午夜 号原生质体培养及植株再生
马晖玲, 赵小强, 白小明
(甘肃农业大学草业学院 草业生态系统教育部重点实验室 中- 美草地畜牧业可持续研究中心, 甘肃 兰州 730070)
摘要 : 对草地早熟禾( Poa Pratens is L. )品种-午夜号进行了原生质体培养及其植株再生的研究。以午夜号成
熟种子诱导的松软胚性愈伤组织为材料,利用酶解法分离出大量有活力的原生质体。原生质体经培养, 持续分裂
形成愈伤组织,并分化出再生绿苗和白化苗。研究了不同酶液组成和酶解时间对原生质体游离的影响。结果表
明:采用继代培养 8- 10 d 的胚性愈伤组织在 1. 0%纤维素酶+ 1. 0%离析酶+ 0. 5%果胶酶+ 0. 3%崩溃酶条件
下,酶解 14- 16 h 可得到产量和活力较高的原生质体。原生质体以 2. 0 105-5. 0 105 个/ mL 的植板密度, 采用
液体浅层法在附加 1. 0 mg/ L 2, 4-D、0. 3 mg / L 6-BA、100 mg / L 水解酪蛋白、100 mg/ L 水解乳蛋白、1. 0%蔗糖、
0. 4 mol/ L 甘露醇的 KM 8P 培养基中培养,可形成较小的愈伤组织。愈伤组织经过增殖在分化培养基上( M S+ 0. 5
mg/ LNAA+ 2. 0 mg / L 6-BA)可诱导芽、根的形成,再生出完整植株。
关键词:草地早熟禾; 午夜号;原生质体培养; 植株再生
中图分类号: Q813. 11 文献标识码: A 文章编号: 1007-0435( 2010) 01-0103-05
Protoplast Culture and Plant Regeneration of Midnight (Poa Pratensis L. )
MA Hu-i ling , ZHA O Xiao- qiang, BAI Xiao-ming
( Key laboratory of Grassland Ecosys tem of M inis try of Edu cat ion & Sin o-US Centers for Grazingland Ecosy stem Sus tainabilit y,
Pratacul tu ral College, Gan su Agricultu ral University, Lanzhou, Gansu Province 730070, China)
Abstract: T he friable calli induced from mature seeds of Poa p r atensis L. cv. M idnight II w ere used fo r
pro toplast prepar at ion and the protoplasts w er e iso lated using enzyme digest ion. Cal li appear ed af ter sus-
tained protoplast div isions in culture medium and the g reen shoot and albino plant lets w ere obtained from
the protocalli on different iated medium. The effects of dif ferent enzyme composit ion and enzyme digest ion
time on protoplast isolat ion w ere discussed in this paper. T he r esults show that it w as available to har vest
high yield and viabilit ies o f pro toplasts f rom embryogenic calli w ith t reatment o f digestion in 1. 0% Cellu-
lase Onozuka R-10, 1. 0% M acerozyme R-10, 0. 3% Dr iselase, and 0. 5% Pectolase Y-23 in 8 to 10 d. It
w as better to dig est for 14-16 h in enzyme dig est ion solut ion ment ioned above. Calli formed on KM 8P me-
dium supplemented w ith 1. 0 mg / L 2, 4-D, 0. 3 mg / L 6-BA, 100 mg/ L casein hydroly sate, 100 mg / L
lactablumin hydrolysate, 1. 0% ( W/ V) sucrose, and 0. 4 mo l/ L mannitol at plat ing density o f 2. 0 105-
5. 0 105 mL - 1 . T he protoplast-deriv ed calli developed shoots and ro ots on dif ferent iation media ( M S+ 0. 5
mg/ L NAA+ 2. 0 mg / L 6-BA) af ter further subculture, and then complete plants w ere obtained.
