全 文 ：文章编号: 1007-0435( 2006) 01-0020-04
转 基 因冰 草 植 株 耐 盐 性 研 究
徐春波1,米福贵2* ,王　勇2
( 1.中国农业科学院草原研究所,呼和浩特 010010; 2.内蒙古农业大学, 呼和浩特 010019)
摘要: 以转 P 5CSF129A 基因的冰草属( A gropy r on Gaer tn)阳性植株( 97# 、19# 、66# )和阴性植株为材料, 测定叶片脯
氨酸含量、相对含水量、质膜透性和 K + / Na +比值 4 项耐盐指标。结果表明:转基因植株的脯氨酸含量明显高于阴性植
株, 说明 P 5CSF129A 基因已经在冰草转化植株体内表达,提高了转基因植株的耐盐性; 其它耐盐指标的结果也证明转
基因冰草植株的耐盐性高于对照植株。对转基因植株和阴性植株的耐盐能力综合评定结果是 97# > 19# > 66# > 阴性
植株。
关键词: 冰草; 耐盐指标; P 5CSF129A 基因
中图分类号: Q943　　　文献标识码: A
Research on Salt-Tolerance of Wheatgrass Transformed by P5CS Gene
XU Chun-bo 1, M I Fu-gui2 , WANG-Yong 2
( 1. Grass land Research Ins t itute of Chinese A cad emy of Agriculture S ciences, Huhh ot ,
Inner M on golia Autonomous Reg ion 010010, China;
2. Inner Mongolia Ag ricul tu re University, Huhhot , In ner Mongol ia Autonomous Region 010019, C hina)
Abstract: Plants tr ansformed by P 5CS gene ( 97# 、19# 、66# ) and negat ives w ere tested using several salt tol-
er ance index such as prol ine content , leaf-w ater content , plasma membrane permeability and rat io of K
+ / Na
+ .
The results show that the t ransgenic w heatg rass plants accumulated mo re pr oline than CK under salt-st ress
condit ions, which proved that P 5CSF129A had funct ioned in t ransgenic w heatgrass plants and had increased
their salt-tolerance. T he r esul ts also show that t ransgenic w heatg rass plants had nurtur ed g reater salinity tol-
er ance than CK. According to physiolog ical targ et in synthet ically evaluat ion, the result is 97# > 19# > 66#
> Negat ives.
Key Words : Wheatg rass; Salt tolerance; P5CSF129A gene
　　 冰草属( A gropy ron Gaertn. )牧草为禾本科早熟
禾亚科小麦族植物。全世界近百种,大都分布于欧亚大
陆温寒带区域的草原及沙地上,我国共有 15种 [ 1]。冰
草属植物为寿命较长的多年生疏丛牧草, 多生长于干
旱、半干旱草原和荒漠草原。其抗逆性较强,春季返青
早,秋季枯黄晚, 茎叶柔嫩,营养丰富, 适口性好, 是西
北干旱半干旱地区改良草场以及建立人工草地和生态
建设的重要牧草之一。
脯氨酸是植物体内非常重要的渗透调节化合物,它
的积累可增加植物对干旱、盐碱的耐受能力。P5CS (
1-
吡咯啉-5-羧基合成酶基因)在植物中催化脯氨酸生物
合成的前两部反应, 其活性受到脯氨酸含量的反馈抑
制。P5CSF 129A 是P 5CS 去除反馈抑制的突变体,这
种反馈抑制的去除, 导致植物体中脯氨酸含量成倍增
加, 加强了植物在渗透压胁迫下的保护。Hong 等[ 2]将此
基因导入烟草,使脯氨酸累积表达量增加两倍, 转基因
的幼苗可在 200 mmo l/ L NaCl中正常生长。本实验以
转 P5CSF129A 基因的阳性植株为材料, 通过测试叶片
相对含水量等生理指标,对其耐盐能力进行评定,为最
终获得耐盐性状稳定的新品种提供了理论依据。
