全 文 ：应用与环境生物学报　2002 , 8(2):195～ 199 　 　
Chin J Appl Environ Biol=ISSN 1006-687X 　 2002-04-25
　
从水稻种子表面分离的紫云英根瘤菌与
不同水稻品种亲合性的研究＊
张晓霞　王　平＊＊　冯新梅　胡正嘉　杨丽华1
(华中农业大学农业部农业微生物重点实验室　武汉　430070)
(1内蒙古农业大学生物工程学院　呼和浩特　010018)
摘　要　采用紫云英琼脂管结瘤试验 , 在 10 个供试的不同水稻品种中 , 仅从“汕优 63”和“珍A 一代” 2个品种的种子
表面各分离筛选到在紫云英上结瘤较早且较多的 1个菌株 ,分别命名为 SY63-4 和 ZA1D-3.采用无菌盆栽试验分别将
这 2 个菌株接种于 4 个不同水稻品种“汕优 63” 、“珍 A 一代” 、“马协 63”及“博湛优 19” , 发现菌株 ZA1D-3 对 4 种水稻
均表现出显著的促生作用 , SY63-4 仅对“汕优 63”和“珍A 一代”表现出明显的促生作用.利用 MPN 法检测不同水稻品
种根内外根瘤菌 ZA1D-3 和 SY63-4 的数量 ,发现 ZA1D-3 和 SY63-4 在 4 种水稻根部的定殖数量也不相同.SY63-4 在
“汕优 63”根部定殖的数量 lo g(n cfum FW-1/ g-1)为 5.20 ,比在其余 3种水稻根部高出 2 个数量级;ZA1D-3 在“珍 A 一
代”根部定殖的最大数量 log(ncfum FW-1/ g-1)为 4.54 , 比在其余 3 种水稻根部高出 1 个数量级.这说明 SY63-4 与“汕
优 63” 、ZA1D-3与“珍 A一代”间存在着一定的亲和性.图 1 表 2 参 12
关键词　紫云英根瘤菌;水稻;植物促生作用;根圈定殖;亲和性
CLC　S511 S154.381
SCREENING OF GROWTH-PROMOTING RHIZOBIUM ASTRAGALUS FROM
RICE AND STUDYON THEIR COLONIZATION IN RICE RHIZOSPHERE
ZHANG Xiaoxia , WANG Ping＊＊ , FENG Xinmei , HU Zhengjia &YANG Lihua1
(Key Lab of Agricul tural Microbiology , Min istry of Agr icul ture , Huazhong Agr icu lture U niversity , Wuhan　430070 , China)
(1Col lege of Biology Engineer ing , Inner Mongol ia Agricultural Un iversity , Hohhot　010018 , C hina)
Abstract 　Rhizobium astragalus st rains named SY63-4 and ZA1D-3 w ere isolated and screened respec-
tively f rom the non-surface sterilized seeds of rice cultivars “Shan You 63” and “Zhen A Yi Dai” by using
Astragalus sinicus as the trap host.Strain ZA1D-3 signif icantly increased shoot and root g row th of the 4
inoculated rice cultivars—“Shan You 63” , “Zhen A Yi Dai” , “Ma Xie 118-2” and “BoZhanYou19” in
sterile soil pot experiment.However , Strain S Y63-4 only promoted the grow th of “Shan You 63” .The
population of SY63-4 in rhizosphere of “Shan You 63” 〔log (ncfu m FW-1/g-1)=5.20〕 was higher than
that in other cultivars by about 10 or 100 times.The populat ion of ZA1D-3 in rhizosphere of “Zhen A Yi
Dai” 〔log (ncfum FW-1/g-1)=4.54〕 was higher than that in other cultivars by 10 t imes.Fig 1 , Tab 2 ,
Ref 12
Keywords　Rhizobium astragalus;rice;plant g row th-promoting rhizobacteria;rhizosphere coloniza-
tion;affini ty
CLC　S511 S154.381
　　水稻是重要的粮食作物 ,近廿多年来 ,多种农技措施
在农业生产中的推广应用 ,大大提高了水稻的产量 ,其中
增施化肥是主要的增产措施之一.然而 ,化肥的过度使用
对水 体 和 土 壤 造 成 了 严 重 污 染[ 9] .为 实 现
收稿日期:2001-05-11　　接受日期:2001-09-27
＊国家自然科学基金资项目(No.39970027)　Supported by the National
Natural Science Fundat ion of China(No.39970027)
＊＊通讯作者　Corresponding author
农业的可持续性发展和保护生态平衡 ,人们正试图减少
化肥用量 ,希望通过一些新型的生物肥料和农技措施解
决上述问题 ,提高作物特别是水稻的产量.
