全 文 ：第 16 卷
第 1 期

Vol. 16
No . 1
草
地
学
报
ACTA AGRESTIA SINICA



2008 年
1 月

Jan.

2008
紫花与杂花苜蓿再生影响因子的比较研究
张静妮, 王铁梅 , 卢欣石* , 马晖玲
(北京林业大学林学院, 北京
100083)
摘要: 对紫花苜蓿( Med icago sativa L. ) (秘鲁、关中、甘农 3 号)及杂花苜蓿( Med icago v ar ia Mar tyn) (甘农 1 号、
甘农 2号)组培再生体系各影响因子进行比较研究。结果表明: 紫花、杂花苜蓿的组培再生能力差异较大, 前者显
著高于后者;在愈伤组织诱导中, 子叶节是最佳的外植体材料; 2, 4-D浓度增加对紫花苜蓿出愈率影响不明显,但杂
花苜蓿的出愈率随着 2, 4-D 浓度的增加呈明显的升高趋势; 紫花苜蓿的最佳愈伤组织诱导培养基为 MS+ 2, 4-D
2. 0 mg/ L+ 蔗糖 30 g/ L ,诱导率均在 95%以上; 杂花苜蓿为 MS+ 2, 4-D 4. 0mg / L+ 蔗糖 30 g / L ,两个品种诱导率
分别为 65. 6%、73. 3% ; 5 个品种的最适分化培养基均为 M S+ KT 1. 0 mg/ L + NAA 0. 5mg/ L+ 蔗糖 20 g / L 或
MS+ BA4. 0 mg / L ,分化率也各有差异,紫花苜蓿不定芽的分化率可达到 70%左右, 而杂花苜蓿在 30% 左右;最佳
诱导生根的培养基为 1/ 2MS+ IBA 1. 0 mg / L ;本研究建立了紫花苜蓿高频再生组织培养体系, 为实现外源基因的
高效遗传转化奠定基础;通过紫花苜蓿和杂花苜蓿的再生体系影响因子的比较研究, 为杂花苜蓿再生体系的建立
提供参考。
关键词: 紫花苜蓿; 杂花苜蓿; 再生体系
中图分类号: S551. 7




文献标识码: A




文章编号: 1007-0435( 2008) 01-0045-05
Comparative Study on the Regenerative Factors of Medicago stavia
and Medicago varia
ZHANG Jing-ni, WANG T ie-mei, LU Xin-shi* , M A Hu-i lin
( Fores try College, Bei jing Forest ry Univer sity, Beijing 100083, Chin a)
Abstract: T he regenerat ive systems of Medicago satv ia L. ( cv. Peru, Guanzhong, and Gannong No. 3)
and Medicago var ia Martyn( cv. Gannong No. 1 and Gannong No. 2) w ere comparat ively studied by this
paper. T he results show that the regenerat ive ability w as evident ly differ ent betw een M. satvia and M.
var ia w ith the former w as remar kably higher than the latter. T he cotyledon w as the opt imal explant mate-
r ial and the 2, 4-D level had the less ef fect no the callus induction o f M. sat iv a, but that of M. varia was
ev ident ly enhanced w ith the increased concentrat ion of 2, 4-D. T he effect iv e medium for inducing callus of
M. satvia was M S supplemented w ith 2. 0 mg/ L 2, 4-D and 30 g/ L sucro se, and the inducing rate w as a-
bove 95% . M . v ar ia had higher callus inducing rate on medium M S supplemented w ith 4. 0 mg/ L 2, 4-D
and 30 g/ L sucr ose, and the inducing rate was 65. 6% and 73. 3%. T he opt imal different iat ion medium of
these 5 cult ivars w as M S containing 1. 0 mg/ L KT , 0. 5 mg/ L NAA, and 20 g/ L sucrose but the dif feren-
t iat ion r ate of the cult ivars of M . satvia was about 70% and that of M. var ia was 30%. The ef fect iv e ro ot
inducing medium was 1/ 2 M S supplemented w ith 1. 0 mg / L IBA. T his resear ch established a high regener-
at ive system fo r M . satv ia which could be the base for g enet ic tr ansformat ion; at same t ime, it also pro-
v ided the basic informat ion to the establishment of effect ive regenerat ion system for M. v ar ia.
