全 文 ：第 16 卷 第 5 期
Vol. 16 No . 5
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2008 年 9 月
Sep. 2008
加拿大披碱草与披碱草、圆柱披碱草 2个种
间杂种 F1 及其亲本的 AFLP分析
于 卓, 马艳红, 李小雷, 周亚星, 李晓宇, 李造哲
(内蒙古农业大学农学院, 呼和浩特 010019)
摘要: 以加拿大披碱草 ( E lymus canadens is L. )与披碱草 ( E. dahur icus Turcz. )、圆柱披碱草 ( E. cy lindr icus
( F ranch. ) H onda) 2个种间杂种 F1 及其亲本为试材, 利用 AFLP 分子标记技术, 对 2 个杂种 F1 及其亲本的遗传
差异性进行比较分析,以期为杂种鉴定及后代选育提供分子依据。结果表明:用筛选出的 13 个适宜引物共扩增出
1247 个 AFLP 位点,其中多态性位点 1042 个,多态性位点比率高达 83. 56% ; 各供试材料的遗传距离( GD)变动在
0. 4276~ 0. 7486之间, 以 GD 值 0. 65 为基准, 5 个材料聚为 2 类, 第 1 类为加拿大披碱草、圆柱披碱草和加拿大披
碱草@ 圆柱披碱草杂种 F1 , 第 2 类为披碱草、加拿大披碱草@ 披碱草杂种 F1。
关键词: 加拿大披碱草; 披碱草; 圆柱披碱草; 种间杂种 F 1; AFLP分析
中图分类号: Q943 文献标识码: A 文章编号: 1007-0435( 2008) 05-0431-06
AFLP Analysis on Interspecific Hybrid F1 and the Parents between Elymus
canadensis L. and E. dahuricus Turcz. or E. cy lindricus ( Franch. ) Honda
YU Zhuo , MA Yan-hong, LI Xiao- lei, ZHOU Ya-x ing , LI Xiao-yu, LI Zao-zhe
( College of Agr on om y, In ner Mongolia Ag ricultural University, H ohhot , Inn er Mongolia Au tonom ou s Region 010019, China)
Abstract: In or der to pro vide a molecular basis for ident ification of hybrids and breeding of progenies, the
genet ic difference of Elymus canadensis L. @ E. d ahur icus Turcz. hybrid F1 , E . canadensis @ E. cy l indricus
( Fr anch. ) Honda hybrid F1 and their parents w ere compared and analyzed by AFLP molecular marker
technique. The results show that 1247 loci of AFLP markers w er e amplified w ith 13 suitable primer comb-i
nat ions, and 1042 loci among which w ere po lymor phic and the percentage of polymorphism loci reached to
83. 56%. The genetic distance of test plants w as ranged from 0. 4276 to 0. 7486. T aking the genetic distance
value of 0. 65 as threshold, 5 test plants w ere clustered into 2 g roups: the f irst group included E. canaden-
sis, E. cy lindricus, and E. canadensi s @ E . cy l indricus hybr id F1 ; the second groups included E. dahuricus
and E. canadensis @ E. d ahur icus hybr id F 1 .
Key words: Elymus canadensis L. ; E . dahuricus T urcz. ; E . cy l indr icus ( F ranch. ) Honda; Inter specific hy-
