全 文 ：第 17 卷
第 3 期

Vol. 17
No . 3
草
地
学
报
ACTA AGRESTIA SINICA



2009 年
5 月

May

2009
偃麦草根茎蛋白质修饰冰晶的研究
龚束芳1, 杨
涛1 , 李
岩2 , 车代弟1*
( 1. 东北农业大学园艺学院, 哈尔滨
150030; 2. 黑龙江省农科院, 哈尔滨
150086)
摘要: 以哈尔滨地区野生偃麦草(E ly trz gia r ep ens ( L . ) Desv. )为研究对象, 以 10
下生长的植株为对照 ,比较冷冻
处理后, 偃麦草根茎可溶性蛋白质种类及修饰单体冰晶形态的差异。结果显示:冷冻处理后缺失两条蛋白质带, 分子
量分别为 33 和 13 Kda, 同时,增加两条新带, 分子量分别约为 53和 35 Kda,而且均有纺锤状或锥状的单体冰晶出现,
表明其具有极强抗冻活性。
关键词: 偃麦草;抗冻性; 蛋白质;冰晶
中图分类号: S812




文献标识码: A




文章编号: 1007
0435( 2009) 03
0333
04
Study on the Ice Crystal Modification of Rhizome
Protein in Ely tr igia repens ( L. ) Desv.
GONG Shu
fang 1 , YAN G Tao1 , L I Yan2 , CHE Dai
di1*
( 1. College of H ort iculture, Northeas t Agricu ltural U niver sity, H arbin, Heilongjiang Pr ovince 150030, Ch ina;
2. H eilon gjiang Academ y of Agr icultural Sciences, Harbin , H eilon gjian g Province 150086, China)
Abstract: T he kinds of the rhizome so luble protein and the conformat ion difference of sing le ice crystal of
w ild E ly t rigia r ep ens ( L . ) Desv. from Harbin areas were comparatively studied af ter chilled t reatment
taking the plants grow ing in the 10
as the CK. The result show that the r hizome protein had a delet ion
of tw o pro tein bands w ith molecular w eight of 33 and 13 kda and an addit ion of tw o protein bands w ith mo

lecular w eight of 53 and 35 kda af ter chilled t reatment. T he pr otein of 53 and 35 kda appeared spindly o r
conoid ice crystal indicat ing a high ant if reeze act ivity.
Key words: Ely tr igia r ep ens ( L . ) Desv. ; Ant ifreeze act ivity; Pro tein; Ice cry stal


抗冻蛋白( Ant i
f reezing proteins, AFP)是广
泛存在于生物界中具有特殊功能的蛋白质类型之
一,植物受到冷诱导后产生的抗冻蛋白,能够通过修
饰冰晶形态,使冰点降低并抑制冰晶生长速度,从而
增强植物耐受冰冻的能力; 没有抗冻活性的物质在
冰冻和融化过程中, 通常产生圆形冰晶;弱抗冻活性
蛋白可将冰晶修饰成六棱柱, 抗冻蛋白可将冰晶修
饰成双金字塔形、短柱形和纺锤形[ 1~ 3] 。
偃麦草( Ely tr igia r ep ens ( L. ) Desv. )是禾本
科偃麦草属( Ely tr z gia Desv. )多年生根茎
疏丛型
草本植物,可耐受冬季- 40
的低温,刚返青的幼苗
可耐受- 8
~ 10
的低温,秋季修剪后的再生株,
还出现
秋旺
的生长现象[ 7~ 9]。对偃麦草抗冻蛋白
在低温抗性中的作用和机制的了解, 有助于对进一
步应用偃麦草的优秀基因资源。
1
材料与方法
1. 1
实验材料
选取东北农业大学园艺试验站内自然生长的偃
麦草, 8月中旬将根茎桶栽,保持温度在 15~ 20
条
件下生长 1个月后, 一半移至室外进行自然降温冷
冻处理, 一半在温室内继续培养作为对照 ( 10

