全 文 ：文章编号: 1007-0435( 2006) 04-0315-05
高羊茅叶斑病病原鉴定及生物学特性
郑 莉1, 黄俊斌1* , 向培建2
( 1. 华中农业大学植物科技学院,湖北省作物病害监测与安全控制重点实验室,武汉 430070, 中国;
2.加拿大圭尔夫大学, 环境生物系, 圭尔夫,安大略省, N1G 2W1,加拿大)
摘要: 从宜昌市夷陵区草坪型高羊茅(Festuca arundinacea. )分离出引起叶斑病的病原真菌,对该菌进行了形态学观察、
致病性鉴定、核糖体DNA-ITS 序列分析和生物学特性研究。结果表明:该病原菌能侵染高羊茅 ,在26℃和光照下, 在PDA
培养基上培养6 d 后菌落呈墨绿色, 菌丝有隔, 分生孢子有4 个横隔膜, 平均大小为30. 6～17. 0 m×10. 9～13. 6 m,中部
3 胞暗色,第3 个细胞基部膨大; 其核糖体DNA-ITS 序列分析表明,该菌与GenBank 中近缘弯孢( Cur vular ia af f inis )的同
源性是100% ;结合形态学特征和致病性测定,认为该菌为C . af f inis ,这是C . af f inis 引起草坪型高羊茅叶斑病在我国的首
次报道; 生物学特性的研究表明,该菌菌丝生长的最适温度为25～30℃,最适pH 范围为6～7,最适碳源为蔗糖,最适氮源
为Ca( NO 3) 2 ;菌丝和分生孢子的致死温度分别为 55℃ 10 min 和 60℃10 min。
关键词: 高羊茅; 近缘弯孢霉; 叶斑病; 病原鉴定; 生物学特性
中图分类号: S 812. 6 文献标识码: A
Etiological and Biological Characterization of the Pathogenic Fungus Causing
Leaf Spot on Festuca arundinacea
ZHENG Li
1
, HUANG Jun-bin
1
, Hsiang Tom
2
( 1. Dept . of Plant Pr otect ion, College of Plant Science and T echnology, Key Lab of Plant Patholog y of Hubei Province,
Hu azh ong Ag ricul tu re University, Wuhan, Hubei Province 430070, Ch ina;
2. Dept . of Environmental Biology , University of Guelph, Gu elp h, Ontario, C anada N1G 2W1)
Abstract: A pathogen w as isolated from Festuca arundinacea o f a turf in Yiling dist rict of Yichang, Hubei
Pro vince. The morpholog ical characterist ics, pathogenicity , the DNA sequence of ribosomal ITS and biolog ical
characterist ics of the pathogen w ere studied. In a test of pathogenicity, the or ganism w as able to infect F .
ar undinacea in vit ro . Af ter cult iv at ion on PDA at 26℃ under cont inuous f luorescent light for 6 days, the
co lonies w er e black green and the hyphae w ere septate. Spore size w as 30. 6～17. 0 m×10. 9～13. 6 m,
most ly w ith four-septa. T he centr al cell w as dark and the third cell from the base w as the lar gest . The DNA
sequence of ribosomal ITS o f the isolates w as found to match 100% with an IT S sequence of Curvular ia af f inis
in GenBank. T his is the f irst repo rt of leaf spot caused by C. af f inis on F. arundinacea in China. The studies on
bio logical char acteristic r ev ealed that the optimal temper ature for the mycelial grow th was 25～30℃, and the
optimal pH for mycelial grow th w as pH 5～7. Among carbon and nit rogen sources, sucrose and calcium nitr ate
w er e best for mycelial growth. T he lethal temperature for mycelial g row th and spores g eminat ion were
respect iv ely 55℃ and 60℃ for 10 min.
