全 文 :第 19 卷 第 4 期
Vol. 19 No. 4
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2011 年 7 月
Jul. 2011
假俭草耐寒变异体的筛选及其生理鉴定
刘明稀1, 2, 卢少云2, 3 , 郭振飞2, 3*
( 1. 湖南农业大学,湖南 长沙 410128; 2. 华南农业大学生命科学学院, 广州 510642;
3. 华南农业大学广东省森林植物种质创新与利用重点实验室 , 广州 510642)
摘要:对假俭草( Eremochloa op hiur oides ( Munro) Hack. )胚性愈伤组织进行反复间歇低温处理并结合长期继代,
诱导体细胞无性系变异的发生。通过人工气候箱低温筛选,在再生群体中获得 5 个耐寒性提高的变异植株。结果
表明:低温处理前各耐寒变异植株及其对照植株间最大光化学效率( F v / Fm )、相对电导率、丙二醛( MDA )含量、超
氧物歧化酶( SOD )和过氧化氢酶( CAT )活性差异不显著。低温处理后所有植株的 F v / Fm 均下降, 相对电导率和
MDA 均升高,但耐寒变异体植株的 F v / Fm 高于对照植株,相对电导率和 MDA 含量低于对照植株, 表明耐寒植株
受低温冷害程度较轻。SOD和 CAT 的活性在低温处理后均升高,但耐寒变异体植株的 SOD 和 CAT 活性均高于
对照。因此,耐寒突变体的耐寒性与其 SOD和 CAT 对低温的响应更敏感有关, 并首次初步表明体细胞无性系变
异技术在假俭草抗寒性改良育种中具有可行性。
关键词:假俭草; 体细胞无性系变异;耐寒性; 抗氧化酶
中图分类号: Q319. 2 文献标识码: A 文章编号: 1007-0435( 2011) 04-0652-06
Chilling- tolerant Variants Screening and Physiological
Identification of Centipedegrass
LIU M ing-x i1, 2 , LU Shao-yun2, 3 , GU O Zhen- fei2, 3*
( 1. H unan Agricultural University, C han gsha, H unan Provin ce 410128, C hina;
2. College of Life Sciences, South China Agricul tu ral Un iversity, Gu angzhou, Guangdong Provin ce 518020, China;
3. Guangdong Key Lab oratory for In novat ive Developm ent an d Ut il izat ion of Fores t Plant Germplasm,
South China Agr icultural University, Guangzh ou , Guangdong Province 510642, Ch ina. )
Abstract: Cent ipedeg rass ( E remochloa ophiuroides ( M unro ) Hack. ) is an impor tant w arm-season turf-
g rass species orig inat ing in China, however, its suscept ibility to co ld st ress limited its pract ical applica-
t ion. In this paper, select ion and identif icat ion o f somaclonal v ar iants of centipedeg rass having an increased
chilling tolerance w er e invest igated. Embr yogenic calli w ere subject to repeated interval cold- treatments in
combination w ith long- term subcultures for induct ion of somaclonal variat ion. F iv e individual variants w ith
impr oved chilling to lerance w ere selected and identif ied. T heir phy siolog ical responses to chilling w er e fur-
ther measur ed. There w as no signif icant differ ence in max imal photochem ist ry eff iciency of photosystem
( Fv / Fm ) , io n leakage, malondialdehyde ( MDA ) content, and act ivit ies of super oxide dismutase ( SOD)
and catalase ( CA T) betw een the five variants and their w ild type contro l plants pr io r to chilling t reatment.
After chilling t reatment at 6~ 8 for 20 d, all plants show ed a decrease in Fv / Fm and increase in ion leak-
age and MDA content, w hile variants show higher levels of F v/ Fm and low er levels o f ion leakage and
MDA content than the control plants, indicating that less chilling injur y occurred in the chilling- to ler ant
variants. Chil ling t reatment incr eased act ivit ies of SOD and CAT in all plants, indicat ing a response of
ant iox idant enzymes to chilling in cent ipedeg rass, while there were higher activit ies of SOD and CAT in tested
收稿日期: 2011-02-22;修回日期: 2011- 04-03
基金项目:广东省科技计划项目( 2006B20201035) ;湖南农业大学校青年基金( 10QN30)项目资助
作者简介:刘明稀( 1975- ) ,男,湖南新化人,讲师,博士,主要从事草坪草、牧草及能源草生物技术育种, E- mail: lmx 751221@ 163. com; * 通
讯作者 Author for correspondence, E-mail: zhfguo@ scau. edu . cn
第 4期 刘明稀等:假俭草耐寒变异体的筛选及其生理鉴定
variants than the control plants. T his suggests that the increased chilling tolerance in the five variants is
asso ciated w ith the enhanced up-r egulated act iv ities of SOD and CAT. Fur ther, results suggest the tech-
nolo gy of somaclonal v ar iat ion could play an important ro le in the impr oving chilling tolerance of centipede-
g rass.
