全 文 ：第5卷第 l期
1 8 95 年 5 月
中 南 林 学 院 学 报 vol. 5 N o. 1
J O U RNA L F OC E N TA L R
一
S OF T H US E O RTY RC OL L EG EM ay
.
1 5 5 9
观 光 木 青 枯 病 的 研 究 带
谢宝多
唐明武
曹跃进
刘益峰
轰昔棘 梅文旭
谭勤德
(中南林学院 ) ( 中国林科院广西大青山实验局 )
【摘要 】观光木青枯病于 1 98 0年首次在广西 大青山实 验局 白 云 苗圆
发现 。 此病还危害火力楠 、 广西木莲和山桂花等同科值物 。 经 鉴定 , 本病病
原细菌为茄青青枯假单袍杆 菌的亚洲 变种 , 即 p s e u d o m o n a s s o l a n a c e r u m
v a r a s i a t i e a S t a P P
, 并属 B u d de n h a g e n ( 1 9 6 4 ) 生理小 种 I , H a y w a r d
( 1 9 6 4 ) 生物型 I 。
观光木 ( T s o o n s i o d e n d r o n o d o r u m e h u m ) , 又名香花木 、 香花楠和宿轴木兰 〔` ’ 。
属木兰科常绿乔木 , 是我国特有的古生树种 〔2] 。 其树形优美 、 花大而美观 , 可作庭园
绿化树种。 其木材轻软细致 , 是家具 、 建筑和军工的优良用材 。
1 9 8 0年 , 在中国林科院 广西大青山实验 局进行综合考察期间 , 于 白云苗圃发现观
光木青枯病 , 移栽后 的二年 生苗发病率一般为 30 % , 严重畦 面达 60 % 。 一年生苗发
病率为 6 . 9 % 。 随后 , 又在南宁和柳州发现此病 。 为此 , 我们于 19 8 2 年合作 进行本课
题研究 , 在实验局进行病原菌分离 、 纯化 、 致病力及寄主范围的测定 , 在中南林学院病
理实验室进行病原菌形态观察 、 以及病菌生理 、 生化反应等鉴定工作 。 现将结果整理如
下:
一 、 材 料 和 方 法
(一 ) 材料来派
观光木青枯病菌 ( P T ) 取自广西大青山实验局白云苗圃等地 , 是从移栽苗中的典型
新鲜病株分离而得 , 共七个菌 株 。 作对比实验用的油橄榄青枯病菌 ( P 。 ) 取自柳州三门
江林场 , 从典型油橄榄青枯病株的新鲜侧根分离而得 。 具体情况如表 1所示 。
朴 承谭松山副教授 审阅并提 出宝贵意见 , 遴此致谢 。
DOI : 10. 14067 /j . cnki . 1673 -923x . 1985. 01. 006
1期 观 光 木 青 枯 病 的 研 究 43
表 l供 测 试 菌 株 来 源
菌 株 编 号 分 离 日 期 寄 主 产 地
PT PT - 1 9 8 0
。
9观 光 木 中国林科院广西大青山实验局
PT Z 1 9 8 0
。
1 0白云苗围 。
PTs 1 9 8 0
。
10
P
r` 1 9 8 2。 4观 光 木
P
, 。 19 8 2 。 4
P T 6 1 9 8 2
。
5
P 丁 , 1 98 2 。 5
P o P o - 1 98 2
。 4 油 橄 榄 广西柳州三 门江林场
P 0 2 19 82
。
9
供接种 试验用 的苗 木 、 枝梢来 源为: 观光 木 、 广西木莲 ( M an gl ie t ia t en ul p es
玩 n n d y ) 、 火力楠 ( M i e h e l i a m a e e l u r e i D a n d y ) 、 山桂花 〔aP r a m i e h e l i a ba i l l o n i i
( cD
.
) H u 〕 等二年生无病苗木以及观光木 、 山桂花的无病枝梢 , 取自大青山实验局白
云苗圃或夏石站 ; 白兰花 ( M i e h e l sa a lb a n e . ) 、 黄兰花 ( M i e h e l i a e h a m p a c a L . )
二年生苗木和观光木种子 , 取自凭祥市绿化队苗圃 ; 无病番茄 ( L cy o p or is cu m es cu l e n -
t u m L
.
