全 文 ：文章编号: 1007-0435( 2007) 03-0290-03
鸭茅ISSR反应体系的建立与优化(简报)
曾　兵1, 2, 张新全1* , 兰　英2
( 1. 四川农业大学, 四川 雅安　625014; 2. 西南大学, 重庆 荣昌　402460)
关键词: 鸭茅; ISSR 分子标记; 反应体系 ; 优化
中图分类号: Q943　　　　文献标识码: A
Optimal of ISSR Marker in Dactylis glomerata L.
ZENG Bing
1, 2
, ZHANG Xin-quan
1*
, LAN Ying
2
( 1. Sichuan Agr icultur al U niver sity , Sichuan Yaan, 625014; 2. Southw est Univer sity , Chongqing Rongchang 402460)
Key words : Dacty lis glomerata L. ; ISSR Marker; React ion sy stem; Opt imizing
　　简单序列重复区间扩增多态性( Inter -simple
sequence repeat , 简称 ISSR)是由 zietkiewicz 等于
1994年创建的一种DNA 标记技术[ 1]。ISSR技术的
原理和操作与SSR、RAPD非常相似,只是引物设计
要求不同,但其产物多态性比RFLP、SSR、RAPD丰
富, 可提供更多的基因组信息,比 RAPD技术更加
稳定可靠,实验重复性好[ 2]。
ISSR 目前已用于多种农、果作物的多方面研
究,例如大麦( H ordeum v ulgare L. )、欧洲( L arix
decid ua L. )和日本落叶松( L . kaempf eri L. )、欧洲
栗 ( A leurit es moluccana L. ) 等的遗传作图, 玉米
( Zea may s L. )、小麦( T riticum aesti vum L. )、马铃
薯( Solanum tuberosum L. )、柑橘 ( Citrus ret iculate
L. )、羽扇豆( L up inus p olyphy lla L. )、水稻( Ory z a
sativ a L. )、葡萄( Vit is v inif era L. )等的种质资源研
究,稻属( Ory z a L. )、番薯属( Ip omoea batatas L. )
的遗传多样性研究,但在牧草上的研究较少。
鸭茅( Dactlis glomerata L. )是温带最重要的禾
本科牧草之一,在北美种植史超过200年, 在英国、德
国、芬兰等欧洲国家的饲草栽培中也占有重要地位。我
国的鸭茅资源十分丰富,具有较高的研究价值和极为
广阔的利用前景,目前已育成宝兴( cv. Baox ing )、古
蔺( cv. Gulin)、川东( cv . Chuandong) 3个栽培品种。
在鸭茅种质资源的研究方面, 国外已深入到分
子水平,但在分子标记方面有记载并可供查询借鉴
的资料并不多, 只有Reeves等运用AFLP 研究鸭茅
野生居群的基因组大小与海拔的相关关系[ 3] ,
Ko lliker 等用RAPD研究鸭茅的遗传变异性 [ 4]。而
我国主要集中在形态学水平上,曾兵、张新全等已初
步利用RAPD完成对鸭茅遗传多样性的研究[ 5]。本
试验拟建立鸭茅ISSR反应体系,进一步对来自国内
外70多份鸭茅材料进行 ISSR 分析,并对鸭茅 ISSR
分子标记条件进行优化研究。
1　材料与方法
1. 1　材料
供试鸭茅采自四川农业大学实验基地 (校园
内 ) ; ISSR引物筛选用哥伦比亚大学提供96条常用
ISSR引物,引物由上海生工公司合成; DNA 聚合酶
(含buffer 和Mg 2+ )由天为时代公司生产。
1. 2　基因组DNA 的提取及检测
试验采集幼嫩鸭茅植株的心叶, 采用CT AB 法
提取DNA。DNA 纯度和浓度采用紫外分光光度检
测法及琼脂糖电泳检测。
1. 3　ISSR体系的建立
　　用了3个ISSR反应程序及反应体系, 分别来自
仲彬草( K engy ilia Yen) [ 6]、五味子( S chisandra chi-
收稿日期: 2006-05-29; 修回日期: 2007-03-20
基金项目: 国家自然科学基金项目( 30371022)和教育部“新世纪优秀人才支持计划”( NCET -04-0909)资助
作者简介: 曾兵( 1978-) ,男,四川乐至人,博士研究生,研究方向为牧草及草坪草育种与种质资源, E -mail : zbin 78@ 163. com; * 通讯作者
Author for correspond ence, E-mail: zhangxq@ sicau . edu. cn
第15卷　第 3期
　Vo l. 15　 No . 3
草　地　学　报
ACT A AGRESTIA SIN ICA
　　　2007 年　 5 月
　May　　 2007
nensis)
[ 7]、果蔗( Sarcandra Glabra) [ 8]的IS SR 研究,
从中选择扩增效果最好的果蔗的扩增程序及反应体
系用于试验。
1. 4　PCR扩增与RAPD 条件优化
1. 4. 1　PCR扩增　反应体系总体积20 Ll。PCR反
应程序如下: 第一步: 94℃ 5 min, 一个循环; 第二