brid F1 ; AFLP analy sis
加拿大披碱草( Elymus canadensis L. , 2n= 4x
= 28,染色体组 SSH CH C )产于北美洲草原, 具有叶
量大、品质好、产草量高等优良特性,但其生育期较
长, 在内蒙古地区种子不易成熟, 且植株易倒
伏[ 1~ 3] ; 披碱草( E. dahur icus T urcz. , 2n= 6x= 42,
染色体组 Sp SpH pH pYpY p )、圆柱披碱草( E. cy lin-
dricus ( F ranch) Honda, 2n = 6x = 42, 染色体组
SoSoHoH oYoYo)在内蒙古草原均有野生分布, 具
有抗旱、耐寒、耐盐碱、抗倒伏、抗病虫、较早熟、产籽
量高等优点,但其饲草品质逊于加拿大披碱草[ 4~ 5] 。
收稿日期: 2008-04-11; 修回日期: 2008-07-21
基金项目:国家重点基础研究发展计划( 973计划)项目( 2007CB108901) ;国家自然科学基金项目( 3056010 0) ;内蒙古自然科学基金项目
( 200607010505)
作者简介: 于卓 ( 1958-) ,男,博士,教授,博士生导师,从事饲用作物种质资源与遗传育种研究, E-m ail: yu zhuo58@ sina. com
草 地 学 报 第 16卷
为使加拿大披碱草与两种国产披碱草的优良特性综
合在一起,培育品质好、产草产籽量高、抗逆性强的
饲草新种质(新品种) , 近几年我们将加拿大披碱草
与披碱草、圆柱披碱草相互组配进行杂交,成功地获
得了两个种间杂种 F 1 代,并对两个杂种 F 1 的形态
特性、生物学特性、细胞遗传学特性进行了系统研
究,已查明这两个种间杂种 F1 均为五倍体( 2n= 5x
= 35) ,染色体配对行为不规则是导致其高度不育的
细胞遗传学原因所在 [ 6~ 8]。
本试验利用 AFLP(扩增片段长度多态性) 技
术,拟对加拿大披碱草 @ 披碱草杂种 F 1、加拿大披
碱草 @圆柱披碱草杂种 F1 及其亲本的 DNA 多态
性位点进行比较分析, 从 DNA 分子水平明确其遗
传差异性和相似性程度, 以期为杂种与亲本间的识
别及后代选育利用提供分子依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试材料为加拿大披碱草 @ 披碱草、加拿大披
碱草 @圆柱披碱草 2种间杂种 F 1 及其双亲。
1. 2 研究方法
1. 2. 1 DNA 提取与检测 剪取各供试材料的幼
嫩叶片(每个材料随机取 20 个单株的叶片等量混
合后提取 DNA) , 用植物基因组试剂盒(天根生化
科技有限公司)提取 DNA。用 1%的琼脂糖凝胶
电泳进行检测, 同时用日立 U-2800紫外分光光度
计测定 DNA 浓度, 最后将各材料的 DNA 浓度稀
释至 50 ng/Ll。
1. 2. 2 限制性内切酶酶切与接头连接 用 P st Ñ
和 M se Ñ限制性内切酶组合对供试材料基因组
DNA 进行酶切,然后用 T4 DNA 连接酶将 P st Ñ和
MseÑ接头(表 1)与酶切片段连接起来,作为预扩增
的模板[ 9]。
酶切- 连接反应体系: 1 @ 缓冲液, 0. 1 mg
mL
- 1
BSA, 0. 2 mmo l L
- 1
M AT P, 1. 0 pmolLL
- 1
Mse I接头、0. 1 pmo l Ll- 1 P st I 接头, 0. 14 UM se I
内切酶、0. 19 U Pst I 内切酶, 14 U T 4 连接酶,
2. 0 LL- 1基因组 DNA。37 e 温浴 16 h 后, 取出置
- 20 e 冰箱中保存备用。
1. 2. 3 预扩增 以酶切连接产物为 DNA 模板, 用
核心引物 P00和 M00进行预扩增(表 1)。
表 1 酶切连接接头序列及预扩增引物序列
Table 1 Nucleotide sequences of adapter s and
pre-amplification pr imer s used in AFLP analysis
接头 Adapter 序列 Sequen ce
MseÑ t op adapter 5.-GAC GAT GAG TCC T GA G- 3.
MseÑ b ot tom adapter 3.-T A CTC AGG ACT CA T- 5.
P stÑ t op adapter 5.-CT C GTA GAC T GC GT A CA-3.
P stÑ b ot tom adapter 3.-TGC ACA TCT GAC GCA TGT-5.
P00 5.-GAC TGC GTA CAT GCA G-3.
M00 5.-GAT GAG TCC TGA GTA A-3.