)
、 茄子 ( S o l a n u m m e l o n g e n L . ) 、 辣椒 ( C a p s i e u m f r u t e s e e n s L . ) , 取自
大青山实验局附近群众菜园 。
(二 ) 病原 , 的分离和培养
取典型病株的根或茎 , 用清水冲洗干净 , 再用 75 %的酒精擦拭 。 然后 , 用灭菌解
剖刀削去表面 , 剪取木质部变色与未变色交界处约 4 毫米的小方块 , 放在肉膝平板培养
基中 , 置 2 8℃恒温培养 24 小时后 , 移至斜面备用 。
(三 ) 病菌致病力及寄主范圈浦定
1
。 枝梢篓蔫检测
取生长旺盛的无病幼树枝条 , 观光木 12 枝 , 火力楠 、 山桂花 、 白兰花 、 黄兰花各
六枝 。 用脱脂棉蘸清水轻轻擦拭茎叶表面 , 然后剪取约 25 厘米长的嫩梢 , 一部分插入
盛有青枯病菌悬浊液的三角瓶中 , 另一部分插入盛有清水的三角瓶中作对照 。
2
。 受病组织带菌检测
取病株侧根木质部变 色处一小块组织 , 放入盛有 5 毫升清水的试管中 , 浸泡 2一 3
分钟后 , 对光观察有无细菌从此病组织中溢出 , 致使清水变浊 。 另取小块无病不变色的
木质部组织置清水中作对照 。
3
. 指示植物萎蔫检测
取蕃茄嫩茎和茄子 、 辣椒苗 , 插入装有青枯 病菌悬浊液的三 角瓶中 , 在室温 28 ℃
条件下观察 4一 6 小时 , 看其是否萎蔫 。 另一部分播入清水中作对照 。
4 4中 南 林 学 院 学 报 6卷
(四 )病旅细 , 的鉴定
根据中国科学院微生物研究所细菌分类组编著的 《一般细菌常用鉴定方法》 、 方中
达 《植病研 究方法 》 、 王大耙 《细菌分类 基础 》 及 (匈 ) .z 吉罗利等 (林传 光泽 )
《植物病理学方法》 进行研究 , 并以新分离的油橄榄青枯病菌作比较试验 。
1
. 病菌形态观察
将牛肉膏蛋白膝琼醋固体培养基 (以下简称肉膝培养基 ) 的 pH 值调至 7 . 2 , 接入
病茵 , 置 28 ℃ 恒温下培养 。 12 一 20 小时后取出菌株 , 作革兰氏 ( G ar m ) 染色观察和
银盐法鞭毛染色观察 ; 细菌生长量用 5 81 一G 型光电比色计观察 ; 色素的产生用修改金
氏 ( K in g ) A 和 B 培养基观察。
2
. 生化测定
糖类发酵试验 : 用 1%蛋白膝液体培养基加 0 . 5% 氯化钠 , 分别加入 1% 不同的测
试糖类 , 用 1 . 6% 澳察香草酚蓝 ( B . T . B . ) 1 毫升作指示剂 , 灭菌后 装于 艾氏发酵管
( E i
n h o : n t u be ) 中接种观察 。
石蕊牛乳试验: 取脱脂牛乳 10 毫升 , 加入 2 。 5 % 石蕊水溶液 4 毫升 , 混合后呈蓝
紫色 , 经间歇灭茵后接种 , 观察至 30 天 。
明胶液化试验 : 用明胶琼脂平板培养基划线接种 , 48 一 ” 小时后 , 用酸性升汞测
定 。
硝酸盐还原试验 : 用 O。 1% 硝酸盐培养基 , 接种培养 2 天后 , 用格利斯 ( G r ie s 一
n此 v ar y ) 试剂和二苯胺试剂滴定。
叫噪产生试验 : 在蛋白膝培养液中 , 接种培养 1一 2 天后 , 用涅斯勒 ( N es sl e )r 试
剂测定氨的产生 , 用柯伐克斯 (K o v ac s ) 法测定叫噪产生 。
M
。
R
。 和 V o P 。 试验 : 在葡 萄 糖蛋白 膝培养 液中 接种 , 培 养 l 天和 2 天后 , 用
0
.