Key words: M edicago sat iv a L. ; M edicago varia Martyn; Regenerat ion sy stem


苜蓿属在全世界分布有 60余个种,其中紫花苜
蓿(Medicago sativa L. )和杂花苜蓿(Medicago varia
Martyn)是在生产中利用最为广泛的两个种,杂花苜蓿
由紫花苜蓿与黄花苜蓿 (Medicago f alcata L. )杂交培
收稿日期: 2007-05-24; 修回日期: 2007-09-21
基金项目:
十一五
科技支撑计划课题( 2006BAD01A19)
作者简介: 张静妮( 1979-) ,女,陕西户县人,博士研究生,研究方向为牧草生物技术, E- mail : gsauzjn@ 163. com; ﹡通讯作者 Author for
correspondence, E-mail: luxinshi304@ 126. com
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育而成,它既有黄花苜蓿的优良抗性基因,又具有紫
花苜蓿优良的农艺特性, 在畜牧业生产和生态建设
中得以广泛应用。近年来, 生物技术的应用极大促
进了苜蓿品种改良,苜蓿高频再生体系的建立将为
外源基因转化提供重要的基础条件,紫花苜蓿和杂
花苜蓿作为不同的种, 在组织培养过程中的再生能
力及对各再生因子要求存在差异。因此, 有必要开
展对紫花苜蓿和杂花苜蓿的再生体系影响因子的比
较研究。
我国于 20世纪 80年代初开始苜蓿组培再生的
研究。1981年上海植物生理所杨燮荣用 MS 培养
基成功地进行了国内首例紫花苜蓿的组织培养 [ 1]。
之后李聪等人对品种、外植体选择、激素配比等开展
了相关研究[ 2]。近年来, 我国在苜蓿再生体系建立
的主要研究成就包括:再生时间缩短,再生时间由最
初的七个月缩短到 60- 70 d [ 3] ;再生率提高, 紫花苜
蓿再生率已达到 90%以上[ 3, 4] ; 原生质体培养技术
的研究,初步建立了紫花苜蓿与黄花苜蓿原生质体
培养与植株再生方法体系 [ 5, 6]。但多年来对杂花苜
蓿再生体系建立的研究较为稀少, 仅祝建波等[ 7] 对
新疆塔城杂花苜蓿再生体系的建立进行了初步研
究。本文探讨培养基及外植体种类、外源激素水平
等外界因子对紫花、杂花苜蓿品种再生的影响,以明
确两种苜蓿再生因子差异, 从而为建立高效杂花苜
蓿再生体系提供基础。
1
材料与方法
1. 1
试验材料
本试验选择了秘鲁苜蓿、关中苜蓿、甘农 3 号 3
个紫花苜蓿及甘农 1号、2 号 2个杂花苜蓿品种作
为试验材料,种子由甘肃农业大学曹致中教授提供。
1. 2
试验方法
1. 2. 1
无菌苗的培养
选籽粒饱满、种皮无破损的
苜蓿种子,自来水冲洗干净后, 在 70%的酒精中浸
泡 1 min, 无菌水漂洗 30 s, 转入 0. 1%的升汞中振
荡 5 min,再用无菌水冲洗 5次,用灭菌滤纸吸干种
子表面的液体后接种到无激素的 MS培养基上。培
养条件为光周期 16 h, 光照强度 3000~ 4000 lx , 温
度 25
,待无菌苗培养两周后分别取外植体材料进
行试验,外植体诱导 25 d后统计愈伤组织诱导率
(暗培养 15 d,光照培养 10 d)。再将愈伤组织转入
分化培养基, 25 d后统计分化率; 将再生苗转入生
根培养基, 20 d后统计生根情况。
1. 2. 2
试验设计
1. 2. 2. 1
愈伤组织的诱导
选取秘鲁、关中、甘农 3