Key words: Festuca arundinacea; Curvular ia af f inis; Leaf spot ; Pathogen ident if icat ion; Biolog ical
characterist ics
草坪作为人类栖居的构成部分, 已成为建立绿化
走廊、花园城、实现大地园林化,创造优美的生活和工
作环境最重要的内容之一[ 1]。随着草坪建植面积的不
断扩大和养护要求的不断提高, 病害愈来愈成为草坪
收搞日期: 2006-01-24; 修回日期: 2006-06-06
基金项目: 国家外专局 2003年度引智项目资助
作者简介: 郑 莉( 1982-) ,女,硕士研究生, 研究方向为分子植物病理, E-m ail : sue8244@ w ebmail . h zau . edu. cn; * 通讯作者 Au th or for corre-
spond ence, E-mail : junb inhuang@ mail. h zau . edu. cn
第14卷 第 4期
Vo l. 14 No . 4
草 地 学 报
ACT A AGRESTIA SIN ICA
2006年 12 月
Dec. 2006
管理中一个不可忽视的问题。叶斑病是草坪上的常见
病害之一, 它在世界范围内的冷、暖季草坪中都有发
生,尤其在美国、加拿大、欧洲、澳大利亚和日本发生非
常普遍[ 2]。据报道引起叶斑病的病原物有尾孢菌
( Cercosp ora spp. ) , 壳单隔孢( A scochy ta spp. ) , 壳月
孢( Selehop homa spp. ) , 弯孢霉 ( Cur vularia spp. ) ,
离蠕孢( B iop lar is spp. ) , 长蠕孢 ( H elminthosp orium
spp. ) , 壳针孢( Sep toria spp. ) , 链格孢( A lter naria
spp. ) 8种[ 3, 4]。国内对草坪叶斑病研究较少, 研究内容
多集中在病害的初步调查和防治等方面[ 5, 6] , 而对其
病原菌鉴定及病原菌的生物学特性研究较少。
2003年10月,我们在草坪病害调查过程中发现湖
北省宜昌市夷陵区高羊茅叶斑病发生较为严重, 在零
星小雨过后的两周,病斑便在叶片上出现。在某些发病
严重的地方, 1/ 5的草会受到病菌的侵染。为了确定引
起高羊茅叶斑病病原, 我们对病原物进行了分离、纯
化、致病性测定和种的鉴定,并对该病菌生物学特性进
行了研究。
1 材料与方法
1. 1 病原菌分离培养
病原菌的分离培养采用常规的组织分离法[ 7] , 在
病健交接处切下1 cm 的叶片,放入70%酒精消毒30 s,
然后将其转入5% NaOCl 3消毒1 min,用无菌水清洗3
遍后,置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基( PDA)平板上,
在26℃光照下培养。将分离得到的单株进行分离纯化
后,保存于4℃冰箱备用。
1. 2 病原菌鉴定
将分离得到的菌株接种于PDA 平板上, 26℃下光
照培养, 5 d 后观察菌丝和分生孢子的形态。根据
Masayo 等人( 2003)的方法进行病原鉴定 [ 8]。
1. 3 致病性测定
将采自草 坪型 高羊茅 ( Festuca arundinacea
Schreb. ) 用70%的酒精消毒和水清洗干净后,置于铺
有吸水纸的直径为 15 cm 的培养皿中,每皿放 4片叶
片。用6 mm 孔径的打孔器在PDA 平板上培养5 d的
菌落的边缘打孔, 将菌块接种于健草的离体叶片上, 保
湿培养, 2 d 后取下菌块,观察发病情况。以未接种菌
块的健草叶片作为对照。
1. 4 ITS 的PCR扩增与测序
1. 4. 1 基因组DNA提取 将分离的病原物放在铺有
玻璃纸膜的PDA培养基上于26℃光照培养5 d 后收集
菌丝,采用CT AB法 [ 9]提取菌丝DNA。
1. 4. 2 引物 用真核生物核糖体 DNA 的 IT S1 和
ITS4引物进行PCR 扩增[ 10] , 其序列如下: IT S1: 5-
TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 , IT S4: 5-T CCTC-
CGCT TAT TGAT AGC-3。
1. 4. 3 PCR反应条件 PCR 反应体系总体积50 l,
