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Effects of Trichoderma longibrachiatum on Seed Germination and Physiological Effects of Six Forage Varieties

长枝木霉对6种牧草种子发芽与生理效应的影响



全 文 :第21卷 第3期
 Vol.21  No.3
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
     2013年 5月
  May 2013
doi:10.11733/j.issn.1007G0435.2013.03.023
长枝木霉对6种牧草种子发芽与生理效应的影响
陈 臻1,2,古丽君1,徐秉良1∗,张树武1,蒲崇建2
(1.甘肃农业大学草业学院植物病理系 草业生态系统教育部重点实验室 甘肃省草业工程实验室
中G美草地畜牧业可持续发展研究中心,甘肃 兰州 730070;2.甘肃省植保植检站,甘肃 兰州 730020)
摘要:为了解长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)对牧草种子发芽及生理效应的影响,用长枝木霉T6菌株分
生孢子悬浮液处理3种禾本科和3种豆科牧草的种子及幼苗,分析种子形态学指标和幼苗生理学指标的变化.结
果表明:不同浓度的长枝木霉孢子悬浮液处理后,对牧草种子的发芽率、幼苗根长、芽长及干重均有明显的促进作
用,与对照差异显著(P<0.05),对其生理指标也有不同程度的影响,除丙二醛含量低于对照外,叶绿素含量、根系
活力、蛋白质含量、可溶性糖含量、过氧化物酶(POD)和苯丙氨酸酶(PAL)活性均显著高于对照(P<0.05).证明
了长枝木霉对牧草有明显的促生作用,并筛选出孢子悬浮液最适的促生浓度为1×106 个􀅰mL-1.
关键词:长枝木霉;促生作用;生理效应;牧草
中图分类号:S330.2    文献标识码:A     文章编号:1007G0435(2013)03G0564G07
EffectsofTrichodermalongibrachiatumonSeedGermination
andPhysiologicalEffectsofSixForageVarieties
CHENZhen1,2,GULiGjun1,XUBingGliang1∗,ZHANGShuGwu1,PUChongGjian2
(1.PlantPathologyDepartmentofGrasslandScienceColege,GansuAgriculturalUniversity;KeyLaboratory
ofGrasslandEcosystem,MinwastryofEducation;PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince;
SinoGU.S.CentersforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou,GansuProvince730070,China;
2.GansuStationofPlantProtectionandPlantQuarantine,Lanzhou,GansuProvince730020,China)
Abstract:TounderstandtheeffectofTrichodermalongibrachiatumonpromotinggrowthandphysiology
indicesofforageseed,seedsandseedlingsof3foragegrassvarietiesand3leguminousgrassvarietieswere
treatedbythesporesuspensionofT.longibrachiatumstrainT6andseedmorphologicalandseedling
physiologyindiceswereanalyzed.ResultsshowedthatthesporesuspensionofT.longibrachiatumstrain
T6couldsignificantlypromoteforageseedgerminationrate,growthoftheseedlingsandaffectphysiologiG
calindicatorscomparedwithcontrol(P<0.05).Exceptforthemalondialdehydecontents,thechloroG
phyl,proteinandsolublesugarcontentsaswelasroot,peroxidaseandphenylalanineenzymeactivitiesof
treatedseedsweresignificantlyhigherthanthatofcontrol(P<0.05).ThesestudiessuggestedthatT.
longibrachiatumstrainT6hadobviousgrowthGpromotingeffects.TheoptimumconcentrationforpromoG
tingwas1×106spores􀅰mL-1.