0 2% 甲基红酒精溶液测定能否从葡萄搪中产酸 , 用 5% a一蔡酚试剂和 4 0% 氢氧化钾
水溶液测定乙酞甲基甲醇的产生 。
硫化氢产生试验 : 将病菌穿刺接种 于醋酸铅培养基中 , 培养 2一 3天后 , 观察是否
有黑褐色物产生 。
柠檬酸盐利用试验 : 在柠檬酸盐培养基斜面 上接种 , 1一 2天后观察培养 基是否变
色 。
淀粉水解试验 : 在淀粉琼脂平板培养基上划线接种 , 48 小时后滴加鲁戈尔 ( L u g ul )
氏碘液测定 。
脂肪水解试验 : 用 25 % 蓖麻油乳剂蛋白膝培养基 , 加入中性红作指示剂 , 平板划
线接种 2 天后观察 。
接触酶产生试验 : 在 肉膝斜面菌种上 , 滴加 3% 过氧化氢 , 观察有无气泡产生 。
卵磷醋酶测定 : 取无菌蛋黄置生理盐水中 , 摇匀后加入到 融化后冷却至 50 一 5 ℃
的肉汁膝琼脂培养基中 , 制成平板过夜 , 然后取 18 一24 小时的斜面菌种点接 于平板培
养基上 , 观察菌落周围和下面有无不透明区出现 。
3
。 生态条件测定
1期 观 光 木 青 枯 病 的 研 究 4 5
最适生长温度测定 : 在斜面肉膝培养基上接种后 , 分别置于不同温度下培养 , 比较
观察菌苔的生长量 。
需氧性测定 : 将 0 . 1%葡萄糖酵母琼脂试管培养基置于沸水浴中融化 , 取出冷却至
45 一 4 8 ℃时进行穿刺接种 , 置 26 一 30 ℃恒温下培养 24 一 48 小时 , 观察病菌生长的位置 。
用 H u g h 和 L e i f so n (简称 H )L 法测定 细菌 生长与 空气的关系 : 在蛋 白膝 、 氯化
钠 、 磷酸氢二钾 、 琼醋培养基中加入嗅百里蓝作指示剂 , 参照上法进行穿刺接种 , 加石
蜡油封盖约 1 厘米厚 , 另设同样数量不加石蜡油封盖作对照 , 前后观察二星期 , 确定氧
化产酸和发酵产酸变色区的位置 。
氢离子对细菌影响的测定 : 将病菌分别接种于不同 p H 值的 1%葡萄糖牛 肉汁蛋白
脓培养液中 , 置 28 ℃恒温下培养 24 小时 , 用 58 1一 G 型光电比色计测定混浊度 。
致死温度测定 : 用毛细管法 。 即从 41 一 67 ℃之间 , 每隔 1℃设一个加热处理 , 十分
钟后将毛细管中的菌液吹入肉膝平板培养基上 , 培养 12 一 24 小时 , 观察是否生长 , 从而
找出致死温度 。
二 、 试 验 结 果
(一 ) 病容症状和发生规伸
感病苗木地上部分呈失水状萎蔫 , 顶芽凋萎下垂 , 叶片纵向卷曲 (图版 I 一 l ) ,
逐渐呈枯褐色脱落 。
地下部分须根 、 侧根呈黑褐色腐烂解体 , 拔起病苗时 , 仅残存主根 。 受病主根初期
外表完好 , 木质部则大部分或全部变黑褐 色 , 其横切面数分钟后将出现淡乳褐色的细菌
溢脓 。
据 1 9 8 0一 1 9 8 2 年观察 , 此病害仅见于苗期和幼树 , 未发现危害成年大树 。 在大青
山实验局 , 每年 4 月上旬开始发病 , 5 月中旬达到高峰 , 9一 10 月尚有少量发生 。 在先
年发病的圃地连作时 , 发病尤重 ; 在发病圃地 , 二年生移植苗发病严重 。
(二 ) 病 , 致病力和寄主范围
经枝梢萎蔫检测 , 结果如表 2 所示 。
从表 2 可以看 出 , 白兰花和黄兰花不致病 。 致病的几种林木的感病性为观光木> 山
桂花> 火力楠 > 广西木莲 。 观光木病菌枝梢接种试验结果如 (图版 I一 2 ) 所示 。
用 指示植物萎蔫法检测病菌致病力的结果如表 3 所示 。
表 3 表明 , 病菌悬触液能使蕃茄 、 茄子 、 辣椒迅速致病凋萎 。
感病组织带菌检测结果表明 , 在 2一 3 分钟内 , 病菌从组织中大量涌出 , 使清水呈
乳浊状 。 对照则无此现象 。 说明受病变色组织中的病菌为客观存在 。
(三 ) 病原细菌鉴定
1
。 菌体形态
` 6中 南 林 学 院 学 报 6卷
表 2青枯病菌对不 同寄主的致病力浏 定 ( 9 18 2年 4 月 28日 )
目试扭钧 蔺 液 浓 度 处理枝数 结 果 .