反应液为: 模板 DNA 10 ng, 10×PCR Buf fer ( M g 2+
Fr ee) 5 l, 25 mM MgCl25 l, 2. 5 mM dNTP 4 l, 5
U / l T aq酶0. 3 l(以上各药品均由T aKaRa公司提
供)。引物( IT S1和 IT S4)各 1 l ( 2. 5 mM ) (由上海
Sangon 提供 ) , 加 ddH 2O 使体积达到 50 l。在
PT C200PCR仪上扩增。反应程序为: 95℃ 4 min预变
性;进入循环: 94℃ 1 min, 54℃ 1 m in, 72℃ 1 min( 36
个循环) , 72℃延伸 10 min [ 11]。用 V-gene DNA Gel
Extraction Kit 回收试剂盒 (维特洁公司提供) 回收
纯化PCR产物,委托上海基康公司进行DNA 测序。⋯
1. 4. 4 序列分析与数据处理 将分离所得的菌株的核
糖体DNA-IT S 序列与互联网GenBank 中核酸数据库
( ht tp: / / ncbi. nlm . nih. g ov/ blast )进行同源性比较。
1. 5 生物学特性研究
1. 5. 1 温度对菌丝生长的影响 用6 mm 打孔器在
活化 5 d 菌落的边缘打取菌块,将其接于另一PDA 平
板中央(培养基均为15 m l,培养皿大小为9 cm) ,分别
置于15℃、20℃、25℃、30℃和35℃温箱中培养, 每个温
度重复5次, 培养6 d后用十字交叉法测量菌落直径。
1. 5. 2 pH 对菌丝生长的影响 高压灭菌后,在无菌
条件下用无菌的 1 mol / l NaOH 和1 mol/ l HCl 调节
PDA 培养基的pH 值。pH设置4. 24、5. 10、6. 24、7. 23、
8. 13和9. 12 6个梯度。用直径6 mm 菌块分别接种于
不同pH 的PDA 平板中,每处理重复5次。在26℃光照
下培养6 d,菌落直径测定同1. 5. 1。
1. 5. 3 碳、氮源对菌丝生长的影响
1. 5. 3. 1 不同碳源培养基对菌丝生长的影响 以查
彼克培养基( 2. 00 g KN O3 , 1. 00 g KH2PO 4 , 0. 5 g
KCl, 0. 5 g M gSO 4·7H2O, 0. 01 g FeSO 4 , 30. 0 g 蔗
糖, 1000 g 蒸馏水, 17 g 琼脂) [ 7]为基础,用含有相当碳
的不同碳源(乳糖、麦芽糖、葡萄糖和可溶性淀粉)代替
查彼克培养基中30 g 蔗糖配成不同碳源的固体培养
基,以不含蔗糖的查彼克固体培养基为对照, 每处理
重复5次,菌落直径测定同1. 5. 1。
1. 5. 3. 2 不同氮源培养基对菌丝生长的影响 以查
彼克培养基为基础, 用含有相当氮的不同氮源
( NH4Cl、赖氨酸、Ca( NO3 ) 2 和NaNO 2)代替查彼克培
316 草 地 学 报 第 14卷
养基中2. 00 g KNO 3 ,配成不同氮源的固体培养基, 以
不含KNO 3的查彼克固体培养基为对照, 每处理重复5
次,菌落直径测定同1. 5. 1。
1. 5. 4 菌丝和孢子致死温度的测定
1. 5. 4. 1 菌丝致死温度 用 6 mm 打孔器在活化6 d
菌落的边缘打取菌块,将其置于含有2 ml无菌水小试
管中,每个小试管中含有5个菌块,分别在 45℃、50℃、
55℃、60℃和65℃水浴锅中处理10 min,将菌丝块取出
分别置于PDA 平板上生长, 2周后观察其生长情况。
1. 5. 4. 2 孢子萌发致死温度 将 1 ml 孢子浓度为
1. 3×106个/ ml 的孢子液加入 1. 5 ml Eppendorf 管
中,然后分别置于45℃、50℃、55℃、60℃和65℃水浴锅
中处理10 min。每个温度处理设3次重复。72 h后用
血球计数板计算孢子萌发率。
2 结果与分析
2. 1 病原菌形态特征
菌落在PDA 培养基上培养5 d后呈墨绿色,气生
菌丝致密, 绒状,有隔,直或弯, 分生孢子屈膝状,中部
3 个细胞暗色, 脐不突出, 分生孢子的平均大小为
30. 6～17. 0 m×10. 9～13. 6 m, 根据Masayo 检索
表将其鉴定为C. af f inis Boedijn。
2. 2 致病性测定
在接种2 d后高羊茅叶片上可见直径为5 mm 半圆
形病斑, 随后病斑逐渐扩大且颜色变黑,接种5 d 后病斑
直径为10 mm ,黑褐色,边缘有黄色晕圈, 对照则无病斑。
