全 文 ：第21卷　第2期
　Vol.21　 No.2
草　地　学　报
ACTA AGRESTIA SINICA
　　　　　 2013年 3月
　 Mar.　2013
doi:10.11733/j.issn.1007-0435.2013.02.027
8个小麦条锈菌生理小种产孢相关
基因PsCon1克隆及表达分析
司二静1,2a,赖　勇1,2,孟亚雄1,2a,李葆春1,2,马小乐1,2,尚勋武2,王化俊1,2∗
(1.甘肃省作物遗传改良与创新重点实验室 甘肃省干旱生境作物学重点实验室,甘肃 兰州　730070;
2.甘肃农业大学农学院 生命科学技术学院,甘肃 兰州　730070)
摘要:为研究基因Pscon1在不同小种中核苷酸序列及相对表达量差异,以小麦条锈菌(Pucciniastriiformisf.sp.
tritici)基因组DNA为模板,在小麦条锈菌8个生理小种中分别克隆产孢相关基因Pscon1,并对其核苷酸和氨基酸
序列进行比对及相对表达量分析。结果表明:在8个小种中分别克隆到条锈菌产孢相关基因Pscon1,基因大小为
531bp,由3个外显子和2个内含子构成,开放阅读框长252bp,不同小种基因Pscon1核苷酸序列只在44,65,331,
465,495和510bp位点处发生突变,均未引起氨基酸序列变化,且不同生理小种Pscon1在接种‘铭贤169’12h后
相对表达量有差异,水源11-3最高,最低的是 Hybrid46-8。推测基因Pscon1在小麦条锈菌不同生理小种产孢过程
中相对表达量有差异,这将为进一步研究产孢量差异因素提供参考。
关键词:小麦条锈菌;生理小种;产孢相关基因;实时定量PCR
中图分类号:Q943.2;S435.121.42　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1007-0435(2013)02-0388-06
CloningandExpressionAnalysisConidiation-RelatedGenePscon1fromEight
PhysiologicalRacesofPucciniastriformisf.sp.tritici
SIEr-jing1,2a,LAIYong1,2,MENGYa-xiong1,2a,LIBao-chun1,2,
MAXiao-le1,2,SHANGXun-wu2,WANGHua-jun1,2∗
(1.GansuKeyLab.ofCropImportant& GermplasmEnhancement/GansuProvincialKeyLaboratoryofAridlandCrop
Science,Lanzhou,GansuProvince730070,China;2.ColegeofAgronomy/ColegeofLifeScienceandTechnology,
GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou,GansuProvince730070,China)
Abstract:Inordertoresearchthediferenceofnucleotideandrelativeexpressionlevelbetweendiferentraces,
Pucciniastriformisf.sp.triticiwasusedastheDNAsource.Conidiation-relatedgenePscon1wasclonedandi-
solatedfromeightepidemicphysiologicalraces,andnucleotideandaminoacidlevelandrelativeexpressionlevels
wereanalyzed.Resultsindicatedthata531bpDNAsequenceofPsConlwasclonedandcomprisedthreeextrons
andtwointrons,includingacomplete252bpopenreadingframe.SequenceanalysisindicatedthatthePsConl
sequencesoftestedphysiologicalraceshadafewmutationsinthesiteof44bp,65bp,331bp,465bp,495bp
and510bp,butnoaminoacidsequenceswerechanged.Therelativeexpressionlevelsoftestedphysiologicalraces
werediferentafter12hinoculation.AccessionSu11-3hadthegreatestexpressionwhileHybrid46-8hadtheleast
amongtestedphysiologicalraces.Itwasconcludedthattheefectofconidiation-relatedgenePscon1onthespore
productionofdiferentphysiologicalraceswasdiferent.
