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刺松藻内生真菌长枝木霉的化学成分研究



全 文 :收稿日期:2014-03-05
基金项目:国家自然科学基金资助项目(41106137;41106136).
作者简介:纪珍玲(1986-),女,山东海阳人,沈阳大学硕士研究生;马德顺(1962-),男,辽宁沈阳人,沈阳大学教
授,博士.
第26卷 第4期
2 0 1 4年 8月
沈 阳 大 学 学 报 ( 自 然 科 学 版 )
Journal of Shenyang University(Natural Science)
Vol.26,No.4
Aug.2 0 1 4
文章编号:2095-5456(2014)04-0277-05
刺松藻内生真菌长枝木霉的化学成分研究
纪珍玲1,2,马德顺1,苗凤萍2
(1.沈阳大学 生命科学与工程学院,辽宁 沈阳 110044;
2.中国科学院 烟台海岸带研究所,山东 烟台 264003)
摘   要:对烟台近岸的绿藻刺松藻来源的一株内生真菌长枝木霉的次生代谢产物进行了探索.通过硅胶
柱层析、葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析、制备薄层层析和高效液相色谱等色谱分离手段,以及超导核
磁共振等波谱鉴定技术,从该菌的马铃薯-葡萄糖和菊芋-葡萄糖液体培养基发酵产物中继续分离并鉴定
了5个化合物,包括5α,8α-环氧麦角甾-6,22-二烯-3β-醇(1);麦角-7,22-二烯-3β,5α,6β-三醇
(2);β-谷甾醇(3);5-羟基-3-甲基戊-2-烯酸(4)和角鲨烯(5).化合物4和5均为首次从木霉中分离得
到.抑菌活性测试结果表明化合物1~5对细菌和真菌无明显抑制作用.
关 键 词:刺松藻;长枝木霉;内生真菌;化学成分;次生代谢产物
中图分类号:Q 58   文献标志码:A
木霉(Trichodermaspp.)是自然界中分布较
为广泛的真菌类群,具有重要的生防作用,并且表
现出丰富的次生代谢产物结构类型,包括萜类、甾
体、聚酮和生物碱等[1].海洋环境来源的木霉也具
有丰富的次生代谢产物,近年来对来源不同海洋
环境(沉积物、海鞘、海绵、海藻等)的棘孢木霉
(T.asperellum)、绿木霉(T.virens)、深绿木霉
(T.atroviride)、康氏木霉(T.koningii)、长枝木
霉(T.longibrachiatum)、里氏木霉(T.reesei)等
的研 究 中 获 得 了 一 系 列 活 性 新 结 构,包 括
trichodermatides、trichodermaketones、trichoder-
ins、sorbicilinoids、bisorbicilinoids、peptaibols、
二肽、环肽、蒽醌和xanthone衍生物等[2-6],并且
部分产物表现出一定的结构特异性,例如卤代等.
本研究组从海洋绿藻刺松藻(Codium fragile)的
一株内生长枝木霉(T.longibrachiatum)的马铃
薯-葡萄糖液体培养基(PDB)发酵产物中分离鉴
定了一种罕见的harziane二萜(6)[7]3815.以菊芋
-葡萄糖液体培养(JDB)基再次发酵,也获得了
化合物6.对两种培养基发酵剩余产物的研究中,
继续分离鉴定了5种化合物1~5,其中化合物4
和5均为首次从木霉中分离得到.
1 材料与方法
1.1 菌种与培养
长枝木霉(T.longibrachiatumcf-11)是由
本实验室分离自烟台近岸采集的海洋绿藻刺松藻
(C.fragile)的内生丝状真菌,该真菌是经形态
学和克隆真菌核糖体rDNA基因ITS分子序列
分析进行鉴定的,保存在中国科学院烟台海岸带
研究所生物资源实验室和中国典型培养物保藏中
心(保藏号为CCTCCM2012141).