Key words: Poa p ratensi s ; M idnight II; Protoplast culture; Plant regenerat ion
草地早熟禾( Poa p r atensi s L. )属禾本科,是一
种质地纤细、抗寒能力较强的优良草坪草种。在草
地早熟禾育种的研究中, 人们以往采用常规育种手
段,如父母本杂交法[ 1, 2] 、筛选自然突变体[ 3] 和理化
诱导突变体[ 4] 等手段来选育草地早熟禾优良新品
种。而草地早熟禾常以兼性无融合生殖方式进行繁
殖,有些品种的无融合生殖率高达 98%以上[ 5] , 有
性杂交率很低, 利用传统育种方式改良品种特性有
一定困难。
植物原生质体是脱去了细胞壁的裸露细胞,由
于无细胞壁,在化学、物理或自发性作用下原生质体
之间可以进行细胞的融合而获得体细胞杂种。体细
胞杂交技术给植物不同种、属乃至科的遗传物质
的交流提供了可行的途径和方法, 克服杂交不亲和
而导致的生殖屏障 [ 6]。
草坪草的原生质体培养和体细胞杂交技术的研
收稿日期: 2009-04-30;修回日期: 2009- 12-14
基金项目:甘肃农业大学草业学院草业科学国家级重点学科学术骨干科研项目暨草业生态系统教育部省部共建重点实验室资助项目
( CY- GG-2006-10) ;甘肃省教育厅项目( 0702-03)
作者简介:马晖玲( 1966- ) ,女,回族,甘肃兰州人,博士,教授,主要从事以细胞工程和基因工程手段改良草地植物品种特性的研究, E- mail :
mahl@ gsau. edu. cn
草 地 学 报 第 18卷
究仍处于不断的探索、试验和积累阶段,取得的也仅
是一些阶段性成果, Van der Valk 等[ 7] 建立了草地
早熟禾 Merion、 Kimono等品种的原生质体悬
浮培养体系, 但只获得了白化苗; Kisten 等 [ 8]
( 1993)对早熟禾 Geronimo品种进行原生质体培
养,经过 10- 16个月的原生质体培养, 再生频率由
0. 004%- 1. 500%不等, 共得到 127 株再生植株;
Dalton
[ 9] 从悬浮培养高羊茅 ( Festuca ar undinacea
Schreb. ) 和多年生黑麦草( L ol ium p erenne L. )的
原生质体中获得了再生植株; Inokuma[ 10] ( 1996)以
根尖顶端分生组织为外植体,建立了结缕草( Zoy sia
j aponica Steud. )原生质体植株再生体系。
本实验以草地早熟禾品种-午夜 号 ( Poa
Pr atensi s L. cv. Midnight II)成熟种子为外植体诱
导愈伤组织[ 11] ,在此基础上选择经多次继代培养产
生出松软的胚性愈伤组织,从中游离出原生质体, 原
生质体经培养获得再生绿苗和白化苗, 可为进一步
开展细胞融合,获取草地早熟禾体细胞杂种奠定基础。
1 材料和方法
1. 1 实验材料
草地早熟禾品种午夜 号种子由北京克劳沃集
团提供。
1. 2 研究方法
1. 2. 1 适合于原生质体分离的愈伤组织细胞系的
建立 草地早熟禾品种-午夜 号成熟种子经灭菌
消毒后接种在培养基 A1: ( M S+ 1. 0 mg / L 2, 4-D+
0. 1 mg/ L 6-BA)中诱导愈伤组织,选取胚性愈伤组
织在培养基 A2: ( M S + 1. 0 mg/ L 2, 4-D + 0. 3
mg/ L 6-BA)中继代, 每15- 20 d继代1次,继代 10
- 12次后,当大部分大颗粒淡黄色的愈伤组织转变
为淡黄色松软且易分散的小颗粒, 形成稳定的细胞
培养系时,取此类愈伤组织用于原生质体游离。
1. 2. 2 原生质体的游离、收集及其纯化 取固体培
养 8个月左右且在新鲜继代培养基上生长 8- 10 d
的淡黄色胚性愈伤组织,放入酶解液中,材料与酶解
液之比约为 1 10( W/ V)。所用酶类包括纤维素酶
Cellulase Onozuka R-10 ( Yakult, Japan ) , 离析酶
MacerozymeR-10( Yakult , Japan) , 果胶酶 Pecto-
lase Y-23 ( Yakult , Japan ) , 崩 溃 酶 Driselase
( Sigma)。在本实验中设定了 4 个酶处理组合, 详
见表 1。
表 1 不同的酶处理组合
Table 1 Enzyme tr eatment w ith different enzyme composition
酶处理序号
No. of enz yme