Key words: Cent ipedeg rass; Somaclonal variat ion; Chil ling tolerance; Ant io xidant enzymes
假俭草 ( Er emochloa ophiuroides ( M unr o )
Hack. )属于 C4 植物, 是禾本科黍亚科蜈蚣草属中
唯一可用作草坪草的种。假俭草除在东南亚有少量
分布外,主要分布于我国长江流域及其以南地区, 是
起源于我国的草坪草种[ 1] 。假俭草具有植株低矮、
分蘖能力强、茎叶密集、耐贫瘠、生长缓慢、耐粗放管
理、再生能力强、病虫害少等优点[ 2] , 是建植各类草
坪及高等级公路边坡护坡、堤坝护埂、治理水土流失
的理想材料,近年来在高尔夫发球台和球道也有应
用。作为暖季型草,耐寒性差是限制假俭草广泛应
用的主要原因之一, 因此,关于假俭草耐寒性的研究
一直是假俭草育种的重要方向, 包括耐寒种质收集
及耐寒生理研究[ 3~ 5]、激素[ 6~ 8]、合理施肥提高耐寒
性[ 8~ 11]等方面。但尚未见假俭草抗寒种质创建的
研究报道。
获得可遗传的有益变异是育种过程的内在要
求。体细胞无性系变异是植物组织培养中的普遍现
象,是获得有效变异的重要方法。该技术已广泛应
用于作物的细胞工程育种[ 12] , 在黑麦草 ( Lol ium
per enne L. ) [ 13]、狗牙根( Cynodon d acty lon L. ) [ 14]、
匍匐翦股颖( A gr ost i s stoloni f er a L. ) [ 15]、海滨雀稗
( Paspalum vag inatum )
[ 16] 、结缕草( Zoy sia j ap on-
ica Steud)
[ 17] 和草地早熟禾 ( Poa p r atensi s L. ) [ 18]
等草坪草的种质创建上也成效卓著。对于营养繁殖
的暖季型草坪草而言, 体细胞无性系变异提供了一
种基因变异的可能。近年来本实验室利用体细胞无
性系变异技术, 筛选出矮化、抗旱和抗盐的杂交狗牙
根 ( Cynodon dacty lon C. t ransvaalensi s ) 株系
[ 19~ 21] 。进一步研究表明, 耐旱变异体的耐旱性与
其在干旱胁迫下抗氧化保护能力增强有关 [ 20] , 而
耐盐变异体的耐盐性与其脯氨酸含量提高, 在盐
胁迫下具有更高的 K/ Na 比和抗氧化酶活性有
关[ 21 ]。在建立了假俭草再生体系基础上[ 2 2, 23] , 本
研究采用长期继代结合反复低温间歇处理假俭草
胚性愈伤,诱导体细胞无性系变异的发生, 进一步
从再生植株群体中筛选出耐寒性提高的体细胞无
性系变异植株。
1 材料与方法
1. 1 体细胞变异诱导及其再生植株的获得
以假俭草品种Common 的种子(由农友种苗
(中国)有限公司广州分公司赠送)为外植体, 按参
照中的方法进行种子消毒、萌发、诱导胚性愈伤组
织、继代培养和再生 [ 22]。挑选单颗优质胚性愈伤
组织进一步增殖扩繁, 在第 2 次继代时选取一颗
愈伤进行分化,分化成苗后移栽, 作为再生植株对
照。其余愈伤连续继代 6 次后, 开始进行辅助变
异处理: 胚性愈伤继代 1周后, 在冰箱内( 3~ 4 )
存放 1周, 然后取出并置于 25 培养 4周, 弃去褐
化或明显凋亡的愈伤。将仍保持胚性状态的愈伤
转至新的继代培养基, 依此重复 6 个月。之后按
文献[ 22]的方法进行再生,将再生植株移栽到基质
(泥炭土珍珠岩= 3 1)中, 视墒情浇水, 植株存活
后置于温室自然光照下生长。
1. 2 耐寒变异体植株及对照再生植株的培养及低
温处理
将再生植株分单株移植到口径 10 cm 的培养
盆中,温室自然光照下生长。在培养盆口表面完
全被草坪草覆盖后, 开始进行低温处理: 将植株移
入 6~ 8 的人工气候箱,光周期为 14 h光照/ 10 h
黑暗,连续处理 20 d。期间定期浇水并不断更换
各盆植株在培养箱内的位置, 避免因位置不同对
植株产生影响。筛选出的耐寒变异体及对照再生
植株分种成 5 盆, 温室自然光照下生长, 每天浇
水、每周施肥 1次。在培养盆表面被草坪覆盖后,
每个株系取 3盆作为 3个重复,按照上述低温处理
20 d,分别取低温处理前、处理后植株的成熟叶片,
测定各项生理指标。
1. 3 生理指标的测定
参照文献及仪器使用说明 [ 24] , 用调制式叶绿素