(个/ 班升)
观 光 木 2。 6x0 1吕 4 6 2小时全部费蔫 , 顶梢下垂 , 四天后千枯
死亡 。 ( 图版 I 一 2 )
清水 ( C K ) 4 0 六天后仍全部正常 。
火 力 楠 2 。 6 x 1 0肠 4 4 2 4 小时大部叶片下垂 , 48 小时全部顶梢葵
薄 , 六天后全部干枯 。
清水 (C K ) 3 0 六天后仍全部正常 。
山 桂 花 2。 6 x 1 0 s 4 4 24 小时叶片全部下垂 , 顶梢多蔫 , 四夭
后全郁叶片千枯 。
清水 ( C K ) 3 0 六天后仍全部正常 。
广西木名 2。 6 x 10 8 4 4 2 4 小时大部叶片下垂 , 48 小时后全部顶
梢姜落 , 六天后整枝千枯 。
清水 (C K ) 3 0 六天后仍全部正常 。
自 兰 花 2。 6 x 1 0 s 4 0 ,’ ,
清水 ( C K ) 3 0 , ,
黄 兰 花 2。 6 x 1 0 s 4 0 , ,
摘水 (C K》 3 0 , ,
. 气沮 2 8一 3O. C 。 六天后 将接种致病枝条再行分离 , 可获得相 同病菌 。
菌体呈短杆状 , 两端纯回 。 单生和两个联生 , 无芽抱 , 无荚膜 。 用石碳酸复红染
色 , 两极着 色较 深 , 中间 色浅 。 鞭毛 极生 l一 4根 (图版 I一 4 ) , 其中 l 根 的占
3 2
.
8% , 2 根的占 3 8 。 4% , 3 根的占 2 2 . 4% , 4 根的 占 6 . 4% , 长 度为 4 . 4一 9 . 8 微
米 , 平均 6 . 03 微米 。 革兰 ( G ar m ) 氏染色呈阴性反应 ( G 一 ) , 个体大小为 。 . 5一 1 . 。
x l
。
1一 2 。 5 微米 , 平均为 0 。 7 3 x l 。 6 3 微米 。
2
. 培养性状
在肉膝琼脂 平板培养基上 , 菌落圆形 , 培养 24 小时直径为 3一 6 毫米 。 菌落边缘
1 期
表 3
观 光 木 青 枯 病 的 研 究
青枯病菌村 几种指示植物的致病力浏定 ( 1 8 2 9年 5月 4 日 )
指示植物 菌液浓度 (个 /奄升 )处理株数 发病株 数 结 果 中
落 茄 2。 5 8 x1 0吕 3 34 小时内口葵
清水 (C K) 3 06天后仍正常
茄 于 2。 5 8 x1 08 34 3小时内调英
清水 ( C K) 06天后仍正常
辣 椒 4 3 3小时内摘姜
清水 ( C K) 3 06天后仍正 常
. 当夭气退为 28℃
整齐 , 较薄 , 中央稍隆起 。 呈灰乳 白色 , 表面光滑 , 不透明 , 质不粘 , 有特殊的微臭气
味 。 在马铃薯块斜面培养基上生长 良好 , 菌苔淡乳褐色 , 表面光滑 、 湿润 , 边缘较薄 ,
中央突起较高 , 部分 ( 5 /的 菌株可产生水溶性色素 , 使薯块培养基呈暗绿色 。 但在修