t reatment
酶组合 E nzyme com posit ion
1%纤维素酶 Cellulase Onozuka R- 10, 1%离析酶 Macerozyme R-10
1%纤维素酶 Cellulase Onozuka R- 10, 1%离析酶 Macerozyme R-10, 0. 3%崩溃酶 Driselase
1%纤维素酶 Cellulase Onozuka R- 10, 1%离析酶 Macerozym e R-10, 0. 3%崩溃酶 Dris elase, 0. 3%果胶酶 Pectolase Y-23
1%纤维素酶 Cellulase Onozuka R- 10, 1%离析酶 Macerozym e R-10, 0. 3%崩溃酶 Dris elase, 0. 5% Pectolase 果胶酶 Y-23
酶溶剂( CPW-13M )组成( mg / L )为: KH 2PO 4
( 27. 2)、KNO3 ( 101. 0)、CaCl2 2H 2O ( 1480. 0)、
MgSO4 7H 2O( 246. 0)、KI( 0. 16)、CuSO4 5H 2O
( 0. 025)、5. 0 mmol/ L MES、13%甘露醇, pH5. 8。
酶解混合物置于 26 1 黑暗条件下酶解, 前
30 min静置,接着在 50 r pm 的摇床上震荡,以分离
原生质体。酶解 2 h 后,每隔 2 h 取样观察 1次, 并
在倒置显微镜下观察原生质体的释放情况。
酶解时间设置为: 2、4、6、8、10、12、14、16、18 h。
酶解混合物用 200和 300目无菌尼龙网筛过
滤,在 100 g 离心 5- 10 min,收集原生质体, 底部
沉淀的原生质体用 CPW-13 M (成分同上)悬浮, 再
离心,反复 2- 3次。沉降的原生质体用 25%( w/ v)
蔗糖溶液离心( 100 g 离心 10 min)漂浮纯化原生
质体。纯化后再加入 CPW-13M (成分同上)洗涤 1
次,最后用原生质体培养液洗涤 2次,随后统计原生
质体的产量和活力。用血球计数板计算原生质体的
产量,原生质体的活力用荧光素双醋酸酯( FDA )染
色检测。
1. 2. 3 原生质体培养 把经洗涤后的原生质体重
新悬浮于原生质体培养基中, 调整密度到 2 105-
5 105 个/ mL。放入直径为 6 cm 的玻璃培养皿
中,每皿 2 mL, 在 26 1 黑暗条件下,采用液体浅
层静置培养。采用的原生质体培养基为 KM8P 基
本培养基,附加 1. 0 mg / L 2, 4-D、0. 3 mg/ L 6-BA、
100 mg/ L 水解酪蛋白、100 mg / L 水解乳蛋白、1%
蔗糖、0. 4 mol/ L 甘露醇, pH 5. 8。
1. 2. 4 愈伤组织的形成及植株再生 在原生质体
培养过程中,每隔 1周添加新鲜的培养基,大约 1-
2周后,当原生质体分裂形成小细胞团时, 向培养皿
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第 1期 马晖玲等:草地早熟禾午夜号原生质体培养及植株再生
中添加 1 mL 新鲜培养基(甘露醇浓度减半) , 4周之
后当形成肉眼可见的小愈伤组织时,将小愈伤组织
转移到除去甘露醇的培养基继续进行培养。小愈伤
组织长至 2 mm 左右时转移至 A2培养基上进行增
值。当愈伤组织长至 0. 5 cm 左右时,转入分化培养
基( A3: MS+ 0. 5 mg/ L NAA+ 2 mg/ L 6-BA)上, 在
25 1 , 2500 lx 下诱导分化、生根和再生植株。
2 结果与分析
2. 1 适合于原生质体分离和培养的胚性愈伤组织
细胞系的建立
从午夜号成熟种子诱导出的愈伤组织可分为
两类:一类灰白色或乳白色,质地松软, 生长较慢, 量
少(图版 , 1) ; 另一类为淡黄色或鲜黄色、较干燥、
颗粒状、增值较快的胚性愈伤组织(图版 , 2) ,后者
居多。继代时将第二类愈伤组织转移到能维持其胚
性且增值比较快的 A2培养基上继续进行培养, 继
代10- 12次后,最终成为稳定的细胞系。实验表明从这
种愈伤组织中能够分离出大量有活力的原生质体。
2. 2 原生质体分离
2. 2. 1 酶液组成对原生质体产量的和活力的影响
把在新鲜培养基上继代培养 8- 10 d的胚性愈伤组
织置于表 1所示的 4 种不同组合的酶解液中, 酶解
后收集的原生质体产量在 1. 82 105 - 3. 2 106
个/ g 之间,其中,具有活力的原生质体占 58%以上。
从表 2可以看出,酶处理 、酶处理 与酶处理相