( 1)预扩增反应体系: 1 @ PCR缓冲液, 0. 2 mmol
L- 1 dNTP,1. 5 mmol L- 1 MgCl2 , 1. 5 ng LL- 1核心引
物, 0. 05U T aq DNA 聚合 酶, 酶 切连接 产物
4. 0 LL。
( 2)预扩增反应程序: 94 e 预变性 3 min, 每个
循环 94 e 变性 30 s, 56 e 退火 30 s, 72 e 延伸
1 min, 共 30个循环,最后 72 e 延伸 10 m in。PCR
仪为BiometraTgradient 96。
( 3)预扩增产物检测: 取 5 Ll 预扩增产物, 用
1%的琼脂糖凝胶检测。电泳 8 min和 30 min 时将
胶板分别染色并照相,用电泳 8 min时的胶板条带
亮度估算模板的浓度、用电泳 30 min时胶板条带的
弥散范围来检测酶切产物的大小。
( 4)将预扩增产物稀释 20倍, - 20 e 保存备用,
作为选择性扩增的模板 DNA。
1. 2. 4 选择性扩增 选择性引物带有 3个碱基,在
本试验中选用 Pst Ñ引物和 MseÑ引物各 15个,随
机组合 50个引物对进行筛选[ 10-11] (表 2)。
( 1)选择性扩增反应体系: 1 @ PCR 缓冲液,
0. 2 mmol L- 1 dNTP, 1. 25 mmol L- 1 MgCl2 , 2. 5 ng
LL- 1选择性引物, 0. 1U T aq DNA 聚合酶, 2. 0 LL
选择性扩增的模板 DNA。
( 2)选择性扩增反应程序: 94 e 预变性 5 min,
每个循环 94 e 变性 30 s, 65 e 退火 30 s(每个循环
降 0. 7 e ) , 72 e 延伸 1 m in,共 13个循环, 94 e 变
性30 s, 56 e 退火 30 s, 72 e 延伸 1 min(每个循环
增加 1 s) , 共 26 个循环, 最后 72 e 延伸 10 min,
4 e 保存。
( 3)变性:选择性扩增反应结束后, 每个反应体
系中加入 6. 0 LL 的变性凝胶缓冲液, 在 PCR扩增
仪上, 95 e 变性处理 5 min 后迅速取出放置冰上,
- 20 e 保存备用。
432
第 5期 于 卓等:加拿大披碱草与披碱草、圆柱披碱草 2个种间杂种 F1 及其亲本的 AFLP 分析
表 2 AFLP分析所用的引物及其碱基序列
Table 2 Pr imers and t heir nucleotide sequences used in AFLP analysis
引物 Primer 序列 Sequ ence 引物 Primer 序列 Sequ ence
P1 5.-GAC TGC GT A CAT GCA GA AG-3. M 50 5.-GAT GAG T CC TGA GT A ACAT-3.
P2 5.-GAC TGC GT A CAT GCA GAA T-3. M 52 5.- GAT GAG TCC T GA GTA ACC C-3.
P3 5.-GAC TGC GTA CAT GCA GAC A- 3. M 54 5.-GAT GAG T CC TGA GTA ACC T- 3.
P4 5.- GAC T GC GTA CAT GCA GAC T-3. M 56 5.-GAT GAG T CC TGA GTA ACG C-3.
P5 5.-GAC TGC GT A CAT GCA GGA G- 3. M 58 5.-GAT GAG T CC TGA GT A ACG T-3.
P6 5.-GAC T GC GT A CAT GCA GCA C-3. M 61 5.-GAT GAG T CC TGA GT A ACTG- 3.
P7 5.-GAC TGC GT A CAT GCA GGA A-3. M 57 5.-GAT GAG T CC T GA GT A ACG G-3.
P8 5.- GAC T GC GTA CAT GCA GGA C-3. M 62 5.-GAT GAG T CC TGA GT A ACT T-3.
P9 5.-GAC TGC GTA CAT GCA GCA A- 3. M 59 5.-GAT GAG T CC T GA GT A ACT A-3.
P10 5.- GAC T GC GT A CAT GCA GGT C-3. M 60 5.-GAT GAG T CC TGA GTA ACT C- 3.
P11 5.-GAC T GC GT A CAT GCA GAC C-3. M 51 5.-GAT GAG TCC TGA GTA ACCA- 3.
P12 5.-GAC TGC GTA CAT GCA GAG T- 3. M 55 5.-GAT GAG T CC T GA GT A ACG A-3.
P13 5.-GAC TGC GT A CAT GCA GAT A-3. M 47 5.- GAT GAG TCC T GA GTA ACA A-3.
P14 5.- GAC T GC GTA CAT GCA GA T C-3. M 48 5.-GAT GAG TCC TGA GTA ACAC- 3.
P15 5.-GAC TGC GTA CAT GCA GAT G- 3. M 49 5.-GAT GAG T CC T GA GT A ACA G-3.
注: P 为 P stÑ引物, M 为 MseÑ引物,试验中的接头和引物由上海生工生物有限公司合成
Note: P is P stÑ prim er; M is MseÑ primer; the adapters and primers were provided by Shanghai S angon Biological E ngineering Techn ology
& Ser vice Co. , Ltd.