荧光仪( FM S-1, 英国 Hansatech 公司)测定光系统
最大光化学效率( Fv / F m)。参照前文方法 [ 20, 21]测
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草 地 学 报 第 19卷
定相对电导率测定、超氧物歧化酶( SOD)和过氧化
氢酶( CAT )活性,定义抑制 NBT 还原 50%所需酶
量为 1个 SOD活性单位( U) ,定义每分钟吸光值变
化 0. 01 为 1个 CAT 活性单位( U )。参照赵世杰
等[ 25]的方法测定丙二醛( MDA)含量。
1. 4 数据统计与分析
文中数据为 3次独立试验的平均值。试验数据
用 Excel 2003进行初步处理, 运用 SPSS 14. 0软件
进行分析, 采取新复极差法( Duncan)对数据进行差
异显著性分析, 各图中不同小写字母代表指标在
P< 0. 05水平下差异显著。
2 结果与分析
2. 1 耐寒变异体植株的初步筛选
本试验共对约 300株假俭草再生植株进行了耐
寒性初步筛选。在低温处理的前 10 d, 各盆栽均无
明显的枯黄症状, 至第 14 d时有少数盆栽出现了明
显的枯黄症状,处理 20 d时多数植株出现了枯黄症
状。低温结束后恢复 6 d,比较并评定试验材料的枯
黄程度,初步筛选出 5盆抗性表现好的植株,将其分
别编号为EOC1, EOC2, EOC3, EOC4和 EOC5。将耐
寒变异体植株及再生植株对照进行扩繁,再次进行低
温处理 20 d、恢复 6 d后的生长状况如图 1所示。
图 1 低温处理 20 d后耐寒变异体(EOC1~ EOC5)及其对照植株( CK)的状况
Fig. 1 Chilling- tolerant variants ( EOC1~ EOC5) compared w ith control plants ( CK ) after chilling treatment for 20 d
2. 2 耐寒变异体及其对照植株Fv/ Fm 的比较
光合作用光系统的最大光化学效率( Fv / Fm )受
逆境影响,常用作鉴定植物抗逆性的生理指标 [24, 26]。
低温处理前, 各植株之间的 Fv / Fm 差异不大, 均在
0. 84左右;低温处理后所有植株的 Fv / Fm 均下降,但
耐寒变异体植株的 Fv / Fm 皆在 0. 80~ 0 82之间,而
对照的 Fv / Fm 为 0. 59, 耐寒株系显著高于对照(图
2) ( P< 0. 05)。
图 2 耐寒变异体及其对照植株低温处理前后 Fv/ Fm 的比较
Fig . 2 F v / Fm o f chilling- to ler ant v ariants ( EOC1~ EOC5)
compared w ith contro l plants ( CK) before and
after chilling tr eatment
2. 3 耐寒变异体及其对照植株相对电导率的比较
相对电导率反映质膜受伤害程度, 常用作鉴定
植物抗逆性的生理指标 [ 20, 21]。低温处理前所有植
株的相对电导率均小于 10%, 彼此间差异不大; 低
温处理后所有植株的相对电导率均增大, 对照植株
的相对电导率达到 64. 2%,而耐寒变异体植株的相
对电导率为 25% ~ 42%, 显著低于对照植株( P<
0. 05)。表明耐寒变异体植株受低温伤害较对照轻,
其中 EOC1和 EOC5的电导率最小(图 3)。
2. 4 耐寒变异体及其对照植株丙二醛( MDA)的
比较
MDA 是膜脂过氧化的产物, 其含量变化反映
自由基伤害的程度 [ 25]。低温处理前所有植株的
MDA 含量在 140 nmol g- 1DW 以下, 相互间差异
不显著;低温处理后对照植株的 MDA 含量大量增
加,达到 268 nmol g- 1DW, 而耐寒变异体植株的
MDA 含量变化较小, 为 144~ 189 nmol g- 1DW,
只有 EOC3和 EOC4显著增加, 但仍显著低于对照
植株(图 4) ( P< 0. 05)。
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第 4期 刘明稀等:假俭草耐寒变异体的筛选及其生理鉴定
2. 5 耐寒变异体及其对照植株超氧物歧化酶
( SOD)和过氧化氢酶( CAT)活性的比较
SOD歧化活性氧自由基产生 H2O2 , CAT 将 H2O2