1
) ,至室外桶中土壤全部冻实后,将室内外偃麦草
根茎取出,进行蛋白质提取、分析与检测。
收稿日期: 2008
03
27;修回日期: 2009
03
03
基金项目:黑龙江省教育厅项目( 11511037)
作者简介:龚束芳( 1971
) , 女,博士,副教授,研究方向为草坪逆境生理与品种选育, E
mail: s hufanggong @ yahoo. com. cn; * 通讯作者
Auth or for correspon dence, E
m ail : daidiche@ yah oo. com. cn
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1. 2
方法
1. 2. 1
可溶性全蛋白质的提取
在 0~ 4
室温条
件下,取偃麦草地下的根状茎,冷水冲洗, 清除表面
干枯部分和附着物, 吸干表面水分后切成1 cm 长的
小段, 在液氮中速冻, 研磨粉碎后, 用提取液 ( 50
mmo l/ L T ris
HCl, pH 8. 0, 10 mmol/ L EDT A, 20
mmo l/ L Vc, ddH 2O ) 4
提取 2 h 后, 低温高速离
心,得到组织粗提液,经冷丙酮沉淀挥发后获得蛋白
质干粉,备用。
1. 2. 2
SDS
PAGE 电泳
分离胶浓度为 18% , 浓
缩胶浓度为 5%。溶液 30% Acr
Bis 单体储液
( 29. 2% 丙稀酰胺和 0. 8% 甲叉双丙稀酰胺用
ddH 2O配制) ; 分离胶缓冲液 1. 5 mol/ L Tr is
HCl
( pH8. 8) ; 浓缩胶缓冲液 1. 0 mo l/ L T ris
HCl( pH
6. 8) ; 10% SDS; 10% APS (现用现配) ; TEMED [ 11] ;
调整蛋白浓度为 1 mg/ mL 后,进行 SDS
PAGE。
1. 2. 3
偃麦草蛋白质的分离与回收
将电泳分离
的蛋白质条带脱色完全后, 用刀片切取回收, 放入
EP 管中, 蒸馏水冲洗 2遍后在透析袋中加入少量洗
脱液 ( 1
洗脱液: 25 mmol/ LT ris pH 8. 3; 192
mmo l/ L 甘氨酸; 0. 1% SDS)进行洗脱。加入 5 倍
体积的冷丙酮, - 20
沉淀 2 h 以上, 10000 rpm、
4
离心 30 m in,沉淀蛋白质,并在- 20
下至丙酮
挥发干净。
1. 2. 4
偃麦草蛋白质修饰冰晶的观察
可溶性全
蛋白粗提取干品用超纯水溶解并调整浓度 2 mg/
mL,以- 30
酒精为冷冻剂,利用荧光相差显微镜
Nikon
YS100分析软件观察并记录蛋白质悬液结晶
状态。
2
结果与分析
2. 1
偃麦草根茎全蛋白质 SDS
PAGE分析
经过冷冻处理, 偃麦草根茎蛋白质组成有增加,
也有缺失;增加比较明显的蛋白质带有两条, 分子量
分别约为 53和 35 Kda; 缺失的两条蛋白质带, 分子
量分别为 33和 13 Kda(图 1)。


此外,经过冷冻处理后,偃麦草根茎中的一些蛋
白质在浓度上也表现出一定的差别,例如经过冷冻
处理,分子量为 23 Kda 蛋白浓度有明显的增加, 分
子量接近 37 Kda的蛋白质浓度有明显的降低,这都
可能在偃麦草抗冻性的提高上产生影响。
2. 2
偃麦草蛋白提取液冰晶形态观察
超纯水对零下低温反应敏感, 对冰晶没有修饰,
在低温下的冰晶形态均为圆形或近圆形(图 2)。


在偃麦草对照的根茎可溶性全蛋白中可以观察
到多种单体冰晶, 其中绝大多数是圆形或椭圆形(图
3A) ,与超纯水冰晶形态相似。此外,试验中也观察
到有模糊六边形(图 3 B)、短柱形(图 3 C)和纺锤形
(图 3 D)单体冰晶形态, 这是否能够说明即使未经
过低温诱导,偃麦草根茎中也存在具有高抗活性的
蛋白质,偃麦草根茎中抗冻活性较高的蛋白质并非
全部由低温诱导形成, 还需要进一步验证。


偃麦草冷冻处理根茎可溶性全蛋白提取物的冰
冻过程, 可以看到较多的柱状单体冰晶(图 4 A, B) ,
同时也有少量的圆形(图 4C)、六角形(图 4D)、纺锤
形和针状冰晶(图 4 E)。根据对蛋白质修饰冰晶形
态与蛋白质抗冻活性等级的分类, 偃麦草根茎中蛋
白质抗冻活性越冬期间高于对照。
2. 3
偃麦草不同分子量蛋白质抗冻活性的观察
30和 15 Kda蛋白质条带在处理与对照中浓度
334
第 3期 龚束芳等: 偃麦草根茎蛋白质修饰冰晶的研究
相似,对冰晶的修饰也没有明显变化,冰晶形态主要
为短锥状和短柱状, 具有较强的抗冻活性(图 3, 5)。