1. 2. 5 聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测 6%的变
性聚丙烯酰胺凝胶恒功率 60 W、预电泳 30 min后,
取 7 Ll变性后的选择性扩增产物上样, 恒功率 60
W电泳至溴酚兰距胶板底部 5~ 10 cm 时停止电
泳,电泳结束后按标准的印染程序对凝胶进行染
色[ 9]。
1. 3 AFLP 标记的数据处理
记录胶板上清晰的条带, 按照点样顺序逐条对
多态性带进行比对, 在有差异谱带的位置进行记录,
/有带0记作/ 10, / 无带0记作/ 00,生成/ 00、/ 10组成
的数矩阵,对没有多态性的位点,只记录每对引物扩
增的相同位点总数。计算下列相关遗传系数:
(1)多态性位点百分率( Percentage of polymorphic
bands) ,对某一位点而言,当变异个体频率大于 0. 01
时,该位点为多态性位点( P) , P= ( K/ N) @ 100%,其中
K为多态位点数目、N为所测位点总数[9]。
(2)计算供试材料的遗传相似系数和遗传距离[ 12] ,
遗传相似系数 GS= 2N ij / (N i+ N j ) ,其中 N ij是指材料
i和材料 j 共有的片段数目, N i+ N j 指在两个材料中
出现的片段数目之和。遗传距离GD= 1- GS。根据非
加权配对算术平均法( UPGMA, Unw eighted pair-group
method with arithmetic averaging) ,运用 DPS V8. 01分
析软件进行聚类[13]。
2 结果与分析
2. 1 供试材料的 DNA质量检测
提取的加拿大披碱草 @ 披碱草、加拿大披碱草
@ 圆柱披碱草 2个种间杂种 F 1 及其双亲的基因组
DNA 纯度高,符合 AFLP 反应要求(图 1)。
图 1 2 个种间杂种 F1 及亲本的基因组 DNA电泳检测
Fig. 1 DNA electr opho resis test of 2 interspecific
hybr id F1 and t heir parents
注: 1: a加拿大披碱草; 2: ` 圆柱披碱草; 3: ` 披碱草; 4:加拿大
披碱草 @ 披碱草杂种 F1 ; 5:加拿大披碱草 @ 圆柱披碱草杂种 F1
Note: 1-E . Canad ensi s; 2-E. cy lindr ic us; 3-E. d ahuri cu s; 4 -E .
canad ensi s@ E . dahuri cus hybrid F1 ; 5- E. canadensi s @ E. c yl ind ri-
cu s hyb rid F1
2. 2 AFLP扩增结果
从 50对引物中筛选出 13对带型稳定、多态性
好的引物, 用于加拿大披碱草 @ 披碱草杂种 F 1、加
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草 地 学 报 第 16卷
拿大披碱草 @ 圆柱披碱草杂种 F1 及其双亲的
AFLP检测,共扩增出 1247个位点, 其中多态性位
点 1042 个, 多态性位点比率为 83. 56% , 平均每对
引物扩增出 95. 92个位点、80. 15 个多态性位点,
每一对引物的多态性位点不等, 在 30 ~ 112 个之
间(表 3)。以引物组合 P4/ M48扩增的位点最多,
为 127个,多态性位点为 112个, 多态性位点比率
88. 19% ;引物组合 P6/ M 47扩增的位点最少, 为
45个, 多态性位点比率 66. 67% ; 引物组合 P1/
M 48扩增位点的多态性位点比率最高, 达 94.
68%。各供试材料的 AFLP 指纹图谱存在明显差
异(图 2) ,这是 2个杂种 F1 与其各自亲本识别的
重要分子依据。
表 3 2个种间杂种 F1 及亲本的所选用引物组合及其扩增结果
Table 3. AFLP amplificat ion results of pr imer combinations o f 2 inter specific hybr id F 1 and their par ents
引物组合 扩增位点数 共同位点数 多态性位点数 多态性位点比率
Primer No. of amplif ied loci No. of comm on loci No. of polymorghic loci Rat io of polymorphic loci, %
com binat ion
P1/ M48 94 5 89 94. 68
P1/ M49 100 20 80 80. 00
P12/ M61 118 10 108 91. 53
P11/ M47 69 5 64 92. 75
P14/ M58 118 20 98 83. 05
P4/ M48 127 15 112 88. 19
P3/ M50 111 40 71 63. 96
P4/ M49 105 25 80 76. 19
P2/ M54 57 10 47 82. 46
P9/ M61 112 20 92 82. 14
P6/ M47 45 15 30 66. 67
P9/ M47 74 10 64 86. 49
P10/ M61 117 10 107 91. 45
合计 T otal 1247 205 1042 83. 56