图1 菌丝和分生孢子形态
F ig . 1 M orpho lo gical char act eristics o f hyphae
and condium a condium b hyphae
2. 3 核糖体DNA -IT S序列分析
通过对ITS1和IT S4正反向测序,所获得的DNA-
ITS 基因序列长度为540 bp(不包括引物序列)。将病
原物的核糖体DNA-IT S 基因在GenBank中进行同源
性 比 较, 发 现 它 与 C. af f inis ( g i/ 5311101/ gb/
AF07133551/ AF071335)的同源性为100%。从而进一
步确定该菌为C. af f inis。
2. 4 生物学特性
2. 4. 1 温度对菌丝生长的影响 表1表明,在测试温
度范围内, C. af f inis 均能生长, 其中适宜的温度范围
为20℃～30℃, 最适为25℃～30℃。
表1 温度对菌丝生长的影响
T able 1 Influence of temperature on mycelial g row th of C . af f inis
温度(℃)
T emp erature
6 d后菌落生长直径( cm ) Diameter of colony at 6 d
重复 1
Repeat 1
重复 2
Repeat 2
重复 3
Repeat 3
重复 4
Repeat 4
重复 5
Repeat 5
平均
Aver age
SSR 测验( SSR test )
0. 05 0. 01
15 3. 51 3. 32 3. 52 3. 44 3. 29 3. 42 c C
20 4. 07 4. 96 4. 82 4. 12 4. 07 4. 41 b B
25 6. 40 6. 92 6. 12 6. 32 6. 58 6. 48 a A
30 6. 23 6. 26 6. 48 6. 40 6. 34 6. 34 a A
35 3. 55 3. 45 3. 51 3. 27 3. 45 3. 45 c C
2. 4. 2 pH 值对菌丝生长的影响 表2表明,在测试
pH 范围内, C. af f inis 均能生长, 以 pH 5～7适宜, 可
见C. af f inis对环境的酸碱度要求不高, 但是更适合在
偏酸性环境下生长。
表 2 pH 值对菌丝生长的影响
Table 2 Influence of pH on mycelial gr owth o f C . af f inis
pH 值
pH value
6 d后菌落生长直径( cm ) Diameter of colony at 6 d
重复 1
Repeat 1
重复 2
Repeat 2
重复 3
Repeat 3
重复 4
Repeat 4
重复 5
Repeat 5
平均
Aver age
SSR 测验( SSR test )
0. 05 0. 01
4. 23 5. 47 5. 85 5. 51 5. 86 5. 73 5. 68 bc BC
5. 10 7. 29 7. 46 4. 51 7. 21 7. 41 6. 78 a AB
6. 24 7. 03 7. 25 7. 53 7. 19 6. 63 7. 12 a A
7. 23 7. 04 7. 13 5. 64 7. 49 7. 53 6. 96 a A
8. 13 6. 24 6. 34 6. 90 6. 79 5. 47 6. 35 ab ABC
9. 12 5. 33 5. 17 5. 40 5. 24 5. 17 5. 26 c C
317第 4期 郑莉等:高羊茅叶斑病病原鉴定及生物学特性
2. 4. 3 碳、氮源对菌丝生长的影响
2. 4. 3. 1 不同碳源对菌丝生长的影响 表3表明, 在
以上供试碳源中, C. af f inis 对麦芽糖、葡萄糖、可溶性
淀粉、蔗糖、乳糖均能利用, 菌丝生长以蔗糖最好,其次
为葡萄糖、麦芽糖和乳糖,淀粉最差。虽然菌丝在不加
碳源的对照培养基上长得最快, 但菌丝长势稀薄,总生
物量较少。
表3 碳源对菌丝生长的影响
T able 3 I nfluence o f carbon sour ces on mycelial gr ow th of C . af f inis
碳源
Carbon sources
6 d后菌落生长直径( cm ) Diameter of colony at 6 d
重复 1
Repeat 1
重复 2
Repeat 2