Keywords:Trichodermalongibrachiatum;Growthpromotingfunction;Physiologyeffect;Forage
  牧草作为重要的饲料和草坪用料,在我国牧草
产业中占有重要的地位.但是近年来在我国北方干
旱半干旱地区面临着土壤盐碱化和干旱等全球性的
生态问题,牧草种子大多存在萌发困难、出苗不整齐
和幼苗耐旱性和耐盐性弱等特点[1G3],同时随着人工
草地面积的不断扩大,病害的防治难度加大,牧草病
害的发生愈来愈严重,导致牧草大面积枯死、长势减
弱,牧草种质严重的退化,给牧草生产带来巨大的经
济损失[4G6].因此,提高牧草种子的出苗率,以及促
进幼苗健壮的生长,提高其产量和质量是当前面临
的重要问题.
目前,对于土壤盐渍化和干旱主要采用农业措
收稿日期:2013G02G06;修回日期:2013G03G16
基金项目:甘肃省农牧厅生物技术专项(GNSWG2009G04);甘肃省教育厅项目(042G03)资助
作者简介:陈臻(1980G),男,甘肃陇西人,博士研究生,主要从事植物病害及其综合治理的研究,EGmail:yezi8@163.com;∗通信作者 AuG
thorforcorrespondence,EGmail:xubl@gsau.edu.cn
第3期 陈 臻等:长枝木霉对6种牧草种子发芽与生理效应的影响
施、水利工程、化学改土等传统防治措施,但这些措
施均存在投入大、周期长、见效慢等缺点[7].同时,
对于在牧草生产中病害的防治,通常采用喷施化学
农药的方法,但是长期大量使用化学农药,将导致病
原菌产生抗药性、农产品中药剂残留和环境污染等
一系列的问题,严重制约了农牧业的可持续发
展[8G9].因此,随着牧草产业发展的需求,寻求有效
而安全的生物制剂间接地促进植物的生长和诱导植
物体内产生各种与抗性相关的营养物质和酶,以抵
抗外界不良的环境和病害的发生是目前研究的热点
和重点之一.
木霉(Trichoderma.spp)是一类分布广泛的土
壤习居菌[10].据有关文献报道,木霉对植物病害的
生物防治效果和对病原物的拮抗机理方面已经取得
了显著的成果[11].另外,虽然目前关于木霉对植物
促生作用及其作用机理方面已有相关的研究,但有
关长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)的研
究和报道较少,尤其长枝木霉对牧草促生作用方面
的研究鲜见报道.因此,本试验利用长枝木霉分生
孢子悬浮液处理几种常用牧草的种子及幼苗,测定
其种子的发芽率、幼苗地上部分和地下部分重量等
形态学指标,以及植株叶绿素含量、可溶性糖含量、
蛋白质含量、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶
(POD)活性、根系活力、丙二醛含量等生理指标,从
而可以深入探明长枝木霉分生孢子悬浮液对牧草的
促生情况及促生作用机理,为提高牧草产量提供理
论依据.
1 材料与方法
1.1 材料
供试菌株:长枝木霉 T6菌株由甘肃农业大学
草业学院植物病理实验室提供.
供试土样:2011年8月在天祝等地草原牧草根
际采集土样.
供试种子:紫羊茅(Festucarubra)、高羊茅(FeG
stucaarundinacea)、黑麦草(Loliumperenne)、三叶
草(Trifoliumsp.)、红豆草(OnobrychisviciaefoG
lia)和苜蓿(Medicagosativa)种子由甘肃农业大学
草业学院提供.
1.2 方法
土壤稀释液的制备:准确称取待测土样10g,放
入装有90mL无菌水并放有小玻璃珠(10个)的
150mL三角瓶中,置摇床上振荡2h,使土壤中的微
生物分散,并静置20~30s,即成10倍稀释液,依此
稀释成100倍、1000倍的稀释菌液.
土壤稀释菌液的接种:采用“涂布法”,用1000
μL移液器吸取500μL土壤稀释菌液(从低浓度到
高浓度),然后立即用涂布器将菌液均匀的涂布开
来,试验共设置3次处理,每个处理3次重复,置于
25℃和16h光照下培养,5d后分别记录各个土样
中木霉菌的分离频率.