改金氏 ( iK n g ) A 和 B 培养基上 , 均无色素产生 。 在鉴别性培养液 , 即乌兴斯基 ( U sc h -
n s k y ) 氏 、 费美 ( F e r m i ) 氏和孔 ( C o h n ) 氏培养液中生 长状况不一 , 具体结果如表
4 所示 。
表 4 在鉴别性培养液 中生长状况 ( 19 8 2 年 5 月 2 0 日 )派 U s e h i n s k y F e r m i C o il n 注接 种 C K 接 种 C K 接 种 CKP , 8 1。 7 9 8 。 0 9 0 。 2 7 9 7。 7 9 2。 1 7 9 6。 0 4 2 号毖色片 燕馏水作对照
P o 8 6
一
3 9 8
。
0 8 9
。
5 0 9 7
。
7
·
9 1
。
6 7 9 6
。
0 ,
从表 4 可以 看出 , 观光木青 枯病菌和 油橄榄青 枯病菌的 生长量基 本一致 , 即在
U s c h i n sk y > 决 r m i > C o h n 。
3
, 生态性状
生长适温为 1 0一 42 ℃ , 最适温度为 3 一 35 ℃ , 致死温度为 53 ℃ 十分钟 。 适宜 的
p H 为 4 . 4一 8 。 4最适的 p H 6 . 0一 7 . 6 。 好气性 , H L 试验为兼性厌氧性 。
4
。 理化反应
经观察 , 生理生化反应结果如表 5 、 6 所示 。
根据以上实验结果 , 按照 eB r g ey ` s 《细菌鉴定手册 》 第八版和 H · A · K p ac HbIJ H。 。 ,
4 8 中 南 林 学 院 学 报 5 卷
表 5 格 类 发 醉 试 脸 结 果 . 1 9 8 2 年 6 月 3 日汉 单 精 二 搪 三锗 多锗 箱 醉 类. 。 。 。 D 乳 麦 蔗 棉 淀 丙 甘 山初 阴 U L, l 队 月 uI 芽 子 粉 三 峪 梨一 拉 1 1 、 L 一 ~ ~ 钻 精 糖 糖 醉 醉 醉侧 伯 木 果 言 牛 璐 米自臼 由臼 山日之 自 臼 呀` 白山 山 . d日 ., 日 刁日 甲日 ,侣 翁` 刁西 甲践 ,比勺口
P T A G 人 人G A G A G 一 人 G 一 A A G A G A A G 人 G
P o 人 G A A G 人 G 人 G 一 A G 一 一 一 A G 人 人 A
CK (不接种 )
. “ 人 ” 一产徽 , “ G ” 一产气 , “ 一 ” 无变化 。 其中少数项 目与南玉生等人 ( 1 9 8 1 ) 发表的结果
不相同 , 这是我们重作 丁二次的结采 。
表 6 主 要 生 理 生 化 反 应 浏 定价 ( 19 8 2 年 5 月 )
介明 硝 产 引 M V 产 柠 水 月旨 卵 接 石 蕊牛乳反应胶 酸 氛 噪 R P 硫 橄 解 肪 礴 触液 盐 产 反 反 化 酸 淀 水 脂 醉化 还 生 应 应 级 盐 粉 解 反 反原 利 应 应用
P ·
{
一
1
· + 一
}
一
{
· 十 + 一
!
