全 文 ：第 16 卷 第 3 期
Vol. 16 No . 3
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2008 年 5 月
May 2008
白三叶品种组织结构与抗寒性的关系
赵 伟1 , 陈雅君1, 2* , 高 阳1 , 张雪岩1, 梁 敏1 , 何阳波1
( 1.东北农业大学园艺学院, 黑龙江 哈尔滨 150030; 2.东北林业大学森林植物生态学实验室, 黑龙江 哈尔滨 150040)
摘要: 针对引进的白三叶( T r if ol ium r ep ens L . )草坪品种在我国北方园林应用中存在的抗寒性问题,结合国产白
三叶资源抗寒性优势,研究低温条件下, 不同白三叶组织结构的变化特点和适应性。结果表明: 叶肉栅栏细胞内叶
绿体数和叶绿体面积与抗寒性有关;低温胁迫下, 不同品种叶绿体结构变化最明显, 抗寒性强的品种在一定低温范
围内保持了较完整的结构;根结构中的木质部、韧皮部比率和导管直径也与抗寒性有关, 木质部比率大, 韧皮部小,
导管直径小,品种抗寒性强。
关键词: 白三叶; 叶绿体; 木质部; 韧皮部; 抗寒性
中图分类号: S812; Q945. 1 文献标识码: A 文章编号: 1007-0435( 2008) 03-0234-05
Tissue Structure Associated with Cold Resistance in Trif olium repens L. Cultivars
ZHAO Wei1 , CHEN Ya-jun1, 2* , GA O Yang1 , ZHANG Xue-yan1 , LIANG M in1 , HE Yang-bo1
( 1. H ort icul ture College, Northeast Agricul tu ral Un iversity, H arbin , H eilongjian g Province 150030, China;
2. Forest Plan t Ecology Laboratory, Northeast Forest ry University, Harbin, H eilong jiang Province 150040, China)
Abstract: In view of the cold resistance problem o f int roduced white clo ver using in gardening in no rthern
China and the co ld resistance advantag es o f nat ive w hite clover, the changes o f tissue st ructure and the a-
daptabilit ies of different w hite clover cult ivars w ere studied under contro lled low temperature conditions.
The results show that the number and ar ea o f chloroplasts in palisade cells w ere related to the cold r esist-
ance o f cultivars; changes of chloroplast st ructure in dif ferent cult ivars w er e evident under co ld st ress,
st rong co ld r esistant cult ivars kept the st ructure w ell comparativ ely under a given co ld temper ature range;
the xy lem ratio, phloem rat io, and vessel diameter in ro ot w ere also associated w ith cold resistance of cult-i
v ar s. St rong co ld resistance cultivars had higher rat io of xy lem, low er ratio of phloem, and narrow diame-
ter of vessel.
Key words: White clo ver; Chloroplast ; Xy lem ; Phloem; Cold resistance
白三叶( T ri f ol ium r ep ens L. )是豆科三叶草
属多年生草本植物, 起源于地中海东部地区, 我国四
川、贵州、云南、广西、黑龙江等地均有野生资源分
布。白三叶适宜生长温度为 19 ~ 24 , 栽植简
单,成本较低; 高低适中,浓绿的叶子,白色的小花,
在城市居民区、公共绿地、道路护坡的绿化、封闭式