菌种分别以PDB培养基(葡萄糖20g,酵母
膏3g,蛋白胨5g,马铃薯浸汁200mL(200g马
铃薯煮汁),陈海水500mL,蒸馏水300mL,琼脂
15g,pH=6.5~7.0)和JDB(每升含菊芋块茎煮
汁500mL,葡萄糖10g,硝酸钠2g,陈海水500
mL;pH =7.0)发酵.1 000mL三角烧瓶中装液
体培养基300mL,121℃灭菌20min后接种.两
种培养基分别接种15LPDB和30LJDB,自然光
下,室温静置培养30d.
1.2 仪器与试剂
Bruker AvanceⅢ500型核磁共振(NMR)仪;
EYELA N-1001旋转蒸发仪;Agilent 1260infinity
高效液相色谱(HPLC)仪(Eclipse SB-C18柱,9.4
×250mm,5μm);GF254薄层色谱硅胶;100~200目
和200~300目柱色谱硅胶;Sephadex LH-20葡
聚糖凝胶;显色剂为茴香醛-硫酸溶液;提取、柱色
谱和薄层色谱有机溶剂均为分析纯;HPLC流动相
为Pal超纯水和色谱纯甲醇.
1.3 次生代谢产物提取、分离与鉴定
将自然光下室温静置培养30d的菌丝体,用
乙酸乙酯杀菌2d后,过滤出菌丝体,收集发酵
液.菌丝体干燥并粉碎后用V(氯仿)∶V(甲醇)
=1∶1的溶液提取3次,再用乙酸乙酯萃取,减
压浓缩为菌丝体提取物;发酵液经乙酸乙酯萃取,
减压浓缩后得发酵液提取物,合并两部分提取物
为总浸膏.总浸膏经硅胶柱层析,以V(石油醚)∶
V(乙酸乙酯)为0∶100至100∶0梯度的溶液洗
脱,收集各组分,再经反复硅胶柱层析、Sephadex
LH-20柱层析、反相硅胶柱层析、制备薄层层
析、半制备 HPLC分离、重结晶,分离纯化得到单
体化合物.综合运用现代波谱技术(IR、UV、EI-
MS、FAB-MS、HR-ESI-MS、1 H-NMR、13 C
- NMR、DEPT、1 H -1 H COSY、HMQC、
HMBC)、化学方法及已报道的文献确定各单体
化合物的结构.
1.4 抑菌活性检测
利用滤纸片进行抗菌活性检测[8],将化合物
1~5用 DMSO 进行溶解,配成的终浓度为30
μg/片,静置30min,使有机溶剂完全挥发.在培
养平板中分别加入 1mL 金黄 色 葡 萄 球 菌
(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia
coli)、苹 果 炭 疽 菌 (Colletotrichum gloeos-
porioides)和 西 瓜 枯 萎 病 菌 (Fusarium
oxysporumf.sp.niveum)的菌悬液,然后将加油
样品的滤纸片贴在带菌平板上,置于37℃静置培
养,细菌培养24h,真菌培养48h.测量抑菌圈大
小,每个样品做三个平行样,取平均值.
2 结  果
2.1 提取、分离与鉴定
JDB发酵产物的菌丝体提取物为18.5g,发
酵液提取物为20.2g.两部分提取物经薄层层析
(TLC)检测结果类似,合并得总浸膏(38.7g).总
浸膏经硅胶柱层析,以V(石油醚)∶V(乙酸乙
酯)为0∶100至100∶0梯度的溶液洗脱,TLC
检测合并后得8个组分(Ⅰ~Ⅷ).组分Ⅲ经
Sephadex LH-20柱(V(氯仿)∶V(甲醇)=1∶
1)和制备薄层(V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=2∶
1)层析,得化合物3(4.2mg);组分Ⅳ经硅胶柱(V
(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=2∶1)和Sephadex
LH-20柱(V(氯仿)∶V(甲醇)=1∶1)层析,再
经 HPLC(甲醇)纯化,得化合物1(12.3mg);组
分Ⅴ经硅胶柱(V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=10∶
1)和Sephadex LH-20柱(V(氯仿)∶V(甲醇)
=1∶1)层析,以及 HPLC(V(甲醇)∶V(水)溶液
由30%~100%梯度)纯化,得化合物4(19.0
mg);组分Ⅵ经Sephadex LH-20柱(V(氯仿)∶
V(甲醇)=1∶1)和制备薄层(乙酸乙酯)层析,得
化合物2(10.4mg).