Keywords:Wheatstriperust(Pucciniastriformisf.sp.tritici);Physiologicalrace;Conidiation-relatedgene;
RealtimePCR
　　小麦条锈菌(Pucciniastriiformisf.sptriti-
ci)是小麦(Triticumaestivum Linn.)生产中最重要
的病害之一,在特大流行年份可造成巨大损失,少数
地块甚至颗粒无收[1]。种植抗病品种是在病害常发
收稿日期:2012-09-21;修回日期:2012-12-21
基金项目:国家自然基金(30771331);甘肃省农业生物技术研究与应用开发项目(GNSW200701);甘肃省干旱生境作物学重点实验室开放
基金(GSCS-2010)资助
作者简介:司二静(1984-),男,山西晋城人,博士研究生,研究方向为麦类分子抗性遗传与育种,E-mail:sierjing@163.com;∗通信作者
Authorforcorrespondence,E-mail:whuajun@yahoo.com;a代表二位作者为共同第一作者arepresentthatSIEr-jingand
MENGYa-xiongcontributedequalytothiswork
第2期 司二静等:8个小麦条锈菌生理小种产孢相关基因PsCon1克隆及表达分析
区所采用最经济有效的农业防治措施[2]。目前,条
锈菌毒性小种由于小麦育种中抗病遗传背景狭窄更
易产生新小种,从而引起抗病品种抗病性丧失[3]。
在小麦条锈菌与小麦互作中,寄生适合度不仅是决
定其生存能力最重要因素,而且是寄主基因型和病
原菌基因型综合决定的寄生能力和发展能力[2],同
时也是决定病原菌生理小种和变异菌系能否流行的
重要特性[4]。我国小麦条锈菌最重要的寄生适合度
属性为条锈菌的产孢能力(繁殖力)[5]。产孢相关基
因是一类与孢子产量、形态和发育等相关联的基因,
对真菌孢子生长起关键作用[6]。Con是一类产孢相
关基因,是在真菌中发现的一类具有保守N末端的
小蛋白家族,具有2个保守结构域[7]。陈玥颖等[8]从
小麦条锈菌CY32初步克隆得到Pscon1基因并推断
其影响芽管和吸器的形成,同时影响条锈菌侵染过程
中的产孢过程,是一个促进条锈菌侵染小麦的致病相
关基因。对病原菌产孢过程的研究已有大量报道,其
产孢机制及产孢相关基因已得到详细阐明[9]。如粗
糙脉胞菌(Neurosporacrassa)中报道的突变菌株营养
阶段表达的con-8[10]、在发育调控基因中起重要作用
的con-13[11]、产孢期特异表达而营养阶段不表达的
con-10[12]、在没有施加养分限制条件下控制菌株液体
深层培养产孢和产孢过程中葡萄糖转运的rco-3[13]、
诱导孢子生长的基因fluffy [14]和直接或间接条件
产孢特异基因表达的nop-1[15]。对于构巢曲霉(As-
pergillusnidulans),也有许多产孢相关基因被报
道[16],brlA,abaA和wetA这3个基因组成了关键的
产孢调控途径,调控产孢相关基因有序表达。同时包
括flbG,flbA,flbB,flbC,flbD和flbE在内的一
系列基因组成另外一条调控途径,与上述brlA,abaA
和wetA组成了关键的调控途径共同调节构巢曲霉的
产孢[9]。此外还有网斑病菌(Pyrenophorateres)
PTK1[17]、盾壳霉真菌(Coniothyriumminitans)CM-
PEX2[18]和CMADA[19]。目前关于小麦条锈菌产孢
相关基因只有Pscon1被报道,不同生理小种间基因
Pscon1的差异和表达量差异的研究还未见报道,本研
究通过克隆小麦条锈菌不同生理小种的基因Pscon1
及对其表达量进行分析,探索不同小种间Pscon1基
因序列和表达量差异,为相关研究提供参考。
1　材料与方法
1.1　材料
供试菌系:条中33、水源11-7、条中32、Hy-
brid46-8、水源11-3、水源11-4、水源11-5、水源11-
13的单孢菌系,由甘肃省农业科学院植物保护研究
所提供。采用常规方法在鉴别寄主上进行单孢菌系
的分离及各生理小种的鉴定[1],并参照康振生等[20]
的方法,在感病品种材料小麦‘铭贤169’上接种繁
殖。采集的新鲜夏孢子先置于干燥器中4℃干燥,4
~5d后将孢子粉转入安培管抽真空封存于-70℃
保存备用。
供试叶片:将不同生理小种接种到‘铭贤169’
上,接种后12h取样,取样后迅速将样品保存于液
氮中,-80℃保存备用。