近年来 ,研究者们不断从不同方面探索水稻的固氮
作用 ,然而不论是水稻根圈的联合固氮作用 ,还是诱导水
稻结瘤的共生固氮作用 ,以及试图将根瘤菌的固氮基因
转移到水稻植株内使水稻自生固氮等的研究虽然在实验
室中取得了一定进展 ,但在实践中却收效甚微[ 3 , 4 , 6 , 9 , 11] .
而且人们在研究中发现 ,能诱导水稻结瘤并促进水稻生
长的根瘤菌 ,在拟根瘤中并没有固氮酶活性或固氮酶活
性很低 ,有时见到的促生作用仍然是细菌产生的促生物
质带来的结果[ 4] .
水稻-绿肥(紫云英)轮作制曾是我国南方水稻产区
常年实行的一种轮作制度 ,因而水稻土中有丰富的紫云
英根瘤菌资源.根瘤菌除了与寄主共生固氮的作用外 ,不
少菌种还有良好的促生作用[ 1 , 5 , 9～ 12] .本文的研究是将
从水稻种子分离到的紫云英根瘤菌不同菌株与不同水稻
品种配对接种 ,调查它们之间的亲和性和促生性 ,筛选出
可用作水稻菌肥的促生菌 ,为水稻促生菌肥的研制打下
基础.
1　材料与方法
1.1　材 料
1.1.1　供试水稻品种　　汕优63 、汕优 64 、马协 118-2 、
马协 63 、珍 A一代 、博优湛 19 、冈优 151 、珍糯 、鄂梗杂一
号 、汕优晚 3 ,以上水稻种子购自湖北省种子集团公司.
1.1.2　培养基[ 2] 　　SM 培养基 、YMA培养基 、Jensen
半固体培养基(无氮植物培养基).
1.2　方 法
1.2.1　从种子中直接分离紫云英根瘤菌　　将每种水
稻种子各称取两份 ,每份 10 g.一份先用无菌水浸泡约 6
h ,待种子吸水软化后 ,在无菌研钵中磨碎;另一份表面灭
菌(75%酒精 5 min , 0.1%酸性升汞 5 min , 无菌水洗涤
10次)后研磨.然后将两种样品分别以 10倍系列稀释到
10-3 ,取 0 ～ 3各级稀释液接种紫云英琼脂管.接种 1 wk
后观察结瘤情况 , 2 mo 后计数 ,并从根瘤中分离根瘤菌 ,
具体方法参见文献[ 2] .
1.2.2　从水稻幼苗中分离紫云英根瘤菌　　先将种子
催芽后播种到无菌土壤中.待幼苗长至 1 wk时 ,将苗整
株取出 ,并用无菌水洗净根部 ,称取10 g 洗净的水稻苗 2
份 ,一份直接在无菌研钵中研磨 ,另一份表面灭菌(75%
酒精 5 min , 3%～ 4%次氯酸钠 5 min ,无菌水洗涤 10
次).余下步骤同上.
1.2.3　分离菌株的纯化及高效结瘤菌株的筛选　　将
分离到的根瘤菌划线纯化并经镜检后转接到 SM 斜面上
保存.同时将上述菌株活化后 ,用紫云英琼脂管培养法筛
选出现瘤早 、瘤数多 、紫云英叶色绿 、生长好的菌株 ,分别
编号.