PDB培养基发酵产物的菌丝体提取物为9.2
g,发酵液提取物为13.7g,将其合并最后得到总
浸膏22.9g.将总浸膏通过硅胶柱层析进行了洗
脱,然后再用制备薄层TLC检测,最后合并得到
Ⅶ个组分.将总浸膏经硅胶柱层析,以V(石油醚)
∶V(乙酸乙酯)为0∶100至100∶0梯度的溶液
洗脱后得 5 个小组分 (Ⅰ ~ Ⅵ).组分 Ⅰ 经
Sephadex LH-20柱(V(氯仿)∶V(甲醇)=1∶
1)层析后,再经 HPLC(体积分数85%甲醇)纯
化,得化合物5(1.8mg);组分Ⅵ经甲醇重结晶,
得化合物1(11.5mg).
两种培养基发酵的长枝木霉次生代谢产物中
共分离获得6个化合物,其结构式见图1.
图1 化合物1~6的结构
Fig.1 Structures of compounds 1~6
872 沈阳大学学报(自然科学版)             第26卷
2.2 化合物结构鉴定
化合物1:无色晶体;1 H-NMR(500MHz,
CDCl3)δ6.50(1H,d,J=8.5Hz,H-6),6.24
(1H,d,J=8.5Hz,H-7),5.22(1H,dd,J=
15.2,7.5Hz,H-23),5.14(1H,dd,J=15.3,
8.3Hz,H-22),3.97(1H,m,H-3),1.00(3H,
d,J=6.5Hz,H-21),0.91(3H,d,J=6.8Hz,
H-28),0.88(3H,s,H-19),0.83(3H,d,J=
6.6Hz,H-27),0.82(3H,d,J=6.5Hz,H-
26),0.81(3H,s,H-18);13 C-NMR(125MHz,
CDCl3)δ135.4(C-6),135.2(C-22),132.3(C
-23),130.1(C-7),82.2(C-5),79.4(C-8),
66.5(C-3),56.2(C-17),51.7(C-14),51.1
(C-9),44.6(C-13),42.8(C-24),39.7(C-
20),39.3(C-4),37.0(C-12),36.9(C-10),
34.7(C-1),33.1(C-25),30.1(C-2),28.7(C
-16),23.4(C-15),20.9(C-21),20.6(C-
11),20.0(C-27),19.6(C-26),18.2(C-19),
17.6(C-28),12.9(C-18).以上波谱数据与文
献报道的5α,8α-环氧麦角甾-6,22-二烯-3β
-醇一致[9],鉴定其为5α,8α-环氧麦角甾-6,
22-二烯-3β-醇(过氧化麦角甾醇).
化合物2:无色晶体;1 H-NMR(500MHz,
DMSO-d6)δ5.23(1H,dd,J=15.3,7.2Hz,H
-23),5.17(1H,dd,J=15.2,8.1Hz,H-22),
5.08(1H,m,H-7),3.77(1H,dt,J=16.1,5.6
Hz,H-3),3.59(1H,s,H-6),1.00(3H,d,J=
6.5Hz,H-21),0.92(3H,d,J=6.8Hz,H-
28),0.91(3H,s,H-19),0.84(3H,d,J=7.2
Hz,H-27),0.82(3H,d,J=7.2Hz,H-26),
0.55(3H,s,H-18);13 C-NMR(125MHz,
DMSO-d6)δ140.1(C-8),135.9(C-22),
131.9(C-23),120.0(C-7),75.0(C-5),72.6
(C-6),66.4(C-3),55.8(C-17),54.6(C-
14),43.5(C-13),42.7(C-9),42.5(C-24),
40.4(C-4),40.2(C-20),39.5(C-12),37.1
(C-10),32.9(C-25),31.7(C-1),28.2(C-
16),23.1(C-15),21.8(C-11),21.5(C-21),
20.2(C-26),19.9(C-27),18.2(C-19),17.8
(C-28),12.5(C-18).以上波谱数据与文献报
道的麦-7,22-二烯-3β,5α,6β-三醇数据一
致[10],鉴定其为麦角-7,22-二烯-3β,5α,6β-
三醇(啤酒甾醇).