收稿日期: 2005-03-15; 修回日期: 2005-09-23
项目资助: 国家转基因植物研究与产业化专项资助( J-2002-B-008)
作者简介∶徐春波( 1979-) , 女, 内蒙古扎兰屯市人,硕士,从事牧草育种工作, E-mail: xcb972002@163. com; * 通讯作者 Author for correspon-
dence, E-mail: mfg ui@yahoo. com. cn
第 14卷　第 1期
　Vo l. 14　 No . 1
草　地　学　报
ACT A AGRESTIA SIN ICA
　　　2006年　 3 月
　March　 2006
1　材料和方法
1. 1　实验材料
以 PCR检测过的 3株阳性冰草( A . cr istatum)植
株[ 3] ( 97# , 66# , 19# )和普通冰草植株(阴性植株)为
实验材料。
1. 2　实验处理
把冰草阳性植株和阴性植株,移栽到塑料钵(营养
土∶蛭石= 4∶1; 上口直径×下口直径×高为 20 cm
×10 cm×20 cm )中,放置于温室,昼夜温度为 25℃～
28℃,使其恢复生长 3周。待苗完全恢复生长时,用含
NaCl 80、160和 240 mmol/ L 的盐水浇灌, 为避免盐冲
击效应,采用每天递增 1/ 4浓度的方式加盐,直至预定
的处理浓度。为减小 NaCl浓度的变化幅度,浇灌量为
土壤持水量。两周后取样进行测定各项指标。
1. 3叶片相对含水量测定
取冰草叶片, 用自来水和无离子水冲洗干净,用吸
水纸吸干表面水分, 称鲜重后置 105℃烘箱中杀青
10 min, 转到 80 ℃烘至恒重, 称得干重,含水量按(鲜
重- 干重) /鲜重×100%计算。
1. 4　叶片质膜透性(相对电导率)测定
在不同处理植株的相同部位取材, 称 0. 2 g, 剪成
大小均一的小块, 加蒸馏水 12 ml在 25℃, 40 r pm 振
荡 4 h, 用 DDS-307型电导率仪测定电导率 C1; 然后
于沸水浴中加热 15 m in, 冷却后测其电导率 C2, 重复
3次。叶片质膜透性用相对电导率表示,相对电导率=
C1/ C2×100%。
1. 5　Na+、K+ 离子含量测定
参照 Matsushita( 1991)方法 [ 4] , 将盆栽苗除去培
养介质,迅速用自来水和去离子水冲洗,烘干后将材料
研磨成粉末,称 20 mg , 加 4 ml 去离子水于 100 ℃沸
水中煮沸 2 h, 冷却后定容至 20 ml, 5000 g 离心 15
min,上清液用于离子测定。空白对照为去离子水, 重
复 3次。用日立 Z-8000原子吸收光谱仪测定Na+ , K +
含量(单位: mg 离子/ g FW )。
1. 6　脯氨酸含量测定
参照王守生方法[ 5] , 称取 0. 2 g 样品,放入大试管
中,加 7 m1 3 %磺基水杨酸, 摇匀, 置沸水浴中, 盖上
玻璃球, 浸提 l0 min(摇动 1～2次) ,冷却至室温。分别
吸取 2 m1浸提液、冰醋酸和酸性茚三酮至加塞试管
中,摇匀,置沸水浴中,盖塞, 显色 60～75 min(摇动 7
～9次)。冷却后,加入 4 m l甲苯, 振荡 2 min,静置 60
～75 min(轻轻震动 2～3 次, 以震落甲苯表层弯月面
托起的细小水珠)。用巴氏吸管吸取甲苯层至 0. 5 cm
比色皿中,在 520 nm 波长下比色。
2　结果与分析
2. 1　盐胁迫对转基因冰草叶片相对含水量的影响
叶片相对含水量的变化能反映出植株耐盐性强
弱,变化较大的植株耐盐性较弱,反之则较强。转基因
冰草植株和阴性植株的叶片相对含水量都是随着盐胁
迫浓度的增加而变小, 但变化幅度不同,转基因冰草植
株和阴性植株在 80和 160 mmol/ L 浓度时叶片相对
含水量变化幅度相差不大, 仅相差 4%和 7% ;盐浓度
增加到 240 mmo l/ L 时, 它们之间的叶片相对含水量
差异增大,达到24%(图 1)。转基因植株叶片相对含水
量的变化较之阴性植株叶片变化小, 反映出转基因植
株的保水能力高于阴性对照植株,从而提高其耐盐能
力。
图 1　盐胁迫对转基因冰草植株叶片相对含水量的影响
F ig . 1　Leaves relativ e w ater cont ent act ivity o f tr ansgenic
wheat gr ass plant s under salt stress
2. 2　盐胁迫对转基因冰草叶片质膜透性的影响
细胞膜是活细胞和环境之间的界面与屏障, 各种
不良环境对细胞的影响往往首先作用于生物膜 [ 6]。一
般说来盐胁迫处理后,耐盐品种细胞膜系统受损程度
小,主要表现在细胞膜透性小;敏感品种细胞膜系统受
损严重,表现为细胞膜透性大[ 7～10]。
在受到盐胁迫处理后, 转基因冰草植株与阴性植
株的细胞膜透性均随着盐浓度的增高而增加,但二者
细胞膜透性增加的幅度存在明显差异(图 2)。当盐浓