40 Kda蛋白质条带在冷冻处理后浓度降低,修
饰冰晶成柱状的能力也有所下降, 推测这一分子量
蛋白可能在结构上发生变化,从而导致对冰晶修饰
能力的减弱。
33和 13 Kda的蛋白条带在冷冻处理后消失或
浓度降低,在电泳中无法明确观察到,观察发现有短
柱状的单体冰晶出现, 说明它们也具有较强的抗冻
活性。
冷冻处理的偃麦草根茎同时产生分子量为 53
和 35 Kda的蛋白质, 23 Kda蛋白质浓度明显提高,
可修饰单体冰晶成短柱状, 具有较强的抗冻活性;而
在 53和 35 Kda中,均有纺锤状或锥状的单体冰晶
出现,表明这两条新出现的蛋白质具有极强抗冻活
性(图 5)。


通过对各纯化蛋白的修饰冰晶观察, 可以看出,
对照虽未经过冷冻处理, 但大部分蛋白质都有一定
的抗冻活性,经过冷冻处理后,一部分蛋白质可能减
少或消失,抗冻活性液有可能发生减弱的现象, 但同
时也会产生一些新的具有极强修饰冰晶能力的蛋白
质,在抵御冬季极端低温中起到关键作用。
图 5
偃麦草根茎可溶性蛋白各条带分离纯化后的冰晶形态 ( bars= 100
m)
F ig . 5
Confo rmation of ice cry st al fr om pur ified protein o f E. r ep ens rhizome
3
讨论
3. 1
前期研究中已经明确观察到偃麦草春季冻融
交替时期根茎蛋白可以将冰晶修饰成大量六角形冰
晶的现象[ 12~ 15] , 梁广坚[ 16] 等在细叶结缕草抗冻诱
导中也发现抗冻蛋白对冰晶明显的修饰作用。本研
究发现,未经过冰冻的偃麦草根茎,大多数蛋白质也
都对冰晶具有一定的修饰能力, 这种修饰能力是零
上低温的诱导产生的, 还是偃麦草蛋白质本身的特
性,需要更进一步的研究加以确定。
3. 2
抗冻蛋白的抗冻活性可以通过对冰晶的修饰
形态得到判定,虽然不同抗冻蛋白在大小和结构上
335
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有很大的差异, 但对抵抗冰冻性能上都十分相似 [ 3]。
Hon等[ 1 ]从冬黑麦中分离的抗冻多肽修饰溶液冰
晶生长所形成的形态与抗冻蛋白的种类有关, 他认
为随蛋白分子量增大, 溶液冰晶形态逐渐由圆滑六
角形,尖锐六角形、两端钝形六棱柱、六棱柱双金字
塔形,到针状,抗冻活性逐渐增强。本研究中并未发
现类似规律,分子量为 35和 53 Kda 的蛋白质比 13
到 40 Kda 的蛋白质具有更强的抗冻活性。植物
AFP 的机制的模型认为一般晶体的生长垂直于晶
体表面,增加表面积将破坏冰晶形成的平衡状态, 使
冰点下降,同时由于 AFP 表面修饰产生抑制冰晶重
晶化作用,防止小的冰晶结成更大的冰晶,使形成的
冰晶小且均匀, 因此减轻冰晶在冻融的动态变化中
对生物体的伤害。
3. 3
蛋白质结构是蛋白质作用的基础,抗冻蛋白的
抗冻机理主要表现在与冰结合的方式上, 其改变冰
晶生长的方式和速度与蛋白质浓度有关 [ 1]。但是由
于不能够直接观测到抗冻蛋白抑制冰晶生长的过
程,而且目前已经发现的 AFP 在分子量、热滞活性
及冰晶修饰形态等方面有巨大的差异, 因此国内外
许多专家学者先后提出来各种假说来解释这一特殊
的机理。如
吸附- 抑制
学说,
晶格匹配
假说,

晶格占有
假说,刚体能量学说等,都能在一定程度
上对 AFP 活性进行解释,但仅适合于一种或者几种
AFP,而本实验中观察到抗冻处理后产生的新蛋白
质在冰晶修饰上作用明显, 这种抗冻性的提高是蛋
白质结构上的变化还是分子量大小原因导致的,目
前还不能准确定位,有待更直接的和更多研究证据。
4
结论
4. 1
冷冻处理后, 40 Kda蛋白质条带浓度降低, 修
饰冰晶成柱状的能力也有所下降。
4. 2
30和 15 Kda蛋白质条带没有明显变化;分子
量为 23 kda 的蛋白质浓度有明显的增加, 分子量接
近 37 kda的蛋白质浓度有明显的降低。
4. 3
冷冻处理后偃麦草根茎可溶性蛋白带缺失了
两条,分子量分别为 33和 13 Kda; 同时增加两条,
分子量分别约为 53、35 Kda的蛋白质带, 新增蛋白
均有纺锤状或锥状的单体冰晶出现, 具有极强抗冻
活性。
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