木霉菌的纯化与鉴定:将培养基中长出的形态
类似于木霉的菌落用接种针挑出接于PDA培养基
上纯化,每个菌落3次重复.待菌落培养产孢后
(5d左右),选择生长较好的一个重复,用打孔器打
菌饼接于PDA培养基2次纯化,每个菌落3次重
复.36h后记录每个菌落的生长状况,以后每隔24
h记录1次.待菌落长满全皿时接于试管培养基保
存,经形态学和分子生物学鉴定为长枝木霉备
用[12G14].
长枝木霉孢子悬浮液的制备:将4℃低温保存的
长枝木霉菌种活化后接种于PDA培养基上,于培养
箱中恒温28℃培养4d后,在培养皿中加入10mL无
菌水和一滴TweenG80,缓慢摇晃将表面孢子洗脱,并
用无菌水稀释成浓度为1×108 个􀅰mL-1的孢子悬
浮液原液,再依此稀释成1×106 个􀅰mL-1和1×104
个􀅰mL-1的孢子悬浮液.
种子形态学指标测定:挑选饱满、健康和大小一
致的牧草种子,经0.1%升汞消毒15min后,用无
菌水冲洗3次.将处理后的种子放入垫有双层滤纸
的无菌培养皿(d=9cm)中,每皿加入50粒牧草种
子,然后向每个培养皿中分别加入不同浓度的长枝
木霉孢子悬浮液(1×108个􀅰mL-1,1×106个􀅰mL-1,
1×104 个􀅰mL-1)10mL.置于25℃的恒温培养箱
中保湿处理,每天喷施适量的无菌水,使培养皿内保
持一定的湿度.7d后统计种子发芽数、测量胚芽
长和胚根长,并称量.试验以无菌水处理作为对照,
共设置3个处理和1个对照,每个处理和对照重复
6次.
盆栽试验:在直径为15cm的塑料钵装入灭菌
的砂及土[V(砂)∶V(土)=1∶3]200g􀅰钵-1,每
钵种植50株牧草或幼苗,待幼苗出苗10d后,分别
施入不同浓度孢子悬浮液(1×108,1×106,1×104
个􀅰mL-1)或无菌水,以无菌水处理作为对照.播
种1个月后随机取10株冲冼干净,滤干水分,测量
植株的生理学指标.试验共设置3个处理和1个对
565
草 地 学 报 第21卷
照,每个处理和对照分别重复6次.
生理指标测定:采用分光光度计法测定叶绿素
含量[15],蒽酮法测定可溶性糖含量[16],考马斯亮蓝
GG250染色法测定蛋白质含量[17],愈创木酚法测定
POD活性[18],紫外分光光度法测定PAL活性[19],
氯化三苯基四氮唑(TTC)法测定植物根系活力
[20],硫代巴比妥酸法测定丙二醛含量[21].
1.3 数据统计分析
采用SPSS13.0统计分析软件对试验数据进行
分析.
2 结果与分析
2.1 长枝木霉T6菌株对牧草形态学指标的影响
与对照相比,不同浓度长枝木霉孢子悬浮液对牧
草种子发芽、幼苗根长、芽长及干重均有明显的促进
作用,其中浓度为106 个􀅰mL-1分生孢子悬浮液处
理的种子发芽率、幼苗根长、芽长及干重最高.
106个􀅰mL-1木霉孢子悬浮液处理牧草种子后,红豆
草的萌发率提高最显著(P<0.01),比对照提高了
108%,其次为高羊茅、紫羊茅、黑麦草、苜蓿和三叶
草,分别比对照提高了91.77%,91.06%,52.37%,
43.69%和31.49% (表1).
2.2 长枝木霉T6菌株对牧草及叶绿素含量的影响
长枝木霉悬浮液对牧草叶片中的叶绿素含量影
响较大,各个浓度梯度相较对照的叶绿素含量均有
较大提高,其中106 个􀅰mL-1处理的均最大,与对
照差异显著(P<0.05).禾本科牧草中的黑麦草经
106 个􀅰mL-1处理(25.79)高出对照(9.76)16.03
个单位;豆科牧草中的苜蓿经106 个􀅰mL-1处理
(19􀆰10)高出对照(10.30)8.80个单位.禾本科牧
草中叶绿素的含量要整体高于豆科牧草(图1).