重复 3
Repeat 3
重复 4
Repeat 4
重复 5
Repeat 5
平均
Aver age
SSR 测验( SSR test )
0. 05 0. 01
蔗糖 sucrose 6. 48 6. 95 6. 85 6. 39 6. 79 6. 73 b B
葡萄糖 glucos e 6. 05 6. 43 6. 05 6. 35 5. 85 6. 15 c C
麦芽糖 mal tos e 5. 85 6. 05 6. 03 6. 29 6. 00 6. 04 c C
乳糖 lactose 5. 87 6. 38 6. 08 5. 98 6. 03 6. 06 c C
淀粉 star ch 5. 15 4. 99 4. 90 4. 67 4. 83 4. 91 d D
CK 6. 98 7. 03 7. 12 7. 15 7. 05 7. 07 a A
2. 4. 3. 2 不同氮源对菌丝生长的影响 表4表明, 在
以上供试氮源中, C. af f inis对KNO 3、NH4Cl、赖氨酸、
Ca( NO 3 ) 2、NaNO 2 均能利用, 菌丝生长以 Ca ( NO 3) 2
最好,其次为KNO 3、赖氨酸和NaNO 2, NH4Cl最差。菌
丝在不加氮源的对照培养基上比其在 KNO3、NH 4C、
赖氨酸和NaNO 2培养基上的生长得快,但菌丝长势稀
薄,总生物量较少。
表4 氮源对菌丝生长的影响
Table 4 I nfluence o f nitr og en sour ces on mycelial gr ow th of C . aff inis
氮源
Nit rogen sources
6 d后菌落生长直径( cm ) Diameter of colony at 6 d
重复 1
Repeat 1
重复 2
Repeat 2
重复 3
Repeat 3
重复 4
Repeat 4
重复 5
Repeat 5
平均
Aver age
SSR 测验( SSR test )
0. 05 0. 01
KNO 3 4. 98 4. 93 4. 95 4. 58 5. 10 4. 91 c BC
NH 4C l 3. 00 2. 19 2. 66 2. 07 2. 69 2. 52 d D
赖氨酸( L -lysine) 3. 96 4. 88 4. 33 4. 8 4. 98 4. 59 c C
C a( NO 3) 2 5. 95 6. 23 6. 63 6. 83 6. 53 6. 43 a A
NaNO 2 3. 73 3. 98 4. 43 5. 15 5. 28 4. 51 c C
CK 5. 40 5. 45 5. 73 5. 32 5. 48 5. 48 b B
2. 4. 4 菌丝与孢子萌发的致死温度 表5表明,菌丝
在55℃水浴处理10 m in后完全致死, 孢子在55℃水浴
处理10 min 后的萌发率为19%,而60℃处理10 min 后
萌发率为0,故菌丝的致死温度为55℃ 10 m in, 孢子萌
发的致死温度为60℃ 10 min。
表5 菌丝和孢子萌发的致死温度
Table 5 Lethal temperat ur e for mycelium
and spor e germination
处理温度(℃)
T emp erature
菌丝生长情况
Mycelial grow th
孢子萌发率( % )
Percentage of germ inated conidia
45 + 91
50 + 58
55 - 19
60 - 0
65 - 0
注: “+ ”表示生长; “- ”表示不生长; Note:“+ ”means grow th;
“- ”means not grow th
3 结论与讨论
3. 1 1933年, Boedijn 基于分生孢子隔膜的数量和大
小的不同,将Curv urlaria spp.分成三个大类群:“膝曲
弯孢( C. geniculata)”, “新月弯孢( C. lunata)”, 和“斑
污弯孢( C. maculans)”[ 12]。膝曲弯孢( C. genculata)类
群中包括近缘弯孢 ( C. af f inis ) , 假弯孢 ( C. f allax
Boedijn) , 塞河弯孢( C. senegalensis)。Sun 等人用Brn1
特异性基因片段对C. genculata 进行聚类分析, 根据菌
株之间遗传距离将C. genculata划分为了八个组, C.