图 2 2 个种间杂种 F1 及亲本的部分引物 AFLP 扩增结果
Fig . 2 AFLP amplification result of the primer s of 2 int erspecific hybr id F1 and t heir parents
注: 1:加拿大披碱草; 2:圆柱披碱草; 3:披碱草; 4:加拿大披碱草 @ 披碱草杂种 F1; 5:加拿大披碱草 @ 圆柱披碱草杂种 F1
Note: 1- E. canad ensi s; 2-E . cyl ind ri cu s; 3-E. d ahur icus; 4-E . canadensis @ E. dahur icus h ybrid F1 ; 5-E. canadensi s @ E. cy lind ri cus
hybrid F1; M-marker ( f rom up to dow n are 1000、900、800、700、600、500、400、300 and 200 bp)
2. 3 供试材料的遗传距离和聚类分析
加拿大披碱草 @ 披碱草、加拿大披碱草 @ 圆柱
披碱草 2个种间杂种 F1 及其双亲的遗传距离( GD )
变动在 0. 4276~ 0. 7486之间(表 4)。以遗传距离
( GD ) 0. 65为基准,可将各供试材料划分为两类: 第
1类为加拿大披碱草、圆柱披碱草和加拿大披碱草
@圆柱披碱草杂种 F1 ; 第 2类为披碱草、加拿大披
碱草 @披碱草杂种 F1 (图 3)。这表明亲本加拿大披
碱草与披碱草的遗传差异比与圆柱披碱草的差异要
大,而两个杂种 F 1 与各自父本的遗传差异相对
较小。
3 讨论
AFLP分子标记技术以其 DNA 用量少、反应
灵敏、快速高效、结果可靠、多态性丰富等优点, 广泛
434
第 5期 于 卓等:加拿大披碱草与披碱草、圆柱披碱草 2个种间杂种 F1 及其亲本的 AFLP 分析
表 4 2 个种间杂种 F1 及亲本的遗传距离
Table 4 Genetic distance o f 2 interspecific hybr id F 1 and their par ents
加拿大披碱草
E . canadensi s
圆柱披碱草
E. cy lindr ic us
披碱草
E . dahuri cus
加拿大披碱草 @ 披碱草 F1
E. canad ensi s @ E. d ahuri cu s F1
圆柱披碱草 E . cyl in dri cu s 0. 6186
披碱草 E . dahu ri cus 0. 7486 0. 5973
加拿大披碱草@ 披碱草 F1
E. Canad ensi s @ E. d ahuri cus F 1
0. 7326 0. 6643 0. 6303
加拿大披碱草@ 圆柱披碱草 F1
E. Canad ensi s @ E. cy lind ri cus F1
0. 5402 0. 4276 0. 5787 0. 5911
图 3 2 个种间杂种 F1 及亲本的 AFLP 聚类分析
Fig. 3. Dendrogr am generated by cluster analy sis
for 2 interspecif ic hybr id F 1 and their parents
应用于作物的遗传多样性分析、亲缘关系鉴定及分
子遗传图谱构建等研究中[ 14-21] , 而 AFLP 分子标记
技术在多年生牧草上的研究应用较少[ 22, 23] , 特别是
对多年生禾本科牧草种间杂种的鉴定研究更少。本
试验利用 AFLP 技术对加拿大披碱草@ 披碱草、加
拿大披碱草@圆柱披碱草两个种间杂种 F 1 及其与
双亲的遗传差异性进行比较分析,得到了较好的研
究结果,表明该项技术应用于多年生禾草远缘杂种
及与其亲本的遗传分析是可行的。
AFLP 分子标记对基因组 DNA 质量要求较
高, DNA质量不高,酶切不彻底,易造成假阳性或假
阴性现象, 不能真实地反映多态性[ 9] ; 而 DNA 样品
中含有蛋白、RNA 及多糖等物质时, 会直接影响聚
合酶的活性,进而影响试验结果。本试验采用植物
基因组试剂盒提取各供试材料的 DNA, 其纯度高、
质量好,为酶切和连接反应试验顺利实施提供了基
本条件。
4 结论
用筛选出的 13个适宜引物对加拿大披碱草 @
披碱草 F 1、加拿大披碱草 @ 圆柱披碱草 F1 及其各
自亲本共扩增出 1247个 AFLP 位点, 其中多态性
位点 1042个,多态性位点比率高达 83. 56% , AFLP
指纹图谱可将两个杂种 F1 与其各自亲本很好地区
别开。
各供试材料的遗传距离( GD )变动在 0. 4276~
0. 7486之间, 以 GD 值 0. 65为基准, 5 个材料聚为
两类,第 1类为加拿大披碱草、圆柱披碱草和加拿大
披碱草 @ 圆柱披碱草杂种 F1 ,第 2类为披碱草、加
拿大披碱草 @披碱草杂种 F 1 ;亲本加拿大披碱草与
披碱草的遗传差异比与圆柱披碱草的差异要大, 亲
缘关系较远,而两个杂种 F1 与各自父本的遗传差异
相对较小,亲缘关系相对较近。
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(责任编辑 梁艳萍 李 平)
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