表1 不同浓度长枝木霉孢子悬浮液对牧草植株形态学指标的影响
Table1 EffectsofthedifferentconcentrationsofT.longibrachiatumsporesuspensiononthemorphologicalindicesofforage
品种
Varieties
处理/个􀅰mL-1
Treatments
发芽率
Germinationrate/%
胚根长
Radicallength/mm
胚芽长
Germlength/mm
干重
Dryweight/g
紫羊茅
Festucarubra
CK 34.46±2.11dD 55.4±1.65bB 23.2±2.64bB 0.316±0.05bB
104 45.56±1.68cC 57.2±5.40bAB 25.6±2.47bB 0.284±0.04bB
106 65.84±2.00aA 60.4±2.42aA 28.8±2.46aA 0.532±0.02aA
108 56.04±1.53bB 57.2±2.11bAB 25.2±2.67bB 0.317±0.06bB
高羊茅
Festucaarundinacea
CK 45.67±1.46dD 52.8±1.59cC 30.3±2.29bB 0.224±0.03bB
104 54.32±1.88cC 57.5±1.32bB 32.3±2.99abAB 0.205±0.03bB
106 87.58±1.74aA 62.1±2.50aA 34.5±2.77aA 0.459±0.03aA
108 65.43±1.68bB 57.8±4.58bB 33.2±2.50aAB 0.228±0.04bB
黑麦草
Loliumperenne
CK 50.31±2.60cC 42.3±1.74cC 33.7±3.44bB 0.210±0.01bB
104 53.51±2.20bB 42.6±2.28bB 35.2±3.05abAB 0.232±0.03bB
106 76.66±1.08aA 46.4±3.00aA 38.0±2.31aA 0.462±0.03aA
108 55.69±1.45bB 43.9±1.57bAB 36.2±3.12abAB 0.222±0.03bB
三叶草
Trifoliumsp.
CK 58.31±1.35cC 16.6±1.12dD 5.2±0.53bB 0.521±0.03bB
104 66.68±1.16bB 21.00±1.02cC 5.2±0.31bB 0.497±0.04bB
106 76.67±1.30aA 27.51±1.39aA 6.5±1.07aA 0.763±0.10aA
108 65.06±1.62bB 23.06±1.43bB 5.4±0.80bAB 0.530±0.03bB
苜蓿
Medicagosativa
CK 58.00±0.93dD 50.1±14.0bB 12.9±2.09cC 1.698±0.17bB
104 63.35±1.74cC 51.1±2.02bB 14.2±2.35bcBC 1.760±0.13bB
106 83.34±2.24aA 54.6±2.22aA 18.7±1.72aA 2.138±0.22aA
108 68.29±2.13bB 51.5±2.07bB 16.2±3.28bAB 1.722±0.13bB
红豆草
Onobrychisviciaefolia
CK 41.67±1.04dD 30.6±2.23cB 7.4±0.90bB 1.090±0.18bB
104 58.34±1.36bB 31.9±3.25bcB 7.9±1.80bB 1.072±0.09bB
106 86.67±1.08aA 36.3±2.25aA 12.6±2.28aA 1.357±0.21aA
108 56.52±1.56cC 33.2±2.29bB 8.2±1.64bB 0.933±0.13bB
  注:同列中不同大小写字母分别表示处理间在0.01和0.05水平上差异显著
Note:Differentcapitalandsmallettersinthesamecolumnmeansignificantdifferenceat0.01and0.05levels,respectively
665
第3期 陈 臻等:长枝木霉对6种牧草种子发芽与生理效应的影响
图1 不同浓度木霉孢子悬浮液对牧草叶绿素含量的影响
Fig.1 EffectsofdifferentconcentrationsofT.longibrachiatumsporesuspension
onthechlorophylcontentofforage
2.3 长枝木霉T6菌株对牧草可溶性糖含量的影响
不同浓度长枝木霉分生孢子悬浮液处理牧草幼苗
后,可溶性糖含量均有不同程度的提高,不同稀释倍数
的影响由大到小顺序为106 个􀅰mL-1,108 个􀅰mL-1,
104个􀅰mL-1.牧草中苜蓿的可溶性糖含量提高最
为显著(图2),与对照差异极显著(P<0􀆰01).