一
{
- · 卜 P 、 人 r
P 。
}
一
1
· + 一
{
· + + ·
}
s
、
P
、
A r ”
C K `不 , 种小 卜 一 }一 }- 一 }一 } - 一
. “ + ” 为正反应 , “ 一 ” 为负反应 , “ S ” 为报固 , ` P ” 为膝化 ,
均产酸变红
“ 人 r ” 产酸变红 。
二 1 9 8 2 年 9 月 , 在柳州三门江林场 , 用宜作二次洲定 , (人 r ) 。
《细菌和放线菌的鉴定 》 方法 。 可以认为 , 观光木青枯病菌应属 青枯假单胞菌 〔P se u d 。 -
m o n a s s o l a acn
e a r u m ( s m i t h ) s m i t h 〕 。 又因其能稳定地使石蕊牛乳凝固变红 , 故应属
青枯假单胞菌的亚洲变种 ( p . s o af n ac ae r u m v a r . a s i a t i e a s t a p p ) 。
依照 B u d de n h ag e n 和 K e lm a n 按寄主范 围将青枯假单胞菌划分为三个生理小种的方
法 , 根据观光木青枯病菌能使蕃茄 、 茄子和辣椒等茄科植物迅速致病萎蔫的特性可知 , 此
菌应属于生理小种 I 。 由于观光木青枯假单胞菌能利用半乳糖 、 山梨醇和甘露醇 , 并使
其产生酸 。 同时表现出的对 D一木搪 、 麦芽糖 、 半乳搪 和乳糖的利用 能力较强 。 根据
H ay w ar d 依该菌使糖产酸和脱氧作用 , 而将其划分为 4 个生物型 ( iB ot y p ” ) 的方法 ,
可以认为 , 该菌与价 y w a dr 生物型 I 相吻合 。
综 上所述 , 观光木青枯病的病原细菌是茄青枯假单胞杆菌的 亚洲变种 , 并属 B du d -
e n h a g e n ( 2 9 6 4 ) 小种 I , H a y w a r d ( 1 9 6 4 ) 生物型 I 。
l 期 观 光 木 青 枯 病 的 研 究 49
三 、 结 语 与 讨 论
(一 ) 观光木青枯病主要危害观光木的苗木和幼树 , 还能危害火力楠 、 山桂花和广
西木莲等木兰科 ( M a g n of i ac e a e ) 林木 。 病株地上部分干枯 、 落叶 , 地 『部分从须根至
主侧根 , 最后主根逐渐病腐解体 , 直至整株死亡 。 病株根颈木质部呈黑褐色 , 并迅速出
现细 菌溢脓 。
(二 ) 观光木青枯病的病原细菌属青枯假单胞杆菌亚洲变种 ( sP eu do m o an s so la an 一
C e a r u m v a r
. a s i a t i a S t a p p )
, B u d d e n h a g e n 和 K e lm a n 生理小 种 I , H a y w a r d 生物 型
l
。 近年来 , 由于采用变种常常产生混乱 〔 , 2】 , 学术界对 “ 变种 ” 一词已少用或慎用 。
经实验证实 , 观光木青枯病病原细菌的亚洲变种分类特性稳定 , 可作为分类的依据 。
(三 ) 在广西南部 , 每年 4一 n 月为观光木青枯病发病期 , 5 月 中旬达到高峰 。 据
观察 , 本病主要由土壤带菌传病 , 从移栽受伤的根系侵入植株 。
参 考 文 献
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中0 5 南 林 学 院 学 报 5 卷
STU D Y O B FA C T IA L E RW IL T O F
sT
o o n g i o d e n d r o n o d o r u m
X i e B a o d u o T a n g M i n g w u C ao Y u e j i
n L i u Y i f e n g
( C e n t r a l一o u t h Fo t e s t r yC o l le ge )
N i e X i li n M e i W
e n x u T a n Q i n d e
( D ag i n g s h an M t
。
Fo r
。
Fx p
。
St a
。 ,
C h i n e s e A e a d e o v o f F o r e s t r y )
AB S T R AC T
T h e d i se a s e w a s f i r s t d i s oc v
e r e d i n s o u t h G u a n g x i i n 19 8 0
。
I t a l s o a t t a e k s
M i c h e l i a m a c c lu r e i
,
M a
n g l`e t i a t e 抢“ i夕e s , P a r a 阴 i e h e l` a b a `110 ” “ a n d s o m e
ot h e r t r e e s o f M a g n o l i a e e ae
.
Id e n t i f i e a t i o n o f t h e P a t h o g e n s h o w s t h a t i t be l o n g s
t o B u d d e n h a罗 n ( 1 9 6 4 ) P h y is o l o ig e a l R a e e 1 a n d H a y w a r d ( 19 6 4 ) B i o t y Pe 111 o f
P s e “ d o 阴 o n a s s o l a n a c e a r u 沉 v a r 。 a s i a t i c a S t a P P 。