全 文 ：　2005年第 5期
辽 宁 林 业 科 技
Journal of Liaoning Forestry Science &Technology 2005№5
钙-钙调素对中东杨扦插苗的诱导抗冻作用①
吴 旭红
(齐齐哈尔大学 生命科学与工程学院 , 黑龙江 齐齐哈尔　161006))
摘　要:以零下低温锻炼和结合效应剂(CaCl2 、钙离子螯合剂 EGTA 、钙离子通道阻断剂 LaCl3 或钙
调素拮抗剂 CPE)处理的低温锻炼下的中东扬扦插苗为试材 ,对其体内丙二醛(MDA)及钙调素 CaM
含量 ,SOD 、POD及线粒体 Ca2+-ATPase 活性分别进行测定。结果表明 ,低温锻炼不仅在一定程度下
提高了幼苗 CaM含量 ,提高了 SOD 、POD和 Ca2+-ATPase 活性 ,降低了MDA 含量;而且减少了低温
胁迫所引起的 SOD 、POD ,Ca2+-ATPase和 CaM 含量的下降程度以及MDA 的增加幅度 。在低温锻炼
的同时 ,用 CaCl2 处理能加强低温锻炼的效果 ,但这种效应可被 EGTA 、LaCl3 或 CPZ 处理抑制。经
低温锻炼后 ,幼苗中的CaM含量的增加有助于 SOD 、POD和线粒体 Ca2+-ATPase 活性的提高 ,进而
对幼苗抗冻性的提高有明显的促进作用 。
关键词:中东杨;扦插苗;低温锻炼;钙调素;CaCl2;抗冻性
中图分类号:Q946　　文献标识码:A　　文章编号:1001-1714(2005)05-0009-03
The role of calcium and calmodulin in freezing-induced freezing
resistance of Populus davidiensis cuttings
WU Xu-hong
(College of life Science and Engineering , Qiqihaer University , Qiqihaer 161006 , China)
Abstract:Low temperature signal in woody plants , Populus davidiensis cuttings after being treated with CaCl2 , Ca2+ chelator
EGTA , Ca2+ channel inhibitor LaCl3 or CaM antagonist CPZ were used for freezing acclimation.The changes in the CaM and
MDA contents , the activities of SOD , POD and Ca2+-ATPase of cuttings were investigated.The results showed that freezing accli-
mation not only increased the CaM content , the activities of SOD , POD and Ca2+-ATPase of cuttings , and decreased the MDA
content as compare with control cuttings.but also reduced the degree of decline in CaM content , and in SOD , POD and Ca2+-AT-
Pase activities caused by freezing stress and enhanced the level of increase in CaM content.Treatment with CaCl2 at the time of
freezing acclimation enhanced the effect of freezing acclimation on the above-mentioned indexes.but this enhancement was abol-
ished by EGTA , LaCl3 or CaM antagonist CPZ.The increase of CaM content that promote the higher of activities of SOD , POD and
Ca2+-ATPase of cuttings , and further result in the adaptive changes associated with the development and enhancement of freezing
resistance.
Key word:Populus davidiensis;cuttings;freezing acclimation;calmodulin;CaCl2;freezing resistance
　　低温是限制作物产量和分布的一个重要因素 。
许多作物低温预处理后抗冻性会提高 ,这一过程称