度在 80～160 mmo l/ L 时, 转基因冰草植株膜透性变
化不大,接近阴性植株; 盐浓度在 160～240 mmol/ L
21第 1期 徐春波等:转基因冰草植株耐盐性研究
时细胞膜透性差距逐渐加大。转基因植株膜透性增加
较阴性植株膜透性增加平缓, 表明其细胞膜受害程度
轻,耐盐性强。
图 2　盐胁迫下转基因植株叶片质膜透性的变化
F ig . 2　Plasma permeability activ ity of tr ansgenic w hea tgr ass
plants under salt str ess
2. 3　盐胁迫对转基因冰草叶片游离脯氨酸的影响
游离脯氨酸的积累是植物在逆境条件下的普遍反
应, 不同的盐浓度下, 星星草 ( Puccinel lia tenuif or a
( T ur cz. ) )、羊草( L eymus chinensi s)、鸡脚草( Daoty lis
glomerata L. )等牧草体内的游离脯氨酸均有不同程
度的积累[ 11, 12] , 其作用可能对细胞的渗透调节有利,
而对蛋白质的过度分解是不利的 [ 13, 14]。
不同植物游离脯氨酸含量增加的幅度不同, 反映
抵抗盐胁迫的能力。游离脯氨酸含量增加幅度越大则
该草种越不耐盐, 反之就越耐盐。由图 3可见, 在盐胁
迫下转基因冰草植株脯氨酸含量比阴性植株高; 二者
叶片游离脯氨酸的含量随盐浓度增高都有增加, 转基
因冰草植株增加的幅度小, 阴性植株增加的幅度大。结
果表明转基因冰草植株比阴性对照耐盐。
图 3　盐胁迫对转基因植株叶片游离脯氨酸的影响
Fig . 3　Content o f pr oline activ ity of t ransgenic
w heat gr ass under salt stress
2. 4　盐胁迫对转基因冰草叶片 Na+ ,K+ 含量的影响
植株在受盐胁迫时体内经常积累 Na+ 而引发离
子效应, 细胞中 Ca2+被 Na+ 交换出来,导致膜的完整
性和对 K + 的选择性遭到破坏[ 15]。植物维持较高的
K
+
/ Na
+是在盐胁迫条件下保证气孔正常功能和许多
代谢正常进行的前提。禾本科牧草 K + / Na+ 比值与其
耐盐性呈正比 [ 16]。随着盐浓度的增加,转基因冰草植
株与阴性植株都表现出 Na+ 的增加, K + 的减少, 但它
们之间存在差异,在同等盐浓度下转基因冰草叶片中
K
+ / Na
+较阴性植株大,具有较强的耐盐性(图 4)。
图 4　盐胁迫下转基因冰草植株 K + / Na+ 的变化
Fig. 4　The ratio of K + / Na+ activ ity of t ransgenic
wheat gr ass plant s under salt stress
3　讨论与结论
3. 1　根据最近 10年的研究, 高等植物耐盐的分子机
制主要有5种假说[ 17, 18] ,即诱导相容性物质的生成、调
节离子的吸收、改变光合作用途径、水分子通道蛋白及
抗氧化防御系统。目前耐盐基因工程研究都基于第 1
种假说。如郭岩等利用甜菜碱醛脱氢酶( BADH)基因
转化水稻, 结果转基因水稻的耐盐性得到提高 [ 19]。董
云洲等将肌醇甲基转移酶( Im tl )基因转入烟草后获得
的转化植株, 表现出明显的耐盐能力,株高、单株鲜重、
生长势等指标具有显著优势 [ 20]。
3. 2　P 5CSF129A 基因是 P 5CS 基因去除反馈抑制
的突变体,导致植物体中脯氨酸含量成倍增加, 行使渗
透调节和渗透保护的作用, 使植物细胞在高盐环境下
维持正常的生理功能。因此,通过P 5CSF 129A 基因的
高效表达,可望提高冰草的耐盐能力,在短期内培育出
适合于我国西部地区栽培的冰草新品种。
3. 3　综合脯氨酸含量、叶片相对含水量、质膜透性、
K
+
/ Na
+比值耐盐指标测定结果,在低盐浓度( 80～160
mmol/ L )时转基因植株和阴性植株间各指标变化幅度
相差不大,但当盐浓度加大到 240 mmol/ L 时转基因植
株和阴性植株间各指标变化幅度的差距明显加大。根据
测定生理指标对转基因植株和阴性植株的耐盐能力综
合评定,结果是 97# > 19# > 66# > 阴性植株, 表明
22 草　地　学　报 第 14卷
P 5CSF129A 基因已经在冰草转化植株体内表达,其耐
盐性得到了提高。但高盐胁迫对植物生长发育的影响是
非常复杂的。盐生植物之所以能在长期干旱和盐渍的环
境中正常生长,是多种抗盐机制综合作用的结果。脯氨
酸的合成可能增强了冰草对盐胁迫的响应(提高转基因
冰草植株中脯氨酸的合成量) , 但也可能与冰草植株内
在的耐盐机制协同作用, 使转基因植株总体耐盐能力增
强。今后对转基因冰草生理代谢、细胞结构和根的形态
发生进一步深入研究,将有助于揭示脯氨酸积累在植物
中的作用及其与冰草植株耐盐的关系。
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