1.2.4　紫云英根瘤菌与不同品种水稻亲和性的研究　
　将经过比较筛选出的 2株紫云英根瘤菌和 4个不同水
稻品种(“汕优 63” 、“珍 A 一代” 、“马协 63” 、“博湛优
19”)分别组合 ,同时设置不接菌 CK ,每个处理各设 3个
重复.栽培容器为塑料小桶(高×上底×下底=14 cm×
16 cm ×7.5 cm).
1.2.5　接种物和水稻种子的准备[ 5] 　　将经过催芽的稻
种置菌悬液中(用于不接种 CK的稻种则置于 YMA培养
液中),浸泡约 2 h后 ,取出种子约 20颗 ,按系列稀释平板
法测每颗种子的接种量.其余种子备用.
1.2.6　水稻根圈及根内根瘤菌定殖密度的测定　　水
稻生长 45 d后 ,取样进行根部紫云英根瘤菌测数.先用
镊子轻轻挑去根部的泥块 ,称取 10 g 根样 ,放入盛有 90
mL 无菌水及玻珠的三角瓶中 ,涡旋震荡 10 min , 10倍系
列稀释至10-5.取 3 ～ 5各级稀释液接种紫云英琼脂管 ,
按 MPN 法测数.根内根瘤菌的数量的测定则是取出根
后 ,用无菌水将根洗净 ,再经表面灭菌(75%酒精 5 min ,
3%～ 4%次氯酸钠 5 min ,无菌水洗涤 10次),再在无菌
研钵中将根研磨成匀浆 ,10倍系列稀释至 10-3 ,取 0 ～ 3
各级稀释液接种紫云英琼脂管 ,按 MPN 法测数.同时测
量水稻的茎长 、分蘖数 ,称量地上部鲜重 、地下部鲜重.
以上结果多个平均数间采用 SSR检测进行差异显
著性分析.
2　结果与分析
2.1　分离自稻种和幼苗的紫云英根瘤菌
分离结果见表 1.
由表 1可知 ,采用两种不同的方法 ,从未作表面灭菌
的“汕优 63”和“珍 A一代”种子中均分离到了紫云英根
瘤菌.采用第二种方法 ,从未灭菌的“马协 63”种子中也
分离到了紫云英根瘤菌 ,但采用第一种方法却没有分离
到 ,这可能与水稻种子上所携带的根瘤菌数量没有达到
MPN法的检测下限有关.但在采用第二种方法时 ,随着
水稻种子的萌发和幼苗生长 ,种子上所携带的根瘤菌数
量也会繁殖 ,数量有所增加 ,从而达到了 MPN 法的检测
水平.
从经过表面灭菌的水稻种子中 ,采用两种方法都没
有分离检测到紫云英根瘤菌 ,其原因可能有以下三点:1)
这些水稻品种的种子内确实未带有紫云英根瘤菌;2)水
稻种子内携带的紫云英根瘤菌数量太少 ,未能检测出来;
3)采用酸性升汞进行表面灭菌时 ,作用过于剧烈 ,有可能
将种子上及幼苗内的细菌杀死 ,从而无法检测到.
将分离到的根瘤菌作革兰氏染色观察 ,划线纯化并
作紫云英回接实验 ,得到结瘤较早 、结瘤数较多 、植株生
196 　　　　　　　　应 用与 环 境生 物学 报　　Chin J Appl Environ Biol　　　　　　　　　　　　　　 　　　8卷
表 1　从水稻种子(sd)和幼苗(sdl)分离的紫云英根瘤菌
Tab 1　Rhizobium astragalus strains isola ted from rice seeds(sd)and seedling s(sdl)
水稻品种
Rice cultivar
不同稀释度下紫云英琼脂管的结瘤数 Nodules in dif ferent dilutions＊
sd sdl
10-1 10-2 10-3 10-1 10-2 10-3
S NS S S NS S S NS S NS S NS
CK - - - - - - - - - - - -
汕优 63 “ ShanYou 63” - + - - _ - - + - + _ -
汕优 64 “ ShanYou 64” - - - - - - - - - - - -
马协 118-2 “Ma Xie 118-2” - - - - - - - - - - - -
马协 63 “Ma Xie 63” - - - - _ - - + - + _ +
珍A 一代 “Zhen A Yi Dai” - + - + _ - - + - + _ -
博优湛 19 “Bo You Zhan 19” - - - - - - - - - - - -
珍糯 “Zhen Ru” - - - - - - - - - - - -
冈优 151 “Gang You 151” - - - - - - - - - - - -
鄂梗杂一号 “E ge Za Yi Hao” - - - - - - - - - - - -
汕优晚 3 “ Shan You Wan 3” - - - - - - - - - - - -
　　＊“ +”表示有根瘤 With nodule;“ -”表示无根瘤 Without nodule.“ S” 表面灭菌 Surface sterilized;“NS” 未表面灭菌 Surface not sterilized
长健壮的根瘤菌 2株 ,分别编号为 SY63-4和 ZA1D-3.