比较,在纤维素酶与离析酶的组合的基础上加入
0. 3%崩溃酶和 0. 3%果胶酶时有利于原生质体的
释放;在此基础上把果胶酶浓度提高到 0. 5%(酶处
理) ,可以使原生质体的产量和活力达到最大, 分
别为 3. 2 106、76%。研究表明, 对于草地早熟禾
午夜 号原生质体的分离, 适宜的酶处理组合为:
1%纤维素酶 Cellulase Onozuka R-10、1% 离析酶
Macero zymeR-10、0. 3%崩溃酶 Driselase、0. 5% 果
胶酶 Pectolase Y-23。
2. 2. 2 酶解时间对原生质体产量的和活力的影响
酶解时间是影响原生质体分离的一个重要的因素。
本试验中比较了不同酶解时间对午夜号原生质体
产量和其活力的的影响。从图 1中可以看出, 随酶
解时间的延长原生质体的产量变化幅度比较大; 而
活力的变化比较平稳,当酶解 16h 时,原生质体的产
量和活力(图版 , 3, 4)达到最大值, 分别为: 3. 14
106 个/ g、7. 64%。结合酶液组成对草地早熟禾午
夜 号原生质体游离的影响,适宜的酶解时间设定
为 14- 16 h。
表 2 酶液组成对草地早熟禾午夜号原生质
体产量和活力的影响
Table 2 Effect of enzyme composition on the yield
and viability of pro toplasts from Midnight
酶处理
Enzym e
tr eatm ent
原生质体产量
Protoplas t yield
( g Fresh w eight )
原生质活力
Pr otoplast
viabilit y ( % )
1. 82 105 58. 0
4. 20 105 63. 2
8. 24 105 71. 5
3. 20 106 76. 0
图 1 酶解时间与午夜号原生质体产量和原
生质体活力之间的关系
Fig. 1 Relationship betw een enzyme digestion t ime and
prot oplast yield and prot oplast viabilit y of M idnight
2. 2. 3 原生质体的培养和生长 将原生质体的密
度调到 2 105- 5 105 / mL 进行培养,经 2- 3 d的
培养后,原生质体再生细胞呈现椭圆形状,并开始第
一次细胞分裂(图版 , 5)。随后几天可以观察到 2
次及 2次以上的细胞分裂(图版 , 6, 7)。7 d左右
可以观察到大量的原生质体再生细胞团(图版 ,
8)。15 d后,形成肉眼可见的小愈伤组织(图版, 9)。
2. 2. 4 原生质体愈伤组织的形成及植株再生 由
原生质体产生的愈伤组织, 在培养过程中部分死亡,
能够持续分裂的大多是结构致密的胚性愈伤组织
(图版 , 10) ,最终形成绿色小苗(图版 , 11)。但
是经过 2次继培养之后, 大多数变成松散型的胚性
愈伤组织。这种类型的愈伤组织分化产生的苗较直
接由成熟胚诱导的愈伤组织产生的苗纤细且再生率
苗较少, 并且往往是白化苗。培养 30 d后将其再转
移至分化培养基上分化。经 30 d培养后在供试的
39块愈伤组织中,有 3 块分化出了芽, 芽分化率为
7. 69% ,且进一步生根形成完整的植株。
105
草 地 学 报 第 18卷
图版 说明
P late I Explanation
1. 水渍状愈伤组织 2.胚性愈伤组织 3.游离出的原生质体 4.有活力的原生质体 5.原生质体再生细胞的第 1次分裂 6. 原生质体再生细胞
的第 2次分裂 7. 原生质体再生细胞的第 3次分裂 8.培养 7 d后形成小细胞团 9.培养 15 d后形成小愈伤组织 10. 原生质体形成的愈伤组织
11. 原生质体再生出完整的小植株
1. St icky call i; 2. Embry ogenic calli; 3. Fr esh ly is olated pr otoplast s f rom cal li; 4. Viable protoplast s; 5. First division of protoplas t-de-
rived cell ; 6. Second division of protoplast-derived cell; 7. T hird divis ion of protoplast-derived cel l; 8. C ell clus ters form ed f rom protoplast-de-