主要试剂:引物序列购自华大基因有限公司合
成;dNTPs、Taq酶、10×ReactionBuffer和 RNA
simpleTotalRNAKit等试剂均购自天根生化科技
有限公司;PrimeScriptRTreagentKitPerfectReal
Time和SYBRPremixEXTaqTM Ⅱ购自宝生物工
程有限公司。DNA测序工作由华大生物工程有限
公司完成。
1.2　方法
1.2.1　DNA和RNA提取　以小麦条锈菌夏孢子
为材料提取小麦条锈菌基因组DNA,方法参考文献
[21]并做部分改动。小麦叶片的 RNA 提取参考
RNAsimpleTotalRNAKit试剂盒说明书。
1.2.2　Pscon1基因扩增　扩增引物序列[8]由华大
生物工程公司合成,Pr1:5′-TTGTCGGAGGACT-
CATTGTAG-3′;Pr2:5′-TTCTTCTGTTGCTC-
GTTTACC-3′。反应体系25μL包含:10×Reac-
tionBuffer(200mmol·L-1 Tris-HCl(pH8.4),
100mmol·L-1 KCl,100mmol·L-1(NH4)2SO4,
15mmol·L-1 MgCl22.5μL,dNTPs(10mmol·L-1)
2μL,模板 DNA(60ng·μL-1)2μL,引物(10
ng·μL-1)各1μL,Taq酶(2.5U·μL-1)0.4μL
和ddH2O16.1μL。PCR扩增程序:94℃预变性5
min,94℃变性50s,54.80℃退火50s,72℃延伸
90s,35个循环,72℃10min,4℃保温。PCR产物
经1%琼脂糖凝胶电泳检测,凝胶成像仪观察结果。
1.2.3　蓝白斑筛选、酶切鉴定　目标片段经琼脂糖
凝胶回收试剂盒回收后,用T4 DNA连接酶连接至
pGM-T载体,反应体系包含目的 DNA 片段3.0
μL,pGM-T载体1.0μL,10×T4DNAligasebuffer
1.0μL,T4DNA连接酶1.0μL和ddH2O4.0μL。
反应条件:16℃水浴16h。转化E.coli菌株DH5α
感受态细胞涂布于含有ITPG,X-gal和氨苄青霉素
983
草　地　学　报 第21卷
的LB固体培养基上培养以及筛选,挑取白色菌落
置于含有100mg·L-1氨苄青霉素的LB液体培养
基中培养,提取质粒,经EcoRⅠ酶切鉴定,酶切反应
体系:10×Buffer(BufferH)2μL,BSA×1000.5
μL,EcoRⅠ(10U)1.5μL,质粒DNA8μL,ddH2O
7.5μL。经37℃水浴6h酶切鉴定。
1.2.4　序列测定及生物信息学分析　经酶切鉴定
后为阳性克隆子质粒,送华大基因公司对目的片段
进行测序。利用软件DNAMAN和ClustalX1.83
对测序结果进行分析,氨基酸序列多重比对。运用
ORFfinder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/
gorf.html)对所得序列的开放阅读框进行查找。
1.2.5　接菌12h基因表达模式分析　以cDNA第
1链产物为模板,实时荧光定量PCR引物序列为:
上游5′-ATTTCCTTCGTTTCGCTGTTAG-3′;
下游:5′-TGATGAGGATTTGAAGAGTCGC-3′)。
内参 引 物 序 列 为:上 游 5′-TTCGCCGTCCGT-
GATATGAGACAA-3′;下 游:5′-ATGCGTAT-
CATGGTGGTGGAGTGA-3′)。反应体系 包 含:
0.5μL50×SYBRGreen,0.1μLROX,1μL25×
cDNA,2.5μL10×PCRBuffer,2.5mmol·L-1
MgCl2,0.16mmol·L-1dNTP和0.2μmol·L-1
引物,补水至总体积25μL。扩增程序:95℃1min,
95℃10s,60℃20s,72℃40s,循环数40个,均参
考陈玥颖等[8]的方法。每个反应3个重复,运用
MxPro软件分析不同小种在接菌12h后Pscon1的
相对表达量[22]。
2　结果与分析
2.1　DNA和RNA提取
提取小麦条锈菌夏孢子的DNA和接菌后小麦
叶片的RNA,电泳检测结果如图1所示。所提取的
DNA能够满足PCR扩增的需求;所提取的 RNA
经琼脂糖凝胶电泳显示条带清晰,完整性较好,可以
用于反转录和RT-PCR扩增。
2.2　产孢基因Pscon1序列扩增
本试验以小麦条锈菌夏孢子基因组 DNA 为
PCR扩增模板,运用引物:Pr1(5′-TTGTCGGAG-