af f inis是其中一组 [ 13]。本研究采用rDNA-IT S 分子鉴
定技术,测定了该病原菌的IT S1-ITS4序列,序列分析
结果与形态鉴定结果一致, 进一步证实引起宜昌市高
羊茅叶斑病的病原物为C. af f inis。
3. 2 生物学特性的测定表明菌丝生长的适宜温度范
围为20～30℃,在15～35℃范围内菌丝均能生长,表明
该菌对温度的适应范围广。病菌适宜的pH 范围为5～
7, 在酸性( pH4. 2)和碱性( pH9. 12)生长较慢。在碳源
利用方面, C. af f ini s对单糖(葡萄糖)、双糖(蔗糖、乳
糖、麦芽糖) , 多糖(可溶性淀粉)均能利用,以蔗糖最
好。在氮源利用方面,硝态氮( Ca( NO 3 ) 2、KNO 3 )、亚硝
(下转第327页)
318 草 地 学 报 第 14卷
扰下, 结缕草种群的密度极显著地高于未烧 ( P <
0. 01)。火烧极显著地提高了结缕草种群的现实生存
力。但在个体层次上,火烧样地结缕草种群的生殖枝高
度极显著( P< 0. 01)地低于未烧者(表1) ,降低了分株
的生存力和竞争力。在这种情况下,火烧样地结缕草生
殖枝极显著地提高了其生长比率和生殖分配。种子产
量构成因子综合作用的结果, 火烧者种子产量13. 08
g / m
2 ,未烧者7. 08 g / m2 ,前者是后者的 1. 85倍, 表明
火烧样地种群的潜在生育力要高于后者。
3. 3 火烧并未影响结缕草种子的质量(千粒重) ,虽然
火烧使生殖枝个体所生产的种子数量(花序种子数)减
少,但是增加了种群整体的种子数量(种子产量×
1000/千粒重)。因此,火烧不是影响种子质量而是通过
增加种子数量以提高种群的生育力。
3. 4 火烧并未改变花序种子数、花序长、生殖生长比
率、花序种子重及生殖分配与生殖枝高度间的定量关
系,花序长随着生殖枝高度呈线性函数增加。花序种子
数和种子重随着生殖枝高度呈幂函数增加。生殖生长
比率和生殖分配均随着生殖枝高度呈幂函数降低。
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(责任编辑 孟昭仪)
(上接第318页)
态氮( NaNO 2 )和氨态氮(赖氨酸)都能有利于病菌菌
丝生长,但铵态氮( NH4Cl)较差。虽然菌丝在不加碳或
氮源的对照培养基上长得较快, 但菌丝长势稀薄,总生
物量较少。菌丝生长的致死温度为55℃,孢子萌发的致
死温度为60℃, 孢子抗热性比菌丝强的原因还有待进
一步探讨。
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(责任编辑 才 杰)
327第 4期 张学勇等:火烧对结缕草种群有性生殖的影响