图2 不同浓度木霉孢子悬浮液对牧草可溶性糖含量的影响
Fig.2 EffectsofdifferentconcentrationsofT.longibrachiatumsporesuspension
onthesolublesugarcontentofforage
2.4 长枝木霉T6菌株对牧草蛋白质含量的影响
与对照相比,浓度为106 个􀅰mL-1的长枝木霉
孢子悬浮液对牧草蛋白质含量的提高最为明显,与
对照差异显著(P<0.05).禾本科牧草中黑麦草蛋
白质含量比对照提高的最多(图3),豆科牧草各浓
度处理后,与对照差异不显著.
图3 不同浓度木霉孢子悬浮液对牧草蛋白质含量的影响
Fig.3 EffectsofdifferentconcentrationsofT.longibrachiatumsporesuspensionontheproteincontentofforage
765
草 地 学 报 第21卷
2.5 长枝木霉T6菌株对牧草过氧化物酶活性的
影响
不同浓度长枝木霉孢子悬浮液处理对牧草中的过
氧化物酶活性均表现为提高.其浓度为106个􀅰mL-1
处理的长枝木霉孢子悬浮液对牧草的过氧化物酶活
性的提高最为明显,与对照差异显著(P<0.05).
禾本科牧草中的高羊茅经106 个􀅰mL-1(18.25)处
理高出对照(5.97)12.28个单位;豆科牧草中的苜
蓿经106 个􀅰mL-1(15.31)处理高出对照(2.86)
12.45个单位(图4).
图4 不同浓度木霉孢子悬浮液对牧草过氧化物酶活性的影响
Fig.4 EffectsofdifferentconcentrationsofT.longibrachiatumsporesuspensiononthePODactivityofforage
2.6 长枝木霉T6菌株对牧草苯丙氨酸解氨酶活
性的影响
不同浓度长枝木霉孢子悬浮液处理牧草后,牧
草中的苯丙氨酸解氨酶活性与对照差异显著
(P<0.05).长枝木霉分生孢子悬浮液浓度为106
个􀅰mL-1处理后,豆科和禾本科牧草的苯丙氨酸解
氨酶活性提高最为明显,三叶草经106 个􀅰mL-1处
理(332.0)高出对照(210.2)121.8个单位,苯丙氨
酸解氨酶提高效果最明显(图5).
2.7 长枝木霉T6菌株对牧草根系活力的影响
经过长枝木霉不同孢子悬浮液处理后的牧草根
系活力均显著高于对照(P<0.05).浓度为106
个􀅰mL-1孢子悬浮液处理后根系活性最高.豆科
和禾本科牧草中提高效果最显著的分别是三叶草和
黑麦草(图6).
2.8 长枝木霉T6菌株对牧草丙二醛含量的影响
长枝木霉不同浓度孢子悬浮液处理后,对丙二
醛含量有较明显的影响,丙二醛含量由低到高的顺
序为:106个􀅰mL-1,108个􀅰mL-1,104个􀅰mL-1,
CK.106个􀅰mL-1的悬浮液处理后牧草丙二醛含
量最低,与对照差异显著(P<0.05),说明此时牧草
抗逆性最好(图7).