观赏草坪及水土保持方面发挥着重要作用[ 1~ 3] 。但
目前我国所利用的白三叶草坪草种主要是引进国
外培育的品种, 其在我国北方地区种植存在越冬
和抗寒性差等问题, 而国产白三叶资源极为丰富,
是培育抗性品种的优良基因, 为此选取 3个引进
的白三叶品种和 1 个黑龙江乡土品种, 通过对叶
片细胞叶绿体、根木质部、根韧皮部厚度及导管直
径的观察, 分析品种间叶片超显微结构和根结构
适应低温的特点,了解其与抗寒性的关系。
1 材料与方法
1. 1 试验地概况
试验于2005年在东北农业大学园艺实验站进
行,地处北纬 4412, 东经 12642, 为通气性和保
水性良好的沙壤土, 有机质含量3. 32 g/ kg, pH 7. 0。
每品种的播种量为 10 g/ m2 , 试验小区长 3 m, 宽
1 m,随机区组排列, 各品种重复 4次。
收稿日期: 2007-11-20; 修回日期: 2008-01-08
基金项目: 黑龙江省 十一五攻关项目( GB06B112-5) ; 黑龙江省教委科技项目( 10531014)
作者简介: 赵伟( 1971-) ,女,高级工程师,博士研究生,主要从事园林植物资源和逆境生理研究; * 通讯作者 Auth or for correspondence,
E- mail : chenyajun622@ 163. com
第 3期 赵伟等:白三叶品种组织结构与抗寒性的关系
1. 2 供试材料
供试的白三叶( T ri f ol ium r ep ens L. )品种中,
有 3个引自黑龙江三丰园林公司, 分别为: 瑞文德
( Rivendel, 丹麦)、海发 ( Haifa, 澳大利亚)、铺地
( Pr op,新西兰) ,另 1个品种来自黑龙江省尚志市山
区,为野生种,称为小黑龙( M ini Black Dragon)。
1. 3 研究方法
植物生长期间进行正常田间管理, 测定各项生
长指标和形态指标。2005年 6月,取未处理的根样
品用于石蜡制片,同时选取小黑龙、瑞文德、海发、铺
地第 2 功能叶片在室内进行低温处理: 先 4 无光
照处理两天,再连续 16 h、- 10 无光照低温处理;
室温 25 下处理作为对照, 用于电镜观察。
叶片超微结构的观察参照倪忠祥生物电子显
微镜方法 [ 4]。将叶片剪下用蒸馏水冲洗后,切成长
0. 5 cm 小段,将样品用台式离心机以 4000 r/ m in离
心 5 min 后, 加入 2. 5%, pH 7. 2戊二醛进行前固
定,并置于 4 冰箱中保存。用 pH 7. 2磷酸缓冲液
冲洗 3次,每次 10 m in,再用 2%四氧化锇固定 1. 5
h,用 pH 7. 2磷酸缓冲液再冲洗 3次,每次 10 m in。
分别用浓度为 50%、70%、80%、90%、100%的乙酯
进行脱水,每次 10- 15 min, 100% 的 3 次, 其他浓
度各 1次。然后用 100%乙醇丙酮= 1 1和纯丙
酮各置换 1 次, 每次 10 min。用纯丙酮:环氧树脂
812包埋剂按 1 1、1 2、1 3 各 1 h、2 h、2- 3 d
浸透,浸透后将样品置于恒温培养箱中, 40 17 h、
45 24 h、60 24 h 聚合,用 ULT RACU T E 型超
薄切片机进行切片, 用醋酸双氧铀、柠檬酸铅在
25 下分别对样品染色 15- 20 m in, 用双重蒸馏水
冲洗干净后放入培养皿中待检。在 JSM-5610LV
透射电镜下观察叶片叶绿体、线粒体变化情况。
根解剖结构的观察参照李正理的植物制片技
术[ 5] 一书中的石蜡切片法, 基本程序是:取材 固
定 冲洗脱水透明 浸蜡包埋 切片粘片
去蜡 染色 脱水封藏,用 Leica RM 2135石
蜡切片机进行切片,将典型制片在 J-FL50i55i型荧
光显微成像系统摄影并测量根的横切半径、木质部
厚度、韧皮部厚度、导管直径。
1. 4 数据处理
试验数据采用 Excel2003软件处理, 差异显著
性测验采用 DPS软件完成,图片清晰度和标识采用
Pho to shopCS 软件完成。
2 结果与分析
2. 1 各品种形态与生长特性和低温适应性的关系
海发的叶片显著大于铺地、瑞文德及小黑龙
( P< 0. 01)。铺地、瑞文德和小黑龙间叶宽和叶长
差异不显著。海发的株高与其他 3个品种差异极显
著( P< 0. 01) , 铺地和瑞文德的株高间差异显著
( P< 0. 05) ,与小黑龙差异极显著( P< 0. 01) ,瑞文
德和小黑龙差异不显著。海发的根长显著大于小黑
龙( P < 0. 05) , 极显著大于铺地和瑞文德 ( P <
0. 01) , 而铺地、瑞文德和小黑龙间差异不显著。各
品种的茎节长度海发极显著大于其他品种 ( P <
0. 01) , 铺地和瑞文德间差异不显著, 但极显著大于
小黑龙( P< 0. 01) , 而瑞文德和小黑龙间差异显著
( P< 0. 05)。海发的分枝数极显著少于小黑龙( P<