2.2　紫云英根瘤菌 ZA1D-3和 SY63-4 与 4个不同品种
水稻的亲和性
在无菌盆栽条件下 , 分别接种根瘤菌 ZA1D-3 和
SY63-4 ,在水稻生长 40 d后取样 ,测得结果如表 2.
从表 2可以看出 ,菌株ZA1D-3可以极显著地提高 4
个不同品种水稻的地下鲜重及除“汕优 63”外其余 3个品
种的地上鲜重;对“汕优 63”水稻品种幼苗的株高也有显
著的促进作用 ,而对其它 3个水稻品种“珍A 一代”和“博
湛优 19” 、“马协118-2”的促生作用不显著.但从图 1可以
看出 , 接菌处理的植株高度均明显地高于 CK.菌株
SY63-4对水稻“汕优 63”和“珍 A一代”表现出很明显的
促生作用 ,与CK 相比 ,植株的地下和地上鲜重也极显著
地增加.植株高度高于 CK ,但不显著.
综合表 2及图 1 ,可以看出 ,根瘤菌 ZA1D-3 对 4个
不同品种的水稻均有显著的促生效果 ,而菌株 SY63-4只
对“汕优 63”和“珍 A 一代”促生作用显著 ,可见菌株
ZA1D-3对植物的特异性要求比较低 ,作用范围比较广;
而菌株 SY63-4与水稻的相互作用可能存在一定的特异
性.
通过 MPN法测数得到 ZA1D-3和 SY63-4两个菌株
在4种水稻根部的定殖密度.不论在水稻根圈还是在水
稻根内 ,从稻种“汕优 63”分离到的 SY63-4菌株在“汕优
63”水稻根部的定殖密度较其在其它水稻品种根部的高
出 1 ～ 2个数量级;ZA1D-3在“珍 A 一代”根圈的定殖密
度也较其在其它水稻根圈的定殖密度大.从表 2还可看
出 ,两种根瘤菌均可进入水稻根内 ,而且 SY63-4在水稻
“汕优 63”根内的定殖数量明显高于在其它 3种水稻根内
的定殖密度 ,说明这 2 株根瘤菌与相应的水稻品种间存
在一定的亲和性.
表 2　ZA1D-3和 SY63-4对不同品种水稻生长的影响(-x , N=12)
Tab 2　Effect of inoculation of ZA1D-3 and SY63-4 on grow th of four different rice cultivars(-x , N=12)
处理 T reatment
水稻株高
Plant height
(h/ cm)
地上鲜重/株
Fresh shoot weigh t
per plant(m/ g)
地下鲜重
Fresh root w eight
per plant(m/ g)
MPN法计数
Count ing by M PN method
根外 Ecto-
rhizosphere
根内 Endo-
rhizosphere
汕优 63 “ ShanYou 63” CK 26.975 bcd 1.805 C 2.55 Bb 0 0
ZA1D-3 33.467 a 2.929 ABC 4.713 A 3.11 0.30
SY63-4 28.591 abcd 3.768 A 3.813 A 5.20 2.20
马协 63 “Ma Xie 63” CK 27.508 bcd 2.083 ABC 2.87 B 0 0
ZA1D-3 33 ab 3.767 A 5.911 A 4.54 1.23
SY63-4 26.55 bcd 1.875 BC 2.788 B 3.70 0.70
珍 A 一代“Zhen A Yi Dai” CK 24.475 d 2.157 ABC 1.907 B 0 0
ZA1D-3 31.05 abc 3.366 ABC 4.885 A 4.40 0.48
SY63-4 25.225 dc 3.605 AB 4.844 A 3.60 0.95
博湛优 19 “Bo Zhan You 19” CK 27.667 abcd 2.256 ABC 2.883 B 0 0
ZA1D-3 31.675 abc 3.671 AB 4.868 A 2.7 0.48
SY63-4 25.933 cd 2.999 ABC 2.568 B 3.48 0.30
注 Note:表中同栏内数字后不同小写字母表示差异显著(α=0.05),不同大写字母为差异极显著(α=0.01)The li tt le letters following the data in the same col-
umn indicate the dif ference(α=0.05)and the capital letters indicate the signif icant dif ference(α=0.01).