化合物3:无色晶体;1 H-NMR(500MHz,
CDCl3)δ5.35(1H,d,J=5.1Hz,H-6),3.53
(1H,ddd,J=17.0,11.6,5.1Hz,H-3),1.01
(3H,s,H-19),0.92(3H,d,J=6.6Hz,H-
21),0.87(3H,m,H-29),0.83(3H,d,J=6.8
Hz,H-26),0.81(3H,d,J=6.9Hz,H-27),
0.68(3H,s,H-18);13 C-NMR(125MHz,
CDCl3)δ37.3(C-1),31.7(C-2),71.8(C-
3),42.3(C-4),140.8(C-5),121.7(C-6),
31.9(C-7),31.9(C-8),50.1(C-9),36.5(C
-10),21.1(C-11),39.8(C-12),42.3(C-
13),56.7(C-14),24.3(C-15),28.2(C-16),
56.1(C-17),12.0(C-18),19.4(C-19),36.1
(C-20),18.8(C-21),33.9(C-22),26.1(C-
23),45.8(C-24),29.1(C-25),19.8(C-26),
19.0(C-27),23.1(C-28),11.9(C-29).以上
波谱数据与文献报道的β-谷甾醇数据一致
[11],
鉴定其为β-谷甾醇.
化合物4:无色油状;1 H-NMR(500MHz,
CD3OD)δ5.72(1H,s,H-2),3.71(2H,t,J=
6.5Hz,H-5),2.37(2H,t,J=6.5Hz,H-4),
2.16(3H,d,J=0.8Hz,H-6);13 C-NMR(125
MHz,CD3OD)δ168.9(C-1),156.5(C-3),
117.2(C-2),59.3(C-5),43.3(C-4),17.5(C
-6).以上谱学数据与文献报道的5-羟基-3-
甲基戊-2-烯酸一致[12],鉴定其为5-羟基-3
-甲基戊-2-烯酸.
化合物5:无色油状;1 H-NMR(500MHz,
CDCl3)δ5.15-5.08(6H,m,H-3,7,11,14,
18,22),2.10-1.96(20H,m,H-4,5,8,9,12,
13,16,17,20,21),1.68(6H,d,J=1.0Hz,H-
1,24),1.59(18H,s,H-2′,6′,10′,15′,19′,
23′);13C-NMR(125MHz,CDCl3)δ135.1(C-
10,15),134.8(C-6,19),131.1(C-2,23),
124.4(C-3,22),124.4(C-7,11,14,18),39.8
(C-5,6,16,20),28.3(C-12,13),26.8(C-4,
21),26.8(C-8,17),25.6(C-2′,23′),17.6(C
-1,24),16.0(C-6′,10′,15′,19′).以上波谱数
据与文献报道的角鲨烯数据一致[13],故化合物5
鉴定为角鲨烯.
2.3 化合物抑菌活性
抑菌活性筛选表明化合物1~5对金黄色葡
萄球菌(S.aureus)、大肠杆菌(E.coli)、苹果炭疽
菌 (C.gloeosporioides)和西瓜枯萎病菌 (F.
oxysporumf.sp.niveum)均无明显抑制作用.