rived cell; 9. M icrocalli formed f rom protoplast s; 10. Call i formed f rom protoplast- derived cell; 11. Plants regenerated f rom protoplast-derived calli
3 讨论
3. 1 供体材料的选择
在植物原生质体培养的过程中, 原生质体的来
源是植株再生的关键所在。分离原生质体的材料是
否有较高的细胞分裂、分化和形态建成潜力, 决定了
其原生质体所形成的愈伤组织能否继续分化形成再
生植株[ 7]。在以往的研究工作中, 游离原生质体大
多采用幼穗[ 12] 、叶[ 13~ 17]、茎[ 13, 18]、叶柄[ 15] 、下胚
轴[ 19] , 以及由它们诱导的愈伤组织和建立的悬浮细
胞系[ 13,20] ,也有用子叶和花药愈伤组织分离原生质体
的报道[ 17, 21]。本实验以草地早熟禾成熟种子诱导的
愈伤组织为材料,游离出大量有活力的原生质体, 经
过进一步的培养芽分化率达 7. 69%, 最终获得再生
植株。本实验表明,活力旺盛的胚性愈伤组织是获
得草地早熟禾原生质体再生植株的最佳供体材料。
3. 2 草地早熟禾原生质体培养程序的建立
在国外已报道的草地早熟禾原生质体培养的研
究中, Van der Valk等 [ 7]、Kisten等[ 8]通过建立原生
质体悬浮培养体系获得了再生植株。他们成功的关
键是建立了胚性细胞悬浮系,但由于建立原生质体
的悬浮培养体系时过程繁琐,植株再生频率低, 一般
要经过外植体(种子、下胚轴)-愈伤组织-液体培养
基上生长-原生质体分离-条件培养基上培养或看护
培养-平板接种-原生质体分化-植株分化等过程。其
再生过程所需时间长, 程序复杂。本实验采用草地
早熟禾午夜 号成熟种子诱导出胚性愈伤组织, 经
过 10- 12次继代培养后获得的胚性愈伤组织具有
较高的细胞分裂和形态分化能力, 游离出的原生质
体经培养可持续分裂, 形成的愈伤组织较快分化, 5
个月后形成完整的植株。本实验使草地早熟禾原生
质体培养程序得以简化,培养时间明显缩短。
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第 1期 马晖玲等:草地早熟禾午夜号原生质体培养及植株再生
3. 3 酶液组成、浓度和酶解时间对原生质体分离和
生长的影响
游离原生质体时,酶解液的组成、浓度和酶解时
间是一个关键环节,它影响着原生质体的产量和活
力。酶液浓度过高或过低, 都不利于原生质体的游
离,舒文华等[ 22]在紫花苜蓿(M edicago sativa )原生
质体培养中也得出了同样的结论。最佳的酶液组合
和酶解时间也随植物品种的不同有着较大的差
异[ 17] , 不同的品种所需要的酶解条件是特定的, 确
定和控制好这个酶解条件对原生质体的分离和培养
至关重要。王海波等[ 23] 使用 2%纤维素酶+ 0. 5%
果胶酶酶解苜蓿叶片, 酶解 8 h, 获得最佳的游离效
果。实验结果表明, 草地早熟禾原生质体在 1%纤
维素酶、1%离析酶、0. 3%崩溃酶和 0. 5%果胶酶酶
液组合处理下, 酶解 14- 16 h可获得产量较高且活
力较强的原生质体, 并在后续的生长中表现良好。
适宜的酶液组合和酶解时间不仅有利于原生质体的
释放,可获得大量的有活力的原生质体,而且也是原
生质体进一步的生长、分裂和分化的先决条件。
4 结论
本实验对草地早熟禾品种午夜 号进行了原生
质体的分离和培养, 成功获得了原生质体再生植株。
建立了草地早熟禾原生质体培养程序。即采用继代
培养 8- 10 d的胚性愈伤组织为供体材料; 适宜的
酶处理组合为 1. 0%纤维素酶、1. 0%离析酶、0. 5%
果胶酶和 0. 3%崩溃酶,酶解时间 14- 16 h;适宜的
原生质体植板密度是 2. 0 105 - 5. 0 105 个/ mL,
原生质体培养方法为液体浅层法;适宜的原生质体
培养基为 KM8P(附加 1. 0 mg / L 2, 4-D、0. 3 mg/ L
6-BA、100 mg/ L 水解酪蛋白、100 mg/ L 水解乳蛋
白、1. 0%蔗糖、0. 4 mol/ L 甘露醇) ; 原生质体来源
的愈伤组织分化培养基为 MS(附加 0. 5 mg/ LNAA
+ 2. 0 mg/ L 6-BA)。
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(责任编辑 米 佳 刘敏轩)
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