0. 01) , 显著少于铺地和瑞文德( P< 0. 05) , 铺地、瑞
文德和小黑龙 3个品种分枝数相差不大。白三叶根
茎比为小黑龙最大, 海发最小,表明不同白三叶品种
地下和地上生物量不同(表 1)。
由此可见海发生长较快,但分枝较少,叶片较大;
小黑龙根系生长快,地上部生长慢, 分枝多, 叶片窄
长,茎节短,性状特点在抗寒性方面有一些优越性。
表 1 白三叶品种形态特征和生长性状
Table 1 Morpholog ical and g rowth characteristics of T . r ep ens cultivars
品种
Cult ivar
叶宽( cm)
Leaf breadth
叶长( cm)
Leaf length
株高( cm)
Plant height
根系长( cm)
Root length
茎节长度( cm)
Node length
分枝数(个)
Branch numbers
根/茎比
Rat io of root / stem
小黑龙 Mini Black Dragon 0. 92Bb 1. 10bB 8. 50cC 8. 47bAB 7. 67cC 4. 7aA 0. 1917aA
瑞文德 Rivendel 1. 08bB 0. 97bB 9. 40cBC 7. 20bB 9. 40bBC 4. 0aAB 0. 1297bB
海发 Haifa 1. 77aA 1. 68aA 13. 37aA 10. 93aA 12. 15aA 1. 7bB 0. 096bB
铺地 Prop 1. 13bB 1. 03bB 11. 17bB 8. 03bB 10. 07bB 4. 0aAB 0. 118bB
2.2 叶片细胞叶绿体超微结构与低温适应性
2.2. 1 正常室温下白三叶叶片叶绿体超微结构
白三叶不同品种叶片栅栏细胞中, 叶绿体数目
变化不大,排列顺序为:小黑龙> 瑞文德> 铺地> 海
发。而在叶绿体面积上, 铺地和海发极显著小于小
黑龙和瑞文德( P< 0. 05) , 但铺地和海发、小黑龙和
瑞文德间差异不显著, 叶绿体面积排列顺序为: 小黑
龙> 瑞文德> 铺地> 海发(表 2)。
235
草 地 学 报 第 16卷
在正常室温条件下, 其叶肉细胞中的叶绿体为
梭形或长椭圆形,沿着质膜分布,其基粒片层均顺着
叶绿体纵轴平行排列, 结构清晰可辨, 片层排列整
齐、密集、均匀(图 1~ 4)。
表 2 白三叶不同品种叶肉细胞中叶绿体数目和面积
Table 2 Number and ar ea o f chlor oplast in mesophyll cells of 4 T . r ep ens cultivar s
品种 Cult ivar 小黑龙 Mini Black drag on 瑞文德 Rivendel 海发 Haifa 铺地 Prop
叶绿体数目 Chloroplast number 6. 8aA 6. 2 aA 6. 0aA 6. 2aA
叶绿体面积( m2) Chlor oplast area 11. 93aA 11. 37 aA 5. 70bB 6. 47bB
2. 2. 2 - 10 低温下白三叶叶片叶绿体超微结构
与室温对照组相比, 经模拟低温- 10 处理后, 4
种白三叶叶绿体均受到不同程度的影响, 但不同
品种的叶绿体对低温的反应不同(图 5~ 8)。小黑
龙叶绿体结构基本不受影响, 与对照组没有明显
差异, 说明其对- 10 低温有一定抗寒性, 此时叶
图 5 小黑龙叶绿体- 10 ( 10000)
F ig. 5 Chloroplast of M ini Black Dragon at
- 10 ( 10000)
绿体仍未失活,结构完整。瑞文德叶绿体膜破裂,
基质片层稍有断裂。铺地叶绿体仍可见片层结
构,但片层扭曲、变粗,而海发叶绿体膜破裂, 基粒
片层排列紊乱, 类囊体空泡化, 基质片层断裂, 基
粒片层开始降解。4 种白三叶叶绿体中淀粉粒明
显增多。
图 6 瑞文德叶绿体- 10 ( 10000)
Fig . 6 Chlor oplast o f Riv endel at
- 10 ( 10000)
236
第 3期 赵伟等:白三叶品种组织结构与抗寒性的关系
2. 3 根结构与低温适应性的关系
白三叶不同品种根次生结构的木质部比率经
SSR检验差异不大, 韧皮部比率除小黑龙极显著小
于瑞文德、铺地和海发( P< 0. 01) , 其他差异不显
著,顺序为小黑龙< 瑞文德< 铺地< 海发;木质部比
率除小黑龙极显著大于瑞文德、铺地和海发 ( P<
0. 01) , 其他差异不显著,顺序为:小黑龙> 瑞文德>
铺地> 海发;导管直径除小黑龙显著小于瑞文德、铺
地和海发( P< 0. 05)外, 其他差异不显著, 顺序为:
小黑龙< 瑞文德< 铺地< 海发(表 3,图 9~ 12)。
表 3 白三叶不同品种根结构特点
Table 3 St ructur al characters o f the r oo t of 4 T . r ep ens cultivar s