3 讨  论
海洋微生物具有独特的代谢途径,研究者从
其代谢产物中发现了多种结构新颖并且表现出抗
972第4期        纪珍玲等:刺松藻内生真菌长枝木霉的化学成分研究
菌、抗氧化、抗肿瘤、诱导细胞凋亡等生物活性的
化合物,其种类资源丰富,具有广阔的应用前景及
研究价值.海洋藻栖真菌是一类具有丰富次生代
谢途径的海洋真菌类群,但藻栖木霉的研究工作
相对较少.Garo等在对一株藻栖绿木霉的研究中
发现了一个具有显著细胞毒活性的氯代二肽,并
且氯代对活性具有重要的贡献[4]423;厦门大学的
杜希萍等对一株藻栖木霉(PT2)的研究中获得了
一个新的倍半萜糖苷类结构trichodermoside,具
有弱的细胞毒活性[14].本研究利用两种培养基
(PDB和JDB)分别对海洋绿藻刺松藻的一株内
生长枝木霉(T.longibrachiatumcf-11)进行发
酵,并对其次生代谢产物进行分离纯化,从中分离
得到5个化合物(1~5),并且5-羟基-3-甲基
戊-2-烯酸和角鲨烯均为首次从木霉中分离得
到,该研究丰富了海洋藻栖木霉次生代谢产物的
结构类型和这两个化合物的来源.过氧化麦角甾
醇(1)和二萜harzianone(6)从PDB和JDB培养
基发酵产物中均有发现[7]3815,表明其代谢生产对
培养基种类的依赖性不强,但化合物2、4和5仅
在一种培养基中发现,其代谢生产可能对培养基
具有依赖性.同时这也说明不同的营养成分对该
长枝木霉的次级代谢具有不同的影响,从而导致
产生了不同的代谢产物.下一步研究可考虑通过
改变不同的培养基和培养条件来诱导产生不同的
次生代谢产物,以期获得具有较好抑菌活性的化
合物,为新型抑菌剂的开发与应用研究提供参考.
β-谷甾醇曾经由本研究组从菊芋块茎的乙醇提
取物中分离得到[15],并且从PDB培养基发酵产
物中未获得此结构,故推测其可能来源于JDB培
养基.此外,化合物1~5无抗细菌活性,进一步表
明化合物6可能是关键的抗细菌活性成分[7]3816.
参考文献:
[1] Reino J L,Guerrero R F,Hernndez-Galn R,et al.
Secondary Metabolites from Species of the Biocontrol
Agent Trichoderma[J].Phytochemistry Reviews,2008,7
(1):89-123.
[2] Sun Y,Tian L,Huang J,et al.Trichodermatides A-D,
Novel Polyketides from the Marine-Derived Fungus
Trichoderma reesei[J].Organic Letters,2008,10(3):393
-396.
[3] Song F,Dai H,Tong Y,et al.Trichodermaketones A-D
and 7-O-methylkoninginin D from the Marine Fungus
Trichoderma koningii[J].Journal of Natural Products,
2010,73(5):806-810.
[4] Garo E,Starks C M,Jensen R R,et al.Trichodermamides
A and B,Cytotoxic Modified Dipeptides from the Marine-
Derived Fungus Trichoderma virens[J].Journal of
Natural Products,2003,66(3):423-426.
[5] Pruksakorn P,Arai M,Kotoku N,et al.Trichoderins,
Novel Aminolipopeptides from a Marine Sponge-Derived
Trichoderma sp., are  Active  against  Dormant
Mycobacteria[J].Bioorganic & Medicinal Chemistry
Letters,2010,20(12):3658-3663.
[6] Du L,Zhu T,Li L,et al.Cytotoxic Sorbicilinoids and
Bisorbicilinoids  from  a  Marine-Derived  Fungus
Trichodermasp[J].Chemical &Pharmaceutical Buletin,
2009,57(2):220-223.
[7] Miao F P,Liang X R,Yin X L,et al.Absolute
Configurations of Unique Harziane Diterpenes from
Trichoderma species[J].Organic Letters,2012,14(15):
3815-3817.
[8] Schulz B,Sucker J,Aust H J,et al.Biologicaly Active
Secondary Metabolites of Endophytic Pezicula Species[J].
Mycological Research,1995,99(8):1007-1015.
[9] Khan S,Kazmi M H,Ahmed E,et al.Phytochemical
Studies on Sorbus cashmiriana [J].Journal of the
Chemical Society of Pakistan,2013,35(1):130-134.
[10] 李 冬 利,李 晓 明,崔 传 明,等. 鸭 毛 藻 内 生 真 菌
Hypocreales sp.的化学成分研究[J].海洋科学,2008,
32(11):51-55.
(Li Dongli,Li Xiaoming,Cui Chuanming,et al.
Chemical Constituents of Hypocreales sp.,an Endophytic
Fungus Derived from the Red Alga Symphyocladia
latiuscula[J].Marine Sciences,2008,32(11):51-55.)