为低温锻炼。大多数植物在进化过程中形成了几套
细胞防御系统 ,这些防御系统通过植物正常生长过
程的抗氧化系统类维持活性氧(AOS)和解毒作用之
间的平衡 。温度压力可以引起AOS 水平的提高 ,进
而伤害细胞膜 ,甚至使新陈代谢受阻 。许多研究表
明 ,冷冻可以引起诸如 SOD 、POD 、CAT 这类抗氧化
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① 收稿日期:2005-02-04;修回日期:2005-06-13
酶活性的增强 ,并且直接导致抗冻性的增强。有人
报道 ,增加线粒体 Ca2+-ATPase 的活性 ,在冷冻锻炼
过程中叶绿体膜和线粒体膜同时能够获得抗冻性 。
近来研究发现 ,Ca2+-CaM(钙-钙调素)在植物生长
过程中起到第二信使作用 ,并且能够协调植物体与
环境的适应 。但是 ,钙调素含量的改变与增强质膜
上SOD 、POD和 Ca2+-ATPase 活性的相互关系 ,尤其
是木本植物中冷冻锻炼过程里冷冻性是怎样获得提
高的却尚未知晓 。
本文以中东杨(Populus davidiensis)枝条为试材 ,
探讨了由于冷冻锻炼而引起抗冻增强的生理机制 ,
并且进一步研究了 Ca2+-CaM 信息系统在木本植物
中的低温诱导作用。
1　材料和方法
1.1　试验材料
中东杨枝条取自齐齐哈尔大学校园 。生根容器
中土与沙体积比为 2∶1 ,温室培养 5周 ,移植到室外
培养 3周 ,此时的枝条即为试验材料 。
1.2　冷冻锻炼 、冷冻损伤及恢复
8周龄的枝条被分为 3组 ,第 1组 100枝 ,置于
25℃下无冷处理(NA);第 2组100枝 ,置于-3℃下 5d
作为冷冻锻炼处理(FA);为了判断 CaM 在诱导抗冻
性中的作用 ,第 3组 400枝 ,再分 4组 ,每组 100枝 ,
用CaCl210mmol·L-1 ,EGTA3mmol·L-1 ,LaCl3 100mmol
·L-1或 CPZ 50 mmol·L-1 ,在 25℃下 5d ,每盆每天根
灌200ml ,然后直接转移到-3℃下 5d作为冷冻锻炼 ,
同时兼为预处理(FA-E)。最后 ,NA 、FA 、FA-E 分
别置于-14℃下 3d ,然后再置于 25℃下恢复 2d ,所有
处理过的枝条生长的光周期为 8h ,光强为 30lx 。
1.3　CaM 的测定及分析
取1g 叶片 ,匀浆于 1.5ml提取缓冲液(pH8.0)
中 ,此缓冲液含(Tris-HCl 50mmol·L-1 、EGTA 1mmol
·L-1 , PMSF(苯甲基磺酰氟)0.5mmol·L-1 、NaCl
0.15mmol·L-1 , 1%PVPP(聚乙烯聚吡咯烷酮),
NaHSO320mmol·L-1)。加温至 90℃并保持 2min后 ,
混合物在 4℃离心(10 000 r·min-1)30min。其离心后
的表面物质即 CaM 。
1.4　Ca2+-ATPase分析
Ca
2+-ATPase 的酶活分析在 37℃,0.5ml反应混合
液(ATP 5mmol·L-1 , CaCl2 4mmol·L-1 ,(NH4)6MO7O24
2mmol·L-1 ,Tris-Mes(pH6.5)50mmol·L-1 ,0.01%非离
子型表面活化剂 Tritonx -100 ,20mg 膜蛋白)中进行 ,
时间为 30min。酶活单位被定义为每分钟从底物上释
放出来的无机磷的量 ,蛋白分析用 Bradford(1976)法 ,
以牛血清白蛋白 BSA为标准。
1.5　SOD 、POD 、MDA的测定和萃取
取 1g叶片匀浆于 5ml 62.5mmol·L-1(pH7.8)含
1%PVPP 的磷酸缓冲液中 ,在 4℃下 ,混合物离心
20min(1 500 r·min-1),上清液用来检验 ,SOD测定参
照文献[ 1 , 2] 。另取 1ml酶液 ,加入含愈创木酚(guaia-
col)20mmol·L-1 3ml 0.1mmol·L-1(pH7.0)磷酸缓冲
液的反应混合液中 ,在 470nm 波长下测 POD活性 ,
以每分钟光密度变化值表示酶活性大小。MDA 的
测定根据硫代巴比妥酸反应[ 2] 。
2　试验结果
2.1　CaM含量的变化
在-14℃时 ,CaM 的含量发生改变 ,这种改变发
生在温度恢复至 25℃的第 2天 ,但是 CaM这种微量
的减少却导致了冷冻压力 ,这种现象在受 CaCl2 处
理过的枝条中要更明显 , FA 组的枝条 CaM 含量改
变程度居中见图 1(A:冷冻锻炼前;B:冷冻锻炼后;
C:冷冻锻炼恢复后 ,下图相同)。
图 1　中东杨插条 CaM含量的变化
图 2　中东杨插条线粒体膜 Ca2+-ATPase变化
　　在-3℃冷冻锻炼5d ,FA组枝条 CaM 含量比未
受锻炼的枝条增加 1 倍 , CaCl2 加强了冷冻锻炼 ,含
CaCl2 组比未受CaCl2处理组高 ,大约为未加组的1.2
倍 ,含 EGTA 、LaCl3 或 CPZ 组的处理中 CaM 含量比