转化成 O2和水,从而完成对活性氧的清除, 避免自
由基在细胞内的积累而造成伤害[ 20, 21]。低温处理
前,各植株之间的 SOD 和 CAT 活性处于相近水
平, 其中 SOD 活性在 26 U mg- 1 pro tein 左右,
CAT 活性在 66 U mg- 1 protein 左右(图 5, 6)。低
温处理后所有植株的 SOD活性均增加,对照植株的
SOD活性为 38 U mg- 1 protein, 比低温前增加了
49% ,而变异体植株 SOD活性为 45~ 50 U mg- 1
protein,各株系分别比低温前增加了 64% ~ 91% ,以
EOC1增加最多 (图 5)。低温处理后所有植株的
CA T 活性也增加,对照植株 CAT 活性为 79 U mg- 1
pro tein, 比低温前增加了 19%; 而变异体植株 CAT
活性为 85~ 94 U mg- 1 protein, 各株系分别比低
温前增加了 26%~ 39% ,以 EOC1增加最多(图6)。
结果表明,耐寒变异体植株比对照植株在低温下具
有更强的诱导 SOD和 CAT 活性的能力。
3 讨论
3. 1 体细胞变异技术改良假俭草耐寒性的可行性
体细胞无性系变异是植物细胞工程育种的主要
手段之一,影响体细胞无性系变异的因素非常复杂,
培养基所含的 2, 4-D以及长期继代培养是引起变异
的重要因素[ 26, 27] 。经历 4~ 6 次继代培养的愈伤组
织分化出来的水稻( Or y z a sat iva L. )植株中,发生
雄性不育突变的频率比仅经历 3次以下继代培养的
高 3倍多[ 27]。虽然体细胞变异普遍存在于离体培
养中,但其变异具有不可预见性,定向筛选可在一定
程度上克服变异的盲目性。在离体培养中施以一定
的逆境压力,不但可以诱发变异,而且可以定向筛选
预期的目标变异性状。例如施以一定浓度 NaCl压
力或高温胁迫处理, 获得了狗牙根耐盐突变体[ 21]、
655
草 地 学 报 第 19卷
草地早熟禾耐热变异体[ 18]。本研究的继代培养基
中含有2, 4-D,而且浓度较高( 4 mg L- 1 ) ;其次,
采用了长期继代结合低温处理的方法, 以诱导变异
的发生,最后从再生植株中筛选出假俭草耐寒变异
体植株。低温处理愈伤的策略在海滨雀稗 [ 28] 和百
喜草( Paspalum notatum ) [ 29] 上也已获得耐寒变异
体,结合本研究的结果,说明体细胞变异技术在假俭
草耐寒性改良中具有潜力。
3. 2 假俭草体细胞变异体耐寒性的生理鉴定
本研究采用相对电导率和 Fv / Fm 等生理指标
对假俭草耐寒变异体进行了鉴定,证明耐寒变异体
比对照植株在低温处理后受到的伤害较轻, 具有更
高的光合效率。相对电导率和 Fv / F m 已在许多研
究中用作鉴定植物抗逆性的生理指标, 尤其是抗寒
性的鉴定[ 24, 30~ 32] 。至于所筛选的假俭草耐寒变异
体的田间表现, 有待进一步观察。耐寒变异体还表
现出低温处理后 MDA 含量明显低于对照植株, 表
明在低温处理后受到的活性氧自由基伤害较轻。低
温下由于光合碳同化受抑制, 所吸收的光能不能被
有效利用,导致活性氧自由基积累,因而植物受到活
性氧的伤害。抗氧化系统起清除活性氧的作用, 抗
冷性强的作物品种在低温下具有更高的抗氧化酶活
性[ 31, 32]。SOD和 CAT 是主要的抗氧化酶, 低温处
理后所有假俭草植株的 SOD和 CAT 活性均提高,
以清除低温下积累的活性氧自由基,反映了假俭草
植株对低温的适应。耐寒变异体 SOD 和 CAT 活
性在低温处理后的活性及其提高幅度明显高于对照
植株,表明耐寒变异体具有更强的诱导自身防御系
统的能力。在耐寒变异体中, EOC1的耐寒性最强,
其 SOD和 CAT 活性低温处理后提高的幅度也最
大。显然,假俭草耐寒变异体的耐寒性与其在抗氧
化酶系统对低温的积极响应有关。
4 结论
通过长期继代结合低温诱导和筛选, 获得了 5
个假俭草耐寒变异体, 证明体细胞无性系变异技术
是假俭草种质创新的有效方法。抗性生理测定结果
表明,与对照植株相比, 耐寒变异体的耐寒性与其
SOD和 CAT 对低温的响应更敏感有关。
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(责任编辑 邵新庆)
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