号 3份紫花苜蓿品种及甘农 1号、2号两份杂花苜蓿
品种为试验材料,最初研究 MS、SH、WPM、B5、N6 这
5种不同培养基对愈伤组织诱导的影响,且培养基中
分别添加2, 4-D 2. 0 mg/ L 和蔗糖 30 g/ L; 之后分别
选取5个品种叶柄(长 3~ 5 mm)、叶片( 3~ 5 mm2 )及
子叶节(长 3~ 5 mm)和子叶( 3~ 5 mm2 )为外植体
材料,研究不同外植体类型对愈伤组织诱导的影响,
培养基为 MS附加 2, 4-D 2. 0 mg/ L。以 MS为基本
培养基,附加 0. 1 mg/ L NAA, 2, 4-D浓度( mg/ L)设
置为 4个水平( 0. 5, 1. 0, 2. 0, 4. 0) ,以研究不同2, 4-D
浓度对愈伤组织诱导的影响。文中每个处理均设 3
次重复,每次重复 45个外植体, 每皿放置 15个。
1. 2. 2. 2
愈伤组织的分化
在愈伤组织分化阶段,
以 MS 为基本培养基, 分别设计不同 KT ( 0. 1、
0. 5 mg/ L )、NAA( 0. 3、0. 5 mg/ L )浓度及其配比、
不同 6-BA 浓度( 0. 5、2. 0、4. 0 、6. 0 mg/ L ) , 研究其
对愈伤组织分化的影响。
1. 2. 2. 3
再生苗的生根
在苜蓿的生根培养中常
用的生长素是 IBA 和 NAA,本实验以 IBA 为生根
诱导激素,在 1/ 2M S培养基上附加不同浓度的 IBA
( 0、0. 5、1. 0、2. 0、3. 0 mg / L ) ,探讨其激素水平对生
根诱导的影响。
2
结果与分析
2. 1
愈伤组织的诱导
2. 1. 1
不同培养基对愈伤组织诱导的影响
5种
不同培养基对愈伤组织诱导影响试验结果见表 1。
结果表明, 附加 2. 0 mg/ L 2, 4-D的 5种不同基本培
养基对 5个苜蓿品种子叶节愈伤组织的诱导效果存
在明显差异。在 MS 培养基上, 各品种能不同程度
的形成愈伤组织, 且紫花苜蓿的出愈率都在 90%以
上; M S之上的愈伤组织出现的最早,颜色为淡黄色
且质地松软。甘农 1 号、2号杂花苜蓿在其它 4种
培养基上均未形成愈伤组织, 外植体在生长 1周后
逐渐白化死亡。表明 MS 是紫花、杂花苜蓿品种的
最佳愈伤组织诱导培养基。
2. 1. 2
外植体对愈伤组织形成的影响
在附加 2,
4-D 2. 0 mg / L 的 MS培养基上,不同品种及同一品
种的外植体间出愈率差异较大(图 1)。甘农 1号、2
号杂花苜蓿各外植体出愈率均明显低于秘鲁、关中、
甘农 3号 3份紫花苜蓿;秘鲁、关中的出愈率由高到
低依次为:子叶节、子叶、叶柄、叶片; 甘农 1号、2号
46
第 1期 张静妮等:紫花与杂花苜蓿再生影响因子的比较研究
和 3号的出愈率由高到低依次为: 子叶节、叶柄、子
叶、叶片。可以看出各紫花及杂花苜蓿品种均以子
叶节的出愈率最高,叶片的出愈率最低,子叶和叶柄
次之。
表 1
培养基对愈伤组织诱导的影响
Table 1
Effect of differ ent medium on callus induction
培养基类型
M edium type
出愈率( % ) Callus induct ion rate, %
秘鲁
Peru
关中
Guanzhong
甘农 3号
Gann on g No. 3
甘农 1号
Gannong No. 1
甘农 2号
Gannong No. 2
MS 100. 0 96. 7 92. 2 33. 3 42. 2