品种
Cultivar
根横切半径(m)
Radius of root
木质部厚度( m)
Thickness of xylem
韧皮部厚度( m)
Thickness of phloem
木质部比率( %)
Rat io of xylem
韧皮部比率( % )
Ratio of phloem
导管直径(m)
Diameter of vessel
小黑龙 M ini Black Dragon 665. 73bB 303. 56aA 221. 62bB 0. 456aA 0. 3329bB 10. 26bB
瑞文德 Rivendel 528. 63cB 198. 36bB 238. 66bB 0. 3752bB 0. 4515aA 13. 78aAB
海发 Haifa 921. 64aA 335. 01aA 453. 52aA 0. 3635bB 0. 4921aA 14. 81aA
铺地 Prop 894. 42aA 333. 24aA 434. 97aA 0. 3726bB 0. 4863aA 14. 53aA
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草 地 学 报 第 16卷
3 讨 论
3. 1 白三叶叶片细胞超微结构对低温的适应
低温胁迫使植物细胞结构发生一系列变化, 细
胞器和膜结构的稳定性是衡量植物抗寒能力的关键
所在。叶绿体是植物进行光合作用的场所, 也是细
胞中对逆境(包括寒害和冻害)最敏感的细胞器。关
于低温胁迫对叶绿体超微结构的影响研究较多。简
令成等[ 6] 在小麦越冬过程的细胞学研究中证实, 小
麦细胞器结构的稳定性同植株的抗寒力呈正相关。
研究证明在低温下叶绿体的变化最明显, 叶绿体的
排列、片层结构、淀粉粒的数量以及线粒体结构在低
温胁迫下均发生变化 [ 7~ 10]。金研铭等 [ 11]对牡丹引
种及其抗寒性的研究中发现, 抗寒性强的品种叶绿
体数目多且面积大。从本试验选择的 4个白三叶品
种看,正常室温条件下各品种叶绿体结构基本相同,
数目差异不大, 但面积有差异,为小黑龙> 瑞文德>
铺地> 海发。- 10 低温处理,小黑龙叶绿体结构
基本不受影响, 结构完整,表明其在- 10 低温胁迫
范围内,有较强的抗性; 瑞文德叶绿体膜破裂, 基质
片层稍有断裂; 铺地叶绿体仍可见片层结构, 但片层
扭曲、变粗;而海发叶绿体膜破裂,基粒片层排列紊
乱,类囊体空泡化,基质片层断裂, 开始降解, - 10
低温,引起细胞内结冰,其对叶绿体的影响主要是冻
害,引起叶绿体结构的较大损伤及破坏,且该伤害不
可逆。由于在长期系统发育过程中,不同品种随地
理分布产生了广泛的种内遗传变异,形成了各自对
环境的要求,其抗寒性有一定差异。本研究中,小黑
龙抗寒性最强, 瑞文德和铺地次之,海发最差。低温
处理后,叶绿体的淀粉粒明显增多,这可能与低温阻
碍了淀粉的水解和向外运输有关[ 12] 。
3. 2 白三叶根结构与低温的适应性
植物的不同器官抗寒性不同, 对于草坪植物, 越
冬器官的抗寒性大小决定着草坪植物的返青状况,
从根本上限制草种在寒冷地区的生存和繁衍 [ 13]。
根系活力是植物生长的重要生理指标之一, 根系活
力高,表明植物根系的吸收及代谢功能强,对植物生
长有利。低温冷害下根系活力降低,根系吸收养分
能力减弱,代谢受阻。郭修武等 [ 14]认为葡萄根系
结构特点与抗寒性有一定相关性,不同品种皮层细
胞和射线细胞大小、组织紧密度等方面存在差异, 抗
寒品种组织较紧, 细胞小; 不抗寒品种组织疏松, 细
胞大,而且抗寒品种与不抗寒品种根系结构中韧皮
部和木质部所占比率也有差异, 以抗寒品种韧皮部
所占比率低, 导管小,不抗寒品种高。本研究发现,
单一的木质部或韧皮部的厚度在同一品种的不同样
品间有较大的差异, 但其在根结构中的比率在不同
的样品间保持相当的一致性。说明木质部比率和韧
皮部比率与抗寒性存在着遗传上的相互制约关系,
反映了白三叶品种间抗寒性在遗传上的结构特征,
可作为白三叶品种抗寒性的鉴定指标。
4 结 论
4. 1 正常室温条件下, 各品种叶绿体结构基本相
同,栅栏细胞叶绿体面积大小依次为:小黑龙> 瑞文
德> 铺地> 海发; - 10 低温处理,除小黑龙叶绿体
结构基本完整,其他 3个品种均遭到破坏,但以海发
受害程度最重。
4. 2 品种间根次生结构木质部比率差异不大, 但小
黑龙显著大于其它 3个引进品种; 韧皮部比率和导
管直径除小黑龙显著较小外, 其余 3 个品种间差异
不显著,韧皮部比率和导管直径大小依次为小黑龙
< 瑞文德< 铺地< 海发。4个白三叶品种抗寒性大
小为小黑龙> 瑞文德> 铺地> 海发。
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(责任编辑 梁艳萍)
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