步: 94℃ 45 S, 52℃ 1 min, 72℃ 1. 5 min 共四十五
个循环;第三步: 72℃ 7 min。然后在4℃保存。PCR
反应后将扩增产物用含0. 5 Lg/Ll EB(溴化乙锭)的
1. 5%琼脂糖凝胶电泳,以Marker( DL2000)为对照,
紫外成像系统照相。
表1　ISSR反应系统优化设计
Table 1　Design of optimal ISSR reaction system
影响因素
Inf luencing factor s
反应参数 Parameter in react ion
1 2 3 4 5 6 7
Mg2+ ( m mol/ L) 0. 80 1. 00 1. 20 1. 40 1. 60 1. 80 2. 00
DNT P( Lmol /L ) 50. 00 100. 00 150. 00 200. 00 250. 00 300. 00 350. 00
Taq酶( U/体系) T aq enzyme( U / System) 0. 25 0. 50 0. 75 1. 00 1. 25 1. 50 -
引物( Lmol/ L ) Primer( Lmol /L ) 0. 05 0. 10 0. 15 0. 20 0. 25 0. 30 0. 35
DNA (n g) 20. 00 40. 00 60. 00 80. 00 100. 00 120. 00 140. 00
2. 4. 2　ISSR条件优化　试验对ISSR的影响因素:
M g
2+ 、dNT P、Taq 酶、引物浓度、模板 DNA 等进行
了筛选(表1)。
2　结果与分析
2. 1　DNA检测
琼脂糖电泳检测鸭茅 DNA 质量, 实验结果如
图1。图中DNA 电泳带没有拖尾现象且图象较为清
楚,可知本次所提DNA 纯度较高, RNA 和蛋白质含
量较少或者没有,而且通过与KDNA 对比可知所提
DNA 浓度均在50～100 ng /Ll间。
图1　DNA 电泳检测
F ig . 1　Electr ophor etic DNA
K100-100 ng/ Ll　K50-50 ng/ Ll
2. 2　Mg2+ 浓度对ISSR的影响
实验结果表明(图2) , M g 2+浓度在1. 6 mm/ L、
1. 8 mm/ L 时均能扩增出较多带, 带型一致, 但以
1. 6 mm/ L 时扩增出的带最多, 当 Mg 2+ 浓度大于
1. 6 mm / L时除了带减少外, 主带亮度减弱; 而当
Mg
2+ 浓度小于 1. 2 mm / L 时,扩增出的带较少。故
鸭茅ISSR 扩增反应的最佳Mg 2+浓度为1. 6 mm / L。
图 2　Mg2+ 浓度对 ISSR的影响
F ig . 2　Effect on ISSR amplification of M g2+ concent ration
1-0. 8 mmol/ L; 2-1. 0 mmol/ L; 3-1. 2 mmol /L ; 4-1. 4 mmol /L ;
5-1. 6 mm ol / L; 6-1. 8 mmol/ L; 7-2. 0 mm ol/ L; M-Marker
2. 3　DNTP浓度对 ISSR的影响
实验结果表明 (图 3) , DNTP 浓度在低于 250
Lmol/ L 扩增产物少且部分条带模糊, 在250 Lmol/
L 和 300 Lmol/ L 时扩增产物最多且最清楚, 大于
300 Lg / l时扩增产物减少且带变弱。本研究认为鸭
茅ISSR扩增反应最佳DNTP 浓度为250 Lmol/ L。
2. 4　Taq酶量对 ISSR的影响
由图4清晰可见, 当Taq酶的量大于1. 25 U 时,
扩增产物弥散且带谱背景非常浓,非特异性扩增较
为明显。而当Taq酶的量小于1. 0 U 时,扩增量减
少。此外,考虑综合成本,本实验Taq酶在每反应体
系中用量1. 0 U 为佳。
2. 5　引物浓度对ISSR的影响
图5结果显示, 引物浓度 0. 05 Lmol/ L 时,扩增
291第 3期 曾兵等:鸭茅 ISSR反应体系的建立与优化(简报)
产物非常少, 只有一条带,随着引物浓度的增加扩增
带增加, 0. 25 Lmo l/ L 时扩增产物最多且最清晰,大
于0. 25 Lmo l/ L 时,带不够清晰且有部分弥散现象,
同时扩增产物减少。故本研究体系最佳引物浓度为
0. 25 Lmol/ L。
图 3　DNTP 浓度对 ISSR的影响
F ig . 3　Effect on ISSR amplification of DNT P concentrat ion
1-50 Lmol / L; 2-100 Lm ol/ L; 3-150 Lmol/ L; 4-200 Lmol/ L;
5-250 Lmol / L; 6-300 Lm ol/ L; 7-350 Lm ol / L; M-Marker
图4　Taq酶量对 ISSR 的影响
F ig . 4　Effect on ISSR amplification of T aq DNA
po lymerase concentr ation
1-0. 25 U; 2-0. 5 U; 3-0. 75 U; 4-1. 0 U;
5-1. 25 U ; 6-1. 5 U ;M -Marker
图 5　引物浓度对 ISSR的影响
Fig. 5　Ef fect on IS SR amplif icat ion of primer concent rat ion