GACTCATTGTAG-3′)和 Pr2(5′-TTCTTCTGT-
TGCTCGTTTACC-3′)在条锈菌生理小种条中33、
水源11-7、条中32、Hybrid46-8、水源11-3、水源11-
4、水源11-5和水源11-13克隆分离条锈菌的产孢
相关基因Pscon1。对PCR扩增产物用琼脂糖凝胶
电泳进行检测分析,结果如图2所示,8个生理小种
均扩增出约500bp大小的特异DNA片段,其分子
量大小与Pscon1按引物Pr1和Pr2扩增的预期片
段大小基本相符。
图1　小麦条锈菌夏孢子DNA和小麦叶片RNA的检测
Fig.1　DNAimageofPucciniastriiformisf.sp.tritici
andRNAimageofwheatleaf
图2　基因Pscon1在不同生理小种中的PCR扩增结果
Fig.2　PCRresultofgenePscon1from
eightphysiologicalraces
注(Note):M:DL2000DNAmarker;1:条中33(CY33);2:水源
11-7(Su11-7);3:条中32(CY32);4:Hybrid46-8;5:水源11-3(Su11-
3);6:水源11-4(Su11-4);7:水源11-5(Su11-5);8:水源11-13(Su11-
13)
2.3　条锈菌产孢基因Pscon1重组子阳性克隆的酶
切鉴定
目的片段经琼脂糖凝胶进行回收,用T4 DNA
连接酶连接至pGM-T载体。将连接产物通过热激
法转化E.coli菌株DH5α感受态细胞,从白斑菌落
提取重组质粒,用EcoRⅠ进行酶切鉴定,本试验选
用的克隆载体在其克隆区两端均有EcoRⅠ的酶切
位点,因此选用限制性内切酶EcoRⅠ对Pscon1基
因的阳性克隆子进行酶切鉴定。酶切鉴定结果如图
3所示,各小种重组质粒均能够切出载体和约500
bp的目的片段。上述结果表明,Pscon1成功连接
至载体pGM-T上。
093
第2期 司二静等:8个小麦条锈菌生理小种产孢相关基因PsCon1克隆及表达分析
图3　基因Pscon1克隆载体的酶切鉴定结果
Fig.3　Restrictionenzymedigestingofgene
Pscon1incloningvector
注(Note):M1:DL15000DNAmarker;1:条中33(CY33);2:水
源11-7(Su11-7);3:条中32(CY32);4:Hybrid46-8;5:水源11-3
(Su11-3);6:水源11-4(Su11-4);7:水源11-5(Su11-5);8:水源11-13
(Su11-13);M2:DL2000DNAmarker
2.4　Pscon1基因测序及分析
将阳性重组质粒送交华大公司测序,然后将测
序结果利用分子生物学软件DNAMAN和Clustal
X1.83进行比对分析,不同生理小种基因Pscon1核
苷酸序列比对结果如图4所示。本研究克隆序列为
GenBank中注册的Pscon1基因核酸序列的一部
分,起始于第83bp处终止于第613bp处,包含该
基因3个外显子(79~132bp,213~359bp和432
~494bp,框中标出)和2个内含子(133~212bp和
360~431bp)。不同小种基因Pscon1序列只在个
别碱基发生突变(图4),以条中32为对照,在45bp
处菌种水源11-7,Hybrid46-8,水源11-3,水源11-
4,水源11-5和水源11-13在该位点的碱基突变为
A。此外65,310,465,495和510bp处均有突变。
在65bp处水源11-3的碱基为 T;310bp处 Hy-
brid46-8,Su11-3和Su11-4的碱基为 T;465bp处
Su11-7的碱基为T;495bp处Su11-3的碱基为G;
510bp处Su11-5和Su1-13的碱基为 T。综上所
述,不同小种核苷酸只在个别碱基发生突变。Hy-
brid46-8、水源11-3以及水源11-4在基因外显子
311bp处突变为T,水源11-7在465bp处突变为
T,但均未引起氨基酸变化,所编码氨基酸仍为亮氨
酸和组氨酸,因此各小种产孢相关基因Pscon1所编
码氨基酸序列相同。
2.5　接种12h后不同小种Pscon1基因表达量分析
选取在‘铭贤169’上接菌不同小种12h后的叶
片,分别提取叶片的RNA,然后进行反转录。取反
转录得到的cDNA2μL,分别用扩增基因Pscon1
和延伸因子的引物进行RT-PCR分析。不同小种
的基因Pscon1在‘铭贤169’上均有表达(图5)。但