图5 不同浓度木霉孢子悬浮液对牧草苯丙氨酸解氨酶活性的影响
Fig.5 EffectsofdifferentconcentrationsofT.longibrachiatum
sporesuspensiononthePALactivityofforage
865
第3期 陈 臻等:长枝木霉对6种牧草种子发芽与生理效应的影响
图6 不同浓度木霉孢子悬浮液对牧草根系活力的影响
Fig.6 EffectsofdifferentconcentrationsofT.longibrachiatumsporesuspensionontherootvigorofforage
图7 不同浓度木霉孢子悬浮液对牧草丙二醛含量的影响
Fig.7 EffectsofdifferentconcentrationsofT.longibrachiatumsporesuspensionontheMDAcontentofforage
3 讨论
国内外大量的研究结果表明,木霉菌对小麦
(Triticumaestivum)、玉米(Zeamays)、番茄(SolaG
numlycopersicum)、黄瓜(Cucumissativus)、水稻
(Oryzasativa)、豇豆(Vignaunguiculate)、长春花
(Catharanthusroseus)、菊 花 (Chrysanthemum
morifolium)、辣椒(Capsiumannuum)、莴苣(LacG
tucasativa)、花生(Arachishypogaea)、白菜(BrasG
sicarapa)、马铃薯(Solanumtuberosum)等多种作
物有促生效应[22G24].长枝木霉促进生长效应的主要
机制,初步分析可能是由于长枝木霉增强了牧草根
际定植能力、分解土壤中矿物质易于植物吸收,促进
了牧草幼苗的光合速率和叶绿素的形成,但具体的
机理还需进一步研究.
此外,通过测定不同浓度长枝木霉孢子悬浮液
处理牧草幼苗后的生理指标,不同浓度的孢子悬浮
液对牧草的叶绿素、根系活力、蛋白质含量、可溶性
糖含量和丙二醛含量均有影响,尤其是浓度为106
个􀅰mL-1处理影响较为明显.同时豆科牧草中的
三叶草和禾本科牧草中的黑麦草的蛋白质含量较对
照的高出最明显,黑麦草、苜蓿的可溶性糖含量不同
浓度处理下变化很明显.说明用长枝木霉孢子悬浮
液浓度为106 个􀅰mL-1处理后牧草的抗逆性好,受
伤害最小.
POD和PAL都是防御酶系,在植物生长发育
过程中以及在各种不良环境条件下都会发生变化.
不同的孢子悬浮浓度处理对牧草的POD酶活性也
有影响.在本试验中POD酶活性变化不是非常明
显而禾本科黑麦草较豆科三叶草的POD酶活性变
化更明显,这可能跟植物本身的生理生化作用有关.
而PAL作为一种抗病生理指标,诱导植物产生抗病
性.本试验中长枝木霉孢子悬浮液对牧草中PAL
酶活性的影响作用趋势大致与POD的变化相同,但
PAL酶活变化更为敏感.
据报道,多年生禾草的大粒种子发芽温度调在
恒温20℃下进行,而多年生禾草的小粒种子发芽温
度调在变温15~25℃下进行[25],豆科牧草多数品种
965
草 地 学 报 第21卷
发芽最适温度为15~25℃[26],本试验发芽试验选取
了25℃,虽然6种牧草均能发芽,但这对每一个牧
草品种并非最佳发芽温度,可能会对试验造成一定
的影响,需进一步进行研究.
长枝木霉孢子悬浮液对牧草的生长具有较强的
促生作用,具有广阔的应用前景,但目前对于长枝木
霉的研究还只是处于初级阶段,还有很多问题诸如
其作用及机理、对植物的安全性、持久性和针对性等
有待进一步深入的研究.
4 结论
长枝木霉对牧草有明显的促生作用,不同浓度
长枝木霉孢子悬浮液处理的种子在形态指标上存在
显著的差异,尤其是浓度为106 个􀅰mL-1处理表现
出较明显的促生作用.研究结果将为提高牧草产量
途径提供新的理论依据.
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(责任编辑 刘云霞)
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