SH 95. 5 78. 9 45. 5 0 0
WPM 88. 9 93. 3 0 0 0
B5 84. 4 78. 8 0 0 0
N 6 63. 3 16. 7 0 0 0
图 1
外植体对愈伤组织诱导的影响
Fig . 1
Effect of different explants on callus induct ion
2. 1. 3
2, 4-D 浓度对愈伤组织形成的影响
与空
白相比较,添加 2, 4-D对 5个品种的出愈率影响明
显,但 2, 4-D浓度的增加对不同品种的影响不同(表
2)。在不含 2, 4-D的空白处理中,秘鲁、关中和甘农3
号的出愈率分别为 44. 4%、22. 4%、12. 2% ,而杂花苜
蓿不形成愈伤,外植体从子叶节两端的伤口处逐渐褐
化死亡;当 2, 4-D的浓度为0. 5 mg/ L时,秘鲁、关中、
甘农3号 3个紫花苜蓿品种的出愈率急剧增加, 分别
达到 100%、94. 4%、80% ,而此时杂花苜蓿的出愈率
均在 20% 左右; 随着 培养基 中 2, 4-D 浓 度
的增加, 秘鲁苜蓿和关中苜蓿两份紫花苜蓿品种在
各浓度下均分别保持了 100%、90%以上出愈率;
甘农 3号有缓慢上升趋势, 出愈率上升至 95. 6% ;
而甘农 1号、2 号升高的趋势明显, 当培养基中 2,
4-D浓度达到 4. 0 mg/ L 时,甘农 1号、2号的出愈
率分别达到 65. 6%、73. 3%。可以看出, 2, 4-D浓
度的高低对两份杂花苜蓿品种愈伤组织诱导的影
响较大, 表明高浓度的 2, 4-D 对杂花苜蓿品种愈
伤诱导有一定促进作用, 但对紫花苜蓿品种愈伤
诱导无明显作用。
图 2
2, 4-D浓度对愈伤组织形成的影响
F ig. 2
Effect of 2, 4-D concentr ation on callus induction
表 2
KT、NAA浓度配比对芽分化的影响
T able 2
Effects of KT、NAA concentr ations on buds induct ion
激素处理 H ormone t reatment 芽分化率( % ) Buds in duct ion rate, %
KT NAA
秘鲁
Peru
关中
Guanzhong
甘农 3号
Gann ong No. 3
甘农 1号
Gannong No. 1
甘农 2号
Gannong No. 2
0. 1 0. 3 55. 0 56. 7 65. 0 21. 7 25. 0
0. 1 0. 5 48. 0 50. 0 51. 7 16. 7 20. 0
0. 5 0. 3 68. 3 66. 7 70. 0 31. 7 35. 0
0. 5 0. 5 58. 3 60. 0 66. 7 23. 3 28. 3
2. 2
芽的分化
2. 2. 1
KT、NAA 浓度配比对芽分化的影响
如
表 2,在 NAA 浓度为 0. 3 mg/ L 时, 各品种的芽分
化率均高于 0. 5 mg / L 时的分化率;在 KT、NAA两
个因素的共同作用下, 以 0. 5 mg / L KT 和 0. 3 mg /
L NAA 的组合最适于芽的分化及生长,分化芽的高
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度及数量均优于其他浓度组合, 且分化率都高于单
独使用 KT 时的分化率。将 5个品种分化出的不定
芽,转入各自相应的培养基, 其成苗率没有明显差
别,分化出的芽基本上都可以再生植株。
图 3