197　2期　　　　　　　　　　　　　　　　　　张晓霞等:从水稻种子表面分离的紫云英根瘤菌与不同水稻品种亲合性的研究 　　
图 1-1　接种 ZAID-3对“珍 A 一代”生长的影响
Fig 1-1　Effect s of ZA1D-3 on grow th of “Zhen A Yi Dai”
图 1-4　接种ZAID-3对“博湛优 19”生长的影响
Fig 1-4　Effect s of ZA1D-3 on grow th of “Bo zhan You 19”
图 1-2　接种ZAID-3对“汕优 63”生长的影响
Fig 1-2　Ef fect s of ZA1D-3 on growth of “ Shan You 63”
图 1-5　接种 SY63-4对“汕优 63”生长的影响
Fig 1-5　Ef fect s of ZA1D-3 on growth of “ Shan You 63”
图 1-3　接种 ZAID-3对“马协 118-2”生长的影响
Fig 1-3　Ef fects of ZA1D-3 on grow th of “Ma Xie 118-2”
图 1-6　接种 SY63-4对“珍 A 一代”生长的影响
Fig 1-6　Effect s of ZA1D-3 on grow th of “Zhen A Yi Dai”
图 1　紫云英根瘤菌 ZA1D-3 和 SY63-4 对不同品种水稻生长的影响
Fig 1　Effects of Rhizobium astragalus ZA1D-3 and SY63-4
on g rowth o f four different rice cultivars
198 　　　　　　　　应 用与 环 境生 物学 报　　Chin J Appl Environ Biol　　　　　　　　　　　　　　 　　　8卷
3　讨　论
通过不同方法 ,分别从未表面灭菌的“汕优 63”和
“珍A 一代”两种水稻的种子中分离到紫云英根瘤菌 ,而
在经过表面灭菌的种子中未分离到紫云英根瘤菌 ,说明
紫云英根瘤菌可能仅仅存在于这些水稻种子的表面 ,而
种子内并没有紫云英根瘤菌或数量极少.至于水稻种子
外部是如何携带上紫云英根瘤菌的 ,有待进一步的调查
研究.
分离到的紫云英根瘤菌接种 4个不同品种的水稻 ,
从“汕优 63”分离的菌株 SY63-4在“汕优 63”根圈的数量
比SY63-4在其它 3种水稻根圈的数量多出 1 ～ 2个数量
级;从“珍 A一代”分离的菌株 ZA1D-3在“珍 A 一代”根
圈数量也较 ZA1D-3 在其它 3 种水稻根圈的定殖数量
多.这说明特定菌株与相应水稻间可能存在一定的亲和
性.或许这也是这两种水稻种子上之所以携带紫云英根
瘤菌的原因之一.关于 PGPR菌株与特定的植株之间存
在亲合性的问题 ,Chanw ay 在 1988年的研究芽孢菌属的
菌株对春小麦的促生作用中提出过[ 7] .但这种亲和性的
具体机理如何 ,还有待进一步研究.也许是在水稻和紫云
英长期的轮作过程中 ,紫云英根瘤菌已与水稻形成了一
种特定的关系.
鸣谢　本实验在实施过程中还得到了王远山等同学的
热情帮助.
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