[11] Zhang X,Geoffroy P,Miesch M,et al.Gram-Scale
Chromatographic Purification ofβ-sitosterol:Synthesis
and Characterization ofβ-sitosterol Oxides[J].Steroids,
2005,70(13):886-895.
[12] Xu J,AlyA H,Wray V,et al.Polyketide Derivatives of
Endophytic Fungus Pestalotiopsis sp.Isolated from the
Chinese Mangrove Plant Rhizophora mucronata [J].
Tetrahedron Letters,2011,52(1):21-25.
[13] 刘净,谢韬,魏秀丽,等.冬凌草化学成分的研究[J].中国
天然药物,2004,2(5):276-279.
(Liu Jing,Xie Tao,Wei Xiuli,et al.Chemical Studies on
Rabdosia rubenscens[J].Chinese Journal of Natural
Medicines,2004,2(5):276-279.)
[14] 杜希萍,李瑶瑶,鲁春华,等.分离自木霉PT2的一个新倍
半萜糖苷[J].天然产物研究与开发,2010,22(4):544
-547.
(Du Xiping,Li Yaoyao,Lu Chunhua,et al.A Novel
Sesquiterpene Glucoside from Trichodermasp PT2[J].
Natural Product Research and Development,2010,22(4):
544-547.)
[15] Li X D,Miao F P,Ji N Y.Two New Epoxysteroids from
Helianthus tuberosus[J].Molecules,2011,16(10):8646
-8653.
(下转第319页)
082 沈阳大学学报(自然科学版)             第26卷
on Technique of Pickling Wastewater Reclamation in Iron
and Steel Industry[J].Journal of Shanyang University,
2004,16(8):91-94.)
[7] 程璞.我国建筑中水回用工程的探讨[J].山西建筑,
2003,29(14):80-81.
(Cheng Pu.On Reuse Project of Architectural Intermediate
Water in China[J].Shanxi Architecture,2003,14(10):80
-81.)
Engineering Project and Analysis of Reclaimed Water System for
Buildings 
Wu Hao,Xie Changqing,Wang Cong,Zhang Ping
(School of Architectural and Civil Engineering,Shenyang University,Shenyang 110044,China)
Abstract:Reclaimed water system for buildings has great economic and social benefits.A treatment
process of domestic sewage for residential district was introduced,which adopted A/O method
combined with a membrane component,the treated water was used for flushing.This process has
advantages of good treatment effect,smal floor space,low energy consumption,denitrification and
can be used as standard process flow of the equipments and facilities of reclaimed water.
Key words:reclaimed water system for buildings;water quality;flow diagram;membrane bioreactor;
disinfection tank
【责任编辑:胡天慧
檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼

(上接第280页)
Chemical Constituents from Trichoderma longibrachiatum,an
Endophytic Fungus Derived from Marine Green AlgaCodium fragile
 
Ji Zhenling1,2,Ma Deshun1,Miao Fengping2
(1.Colege of Life Science and Engineering,Shenyang University,Shenyang 110044,China;2.Yantai Institute of
Coastal Zone Research,Chinese Academy of Sciences,Yantai 264003,China)
Abstract:The secondary metabolites of an endophytic Trichoderma longibrachiatumstrain from the
marine green algaCodium fragile were investigated.As a result,five known compounds,including
ergosterol peroxide(1),cerevisterol(2),β-sitosterol(3),2-anhydromevalonic acid(4),and squalene
(5)were isolated from the cultures by silica gel column chromatography,Sephadex LH-20column
chromatography,preparative thin-layer chromatography,and high performance liquid chromatogr-
aphy.The structures of these compounds were mainly identified by 1 H,13 C,and DEPT NMR
techniques.Compounds 4 and 5 were obtained from Trichoderma species for the first time,and
compound 3 was likely from the media.Additionaly,no compounds exhibited any inhibitory effect
against the tested bacteria and fungi.
Key words: Codium fragile; Trichoderma longibrachiatum; endophytic fungus; chemical
constituent;secondary metabolite 
【责任编辑:胡天慧】
913第4期          吴 昊等:建筑中水回用工程实例及分析