1-0. 05 Lmol /L ; 2-0. 10 Lm ol / L; 3-0. 15 Lmol/ L
4-0. 20 Lmol /L ; 5-0. 25 Lm ol / L; 6-0. 30 Lmol/ L
7-0. 35 Lmol/ L; M -M ark er
2. 6　DNA量对 ISSR的影响
如图6所示, DNA 量低于100 ng 时, PCR的扩增
产物较少且带不够亮; DNA 用量为80 ng 和100 ng 时
扩增带型相同,但100 ng 时带更为清晰,在120 ng 时
扩增产物减少。由此可见, 100 ng 为体系最佳DNA量。
图6　DNA 量对 ISSR 的影响
Fig. 6　Effect on ISSR am plif icat ion of DNA concent rat ion
1-20 ng; 2-40 n g; 3-60 ng ; 4-80 ng
5-100 ng; 6-120 ng; 7-140 ng; M-Marker
2. 7　体系优化后的效果
经过反应体系的优化, PCR扩增效果较好, 弥
散现象、带缺失现象、引物二聚体等消失,多态性好,
重现性好,为ISSR研究的深入开展提供了较好的保
障(图7)。
图7　ISSR 的PCR 扩增电泳图
F ig . 7　PCR amplification pa tterns by ISSR of
Dacty lis glomerata L .
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(下转第295页)
292 草　地　学　报 第 15卷
表2　地上地下部相关分析
Table 2　Co rr ela tion o f factor s up and under g round
草产量
Dry
mat ter
侧根数
Num . of
secondary r oot s
主根体积
Vol . of
tap root
侧根体积
Vol . of
secondary root
主根重
Weight of
taproot
侧根重
Veight of
secondary r oot
枝条长
Len gth of
branch
分枝数
Tw igs per
plant
草产量( Dry mat ter) 0. 1585* 0. 1690* 0. 1810* 0. 5670** 0. 5559**
侧根数( Num. of secondary root s ) 0. 6694** 0. 3276** 0. 6723** 0. 3290** 0. 1965* 0. 2297**
主根体积( Vol. of taproot ) 0. 6694** 0. 4985** 0. 9563** 0. 5123** 0. 1735* 0. 2184**
侧根体积( Vol. of secondary r oot ) 0. 1585* 0. 3276** 0. 4985** 0. 4870** 0. 9690** 0. 2307**
主根重( Weight of taproot ) 0. 1690* 0. 6723** 0. 9563** 0. 4870** 0. 5208** 0. 1866* 0. 2561**
侧根重( Veigh t of s econ dary root ) 0. 1810* 0. 3290** 0. 5123** 0. 9690** 0. 5208** 0. 2713**
枝条长( Len gth of bran ch) 0. 5670** 0. 1965* 0. 1735* 0. 1866* 0. 3923**
分枝数( Tw igs per plant ) 0. 5559** 0. 2297** 0. 2184** 0. 2307** 0. 2561** 0. 2713** 0. 3923**
　　注: * 表示显著性水平为 0. 05 Correlation is signif icant at the 0. 05 level; ** :表示显著性水平为 0. 01 Correlation is sig nif icant at the 0. 01
level
图1　供试苜蓿地上生物量聚类分析
F ig . 1　Cluster analysis fo r up gr ound productivity
assessment o f 18 a lfalfa cultivar s
3　讨　论
3. 1　供试苜蓿品种间产草量差异显著,一方面是由
品种特性所决定,而更主要是由于不同品种对盐碱
地的适应性各异, 因此筛选优质、高产的紫花苜蓿品
种显得尤为重要[ 6]。
3. 2　苜蓿产草量与植株高度呈正相关 [ 7, 8] , 其中陇
东苜蓿枝条最长、草产量最高( 49815 kg/ hm 2)、阿尔
冈金、秘鲁、草原2号苜蓿侧根发达、枝条较长、分枝
多、产草量高( 39390～43320 kg / hm2 )。上述4个品种
是紫花苜蓿草产品生产的首选品种。
3. 3　除阿尔冈金外,进口苜蓿品种与国产品种的草
产量有一定差距,这可能与其对环境的适应性有关。
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(上接第292页)
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295第 3期 柴琦等:苜蓿对盐碱的适应性