6- BA浓度对体细胞胚形成( A)及体细胞胚分化成苗( B)的影响
F ig. 3
Effect of 6-BA concentr ation on somat ic embryos induction ( A ) and buds induct ion ( B)
2. 2. 2
6-BA 浓度对体细胞胚形成及分化成苗的影
响
苜蓿形成体胚的能力由其基因型决定, 不同品
种间,胚性愈伤组织的诱导率差别很大[ 8]。从图 3
( A)可知,在低浓度的 6-BA( 0. 5 mg / L )条件下, 除
甘农 1号、2号杂花苜蓿体细胞胚形成率较低外(分
别为 16. 4%、25. 5% ) , 3份紫花苜蓿品种体细胞胚
形成率均在 50%以上,且秘鲁苜蓿每块愈伤组织上
诱导的平均体胚数为 4. 5 个; 当 6-BA 浓度增加到
4. 0 mg / L 时,各品种的体胚形成率均达到最高, 且
平均每块愈伤组织上分化出的体细胞胚的数目均大
于 3, 秘鲁和甘农 3号的愈伤组织表面则布满了球
形体细胞胚, 说明高浓度的 6-BA 对愈伤组织的分
化有一定的促进作用。但将分化的愈伤组织继续转
入含相应 6-BA 浓度的继代培养基中后发现, 体细
胞胚在不同激素浓度下进一步分化出不定芽的能力
差异显著,见图 3( B) , 当 6-BA 浓度为 0. 5 时, 5 个
品种形成的体细胞胚均可不同程度的分化出正常小
苗,随着激素浓度的增加,分化出的多数芽发生玻璃
化现象,整个芽呈半透明状,难以分化成正常小苗,
最终导致成苗率的降低, 紫花苜蓿的分化率降低到
20%左右,而两个杂花苜蓿品种都不能分化出正常
小苗。
2. 3
IBA 浓度对生根的影响
从图 4 可以看出, IBA 浓度在 0 到 1 mg/ L 的
范围内,生根率随浓度的增加而升高, 当 IBA 浓度
在 1~ 2 mg/ L 之间时,只有甘农 2号生根率继续升
高,但在此浓度下每个植株上形成的根数较低浓度
下的少,且根的生长缓慢; 当 IBA 浓度大于 2 mg / L
时,所有品种根的诱导率均呈下降趋势; 在 1 mg / L
IBA 的条件下,生根最早, 根的长势好, 多数根粗大
且较长。据此认为, IBA 浓度为 1. 0 mg/ L 时,最利
于各苜蓿品种根的诱导及生长。
图 4
IBA浓度对生根的影响
F ig . 4
Effect o f IBA concentr ation on r oot ing rat e
3
讨论与结论
3. 1
本试验选用 3 份紫花苜蓿及 2 份杂花苜蓿为
试验材料,建立其高效再生体系, 结果表明: 苜蓿再
生体系中最佳外植体为子叶节, 紫花苜蓿的最佳愈
伤组织诱导培养基为 MS+ 2, 4-D 2. 0 mg / L+ 蔗糖
30 g/ L , 杂花苜蓿的最佳愈伤组织诱导培养基为
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第 1期 张静妮等:紫花与杂花苜蓿再生影响因子的比较研究
MS+ 2, 4-D 4. 0 mg/ L+ 蔗糖30 g/ L, 5个品种的最适
分化培养基均为MS+ KT 1. 0 mg/ L+ NAA 0. 5 mg/
L+ 蔗糖 20 g/ L 或 MS+ BA 4. 0 mg/ L。试验中紫
花、杂花苜蓿最高再生率分别可达 100%和 73. 3%。
3. 2
紫花苜蓿品种的愈伤组织诱导和脱分化能力
均显著高于杂花苜蓿, 本研究中紫花苜蓿品种再生
率均达到 95%以上, 而杂花苜蓿再生率最高仅为
73. 3%, 两种苜蓿之间的再生率存在较大差异。以