CaCl2的枝条要少的多 ,此外 ,在-3℃时 CaM 含量
增加随时间延长而增加 。
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2.2　线粒体 Ca2+-ATPase活性的改变
在-14℃处理 3d后 ,受过 CaCl2 处理的枝条中
Ca
2+-ATPase 活性降低的比其它组要多 ,尤其是比控
制组多 ,在 25℃温度下恢复 2d ,线粒体 Ca2+-ATPase
活性有所提升 ,用 CaCl2 处理过的枝条回升幅度比
其他组要大(图 2)。
在-3℃时 ,FA组枝条进行冷冻处理 ,Ca2+-AT-
Pase 的活性逐渐增加 ,其增加程度约为未受处理枝
条的 1.4倍 ,CaCl2 加强了冷冻锻炼 。FA组枝条 Ca-
Cl2 处理后 ,其 Ca2+-ATPase水平同未受冷冻锻炼组。
2.3　SOD和 POD活性的改变
在-3℃冷冻锻炼时 FA组枝条 SOD 、POD活性
随时间的延长而增加 , 5d冷冻锻炼后 FA组中 SOD
和 POD活性比对照组高 1.2 ～ 1.3倍 ,CaCl2 的存在
可加强 SOD 和 POD的活性 , EGTA 、LaCl3 或 CPZ 存
在时POD和SOD活性降低。
在-14℃处理 3d ,所有被处理过的枝条 SOD 、
POD的活性均下降 ,但是 CaCl2 处理过的下降程度
比 FA组其他要小 ,温度回升 ,SOD 、POD活性的冷冻
恢复程度中 CaCl2 处理过的枝条要高于其他(图 3)。
图 3　中东杨插条 MDA含量及 SOD、POD活性的变化
2.4　MDA含量的改变
在-3℃时FA 组枝条 MDA含量随时间逐渐降
低 ,经过 5d冷冻锻炼后 , FA组枝条 MDA 含量为对
照组的 3 5。在 CaCl2 处理过的枝条中 MDA含量高
于未经 CaCl2 处理组 ,在降温到-14℃时 ,所有被处
理过的枝条 MDA 含量升高 ,CaCl2 处理组升高值小
于其它组 ,未处理 NA 组 MDA 水平最高 ,但是经过
2d冷冻恢复后 ,MDA 含量又下降 ,下降幅度最小的
也是被CaCl2 处理组 。
3　讨　论
本研究中发现 , CaCl2 可加强冷冻锻炼效果 ,显
著的增强 CaM 含量 ,这说明用 CaCl2 做预处理使冷
冻效应加强是 Ca2+诱导增加了 CaM 含量。因此 ,
CaM的积累与细胞膜上的 Ca2+含量密切相关 ,Ca2+-
CaM信号系统与抗冻性增强过程有关 。
在-3℃的低温锻炼 ,中东杨枝条中随 CaM 含量
的增加使抗冻性增强的同时 ,使 SOD 、POD 线粒体
Ca
2+-ATPase活性都会增强 ,这在 CaCl2 处理组更为
显著 ,但是这种增强可被 EGTA , LaCl3 或 CPZ 抑制。
当温度降至-14℃时 ,在冷冻锻炼的同时 ,用CaCl2处
理降低了 SOD 、POD ,线粒体 Ca2+-ATPase 活性下降
的幅度 ,同时 CaM 含量减少量也有所降低 ,同时上
述各因素在冷冻恢复中的回升水平也明显提高 ,这
些实验结果表明 ,CaM 系统的改变与 SOD 、POD线粒
体Ca2+-ATPase 活性密切相关 。
本试验冷冻锻炼时加入 CaCl2 增强了线粒体
Ca
2+-ATPase活性 , 激活的 Ca2+-ATPase 能够迅速建
立细胞质Ca2+凝集 ,使其保持钙稳态 ,使其保正常的
钙信息系统及生理分解机能[ 3] ,因此可以说经 CaCl2
处理组FA-CaCl2 枝条有很强的钙自稳能力。
总之 ,在冷冻锻炼的过程中加入 CaCl2 ,能够使
抗冻性增强 ,SOD 、POD 、Ca2+-ATPase 活性显著提高 ,
CaM含量的提高表明 CaM 含量可以被 CaCl2 诱导 ,
因此 ,可以说 Ca2+-CaM 信号系统参与了 SOD 、POD
和Ca2+-ATPase 活性的调节和抗冻性的低温诱导。
参 考 文 献:
[ 1] Kang H M Saltveit M E.Activity of enzymatic antioxidant de-
fense systems in chilled and heat shocked cucumber seedling
radicles[ J] .Physiol Plant , 2001 , 133:548-556
[ 2] Draper H H.Hadley M.Malondialdehyde determination as in-
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[ 3] 曾韶西 , 李美茹.冷和盐预处理提高水稻幼苗抗寒性期间
细胞不同部份 CA2+-ATP 酶活性变化[ J] .植物学报 ,
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(责任编辑:刘红民)
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