是不同小种基因Pscon1的相对表达量有差异,其中
在水源11-3中基因相对表达量最高,条中32次之,
小种Hybrid46-8中表达量则最低。
3　讨论与结论
小麦抗条锈病品种的抗性消失主要有小麦条锈
菌、环境以及抗性品种3方面决定,而新小种的产生
和发展起着关键的作用。关于小种研究涉及很多方
面,李文龙等[22]运用建模软件模拟动态侵染过程,
以反映病害流行的特征,但未考虑到实际条件下诸
多因素的影响。此外孟亚雄等[23]为及时准确检测
条锈菌群体的组成,初步建立了水源11-4小种的
SCAR标记。作为决定条锈菌生存能力的寄生适合
度不仅能够预测群体中各小种或基因型频率及其消
长趋势,而且可以作为病害流行预测的依据[24]。目
前对于产孢机制及相关基因的研究已有大量报道,
产孢相关基因Con在多种植物病原物中得到克隆,
如粗糙脉孢菌(NeurosporacrassaXP_961721.2)、
烟曲菌(AspergillusfumigatusXP_001481541.1)
和小麦秆锈菌(PucciniagraminisPGTG_17350.2)
等,Berlin等[25]研究粗糙脉胞菌产孢基因表达,将
差异杂交的阳性克隆子指定为至少2种转录类型,
一种是产孢期转录水平高于菌丝中转录水平,另一
种是仅仅在产孢期可以检测到的转录。Con1,
Con2,Con3和Con4a属于第1种转录类型,而仅在
产孢期发现的Con7,Con8,Con9,Con10a和Con11a
属于第2种转录类型。产孢基因在产孢过程中功能
有差异,如Con6防止孢子休眠[7]、rco-3影响产孢过
程中葡萄糖的转运[13]等。
然而国内对真菌产孢相关研究甚少,目前仍还
集中在生物学特征和致病相关突变体,基因功能鉴
定已经拥有一定基础但是所克隆到基因很少,此外
就是局限于突变体,其系统性不够。小麦条锈菌属
于专性寄生菌,它的产孢模式与其他真菌有所不同。
本研究运用引物Pr1和Pr2以小麦条锈菌基因组
DNA为模板PCR扩增获得产孢相关基因Pscon1
的部分序列,其中以条中32基因组DNA为模板扩
增所得产孢相关基因序列及开放阅读框预测与陈玥
颖等[8]的结果一致,序列同源性达到100%,以其他小
种基因组DNA为模板PCR扩增所得序列与条中32
的结果有个别碱基差异,但个别碱基突变均未引起
193
草　地　学　报 第21卷
图4　不同小种基因Pscon1的序列比对结果
Fig.4　AligningDNAsequenceofgenePscon1indifferentraces
图5　不同小种基因Pscon1荧光定量RT-PCR相对表达量分析
Fig.5　RelativeexpressionofPscon1indifferentphysiologicalracesbyafluorescence-quantitativeRT-PCRassay
293
第2期 司二静等:8个小麦条锈菌生理小种产孢相关基因PsCon1克隆及表达分析
所编码氨基酸水平变化。陈玥颖等[8]推断基因
Pscon1影响条锈菌的芽管和吸器的形成,同时也影
响了条锈菌在侵染过程中的产孢,是一个促进条锈
菌侵染小麦的致病相关基因。由于条锈菌繁菌过程
中发现不同菌系的产孢量有区别,在小麦条锈菌接
种‘铭贤169’后12h多数芽管侵入气孔,形成气孔
下囊,并产生初生侵染菌丝,本研究选取8个生理小
种接菌‘铭贤169’上12h后以荧光定量PCR方法
分析基因Pscon1在各小种中的表达量,结果表明,
基因Pscon1在各小种中均表达,且表达量有差异,
水源11-3中基因相对表达量最高,在条中32中次
之,小种 Hybrid46-8相对表达量则最低,然而室内
繁菌过程中条中33产孢量最大,条中33中该基因
相对表达量低于条中32,基因相对表达量与产孢量
无相关性。相对表达量差异可能对发病后期吸器、
次生侵染菌丝以及次生吸器等形成不同影响。因此
推测基因Pscon1在小麦条锈菌不同生理小种产孢
过程中作用有差异,因为小种间该基因编码区没有
发生改变,因此基因相对表达量差异可能是不同小
种与‘铭贤169’互作的影响。下一步的工作应该是
准确测定不同小种产孢量差异,找出对产孢能力贡
献大的主效基因后对主效基因的表达机制、调控步
骤、表达环境等做深入研究。
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(责任编辑　李美娟)
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