往研究表明,对于某些通过杂交获得的植物, 如果两
个亲本体细胞胚的诱导率都理想,则其杂种后代的
诱导率也相应较高,这种现象已在大豆和玉米花药
培养中有过报道[ 9, 10]。另外, Bingham 等也证明苜
蓿愈伤组织的植株再生能力可高度遗传[ 11] ,杂花苜
蓿作为紫花苜蓿和黄花苜蓿的杂交后代, 黄花苜蓿
基因的渗入使其再生能力与紫花苜蓿的再生有了较
大差异,两种苜蓿遗传特性的差异使其再生能力有
所不同。
3. 3
在植株再生过程中,紫花和杂花苜蓿对培养基
类型、外植体及蔗糖浓度要求一致,但对外源激素浓
度如 2, 4-D要求有一定差异, 高浓度的 2, 4-D 对杂
花苜蓿品种愈伤诱导有一定促进作用, 但对紫花苜
蓿品种愈伤诱导无明显作用。激素是诱导体细胞胚
发生的决定性因子,它通过细胞信号转导而影响胚
胎特异基因表达 [ 12] ,本研究结果表明杂花苜蓿再生
对 2, 4-D浓度要求较高, 同时也说明杂花苜蓿基因
型愈伤组织的诱导和分化的最适诱导条件与紫花苜
蓿不同,需进一步研究其与内在机制适宜的诱导条
件,寻找启动杂花苜蓿控制细胞脱分化基因表达的
最佳外界条件。
参考文献
[ 1]
杨燮荣,合根福,周荣仁.苜蓿组织培养再生植株[ J] .植物生理
学通讯, 1981, ( 5) : 33-34
[ 2]
李聪,熊德邵,耿华珠.苜蓿愈伤组织再生植株的研究[ J] .中国
草地, 1989, ( 3) : 51-56
[ 3]
张万军,王涛.紫花苜蓿愈伤成苗高频再生体系的建立及其影
响因子的研究[ J] .中国农业科学, 2002, 35( 12) : 1579-1583
[ 4]
马晖玲,卢欣石,曹致中,等.紫花苜蓿不同栽培品种植株再生
的研究[ J] .草业学报, 2004, 13( 6) : 99-105
[ 5]
舒文华,耿华珠, 孙勇如. 紫花苜蓿原生质体培养与植株再生
[ J] .草地学报, 1994, 2( 1) : 40-44
[ 6]
白静仁,何茂泰,袁清,等.野生黄花苜蓿叶肉原生质体培养和
植株再生[ J] .草地学报, 1994, 2( 1) : 59-63
[ 7]
祝建波,朱先灿,崔燕,等.杂花苜蓿高效再生体系的建立 [ J ] .
作物杂志, 2006, (5) : 14-18
[ 8]
王玉民,刘艳芝,夏彤.等.苜蓿子叶体细胞胚的诱导和植株再
生[ J] .草地学报, 2005, 13( 1) : 79-81
[ 9]
赵桂兰,刘艳芝,尹爱平.大豆花药培养中体细胞胚萌发的研究
[ J] .科学通报, 1998, 43( 14) : 1512-1516
[ 10] 颜昌敬.农作物组织培养[ M ] . 上海: 上海科学技术出版社,
1991. 283-299
[ 11] Elt jo G M, Brow n G M M. Role of ex ogenous reduce nit rogen
an d sucros e in h igh f requ ency somat ic emb ryogenesis in Medi-
cag o sat i v a [ J ] . Plant Cell Tis sue Organ Cultur e, 1987, 10:
11-19
[ 12] 袁澍,贾勇炯,林宏辉.诱导植物体细胞胚发生的几个生理因素
[ J] .植物生理学通报, 2003, 39( 5) : 508-512
(责任编辑
梁艳萍)
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