全 文 ：第20卷　第6期
　Vol.20　 No.6
草　地　学　报
ACTA AGRESTIA SINICA
　　　　　2012年 11月
　 Nov.　　2012
人工饲料对草地螟消化酶活性及
羧酸酯酶mRNA表达量的影响
吴晋华1,2,刘爱萍1∗,徐林波1,高书晶1,韩　冰2,康爱国3,张玉慧3
(1.中国农业科学院草原研究所,内蒙古 呼和浩特　010010;2.内蒙占农业大学生命科学院,内蒙古 呼和浩特　010018;
3.河北省康保县植保站,河北 康保　076650)
摘要:通过对经验型筛选和正交试验优化出的饲料配方饲养的草地螟(Loxostegesticticalis)5龄幼虫中肠淀粉酶、
蛋白酶、酯酶和脂肪酶4种消化酶进行活性测定。结果表明:饲料 HG在蔗糖的添加量稍做改动后,其饲养效果更
接近于草地螟天然食料灰菜(Chenopodiumalbum);饲料12的淀粉酶、蛋白酶、酯酶和脂肪酶都与对照组相差较
多,蛋白含量、脂类含量与糖类含量需做进一步的修正与试验。另外利用RT-PCR方法,通过研究人工饲料 HG,
12及对照组 H对草地螟羧酸酯酶基因转录水平的影响,从分子水平快速评价出饲料 HG优于饲料12。研究结果
为今后的草地螟人工饲养及饲料配方进一步改进提供了理论依据。
关键词:草地螟;人工饲料;消化酶;羧酸酯酶;RT-PCR
中图分类号:S433　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1007-0435(2012)06-1169-06
EffectsofArtificialDietsonDigestiveEnzymeActivitiesinLoxostegesticticalis
WUJin-hua1,2,LIUAi-ping1∗,XULin-bo1,GAOShu-jing1,HANBing2,KANGAi-guo3,ZHANGYu-hui3
(1.GrasslandResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Huhhot,InnerMongolia010010,China;
2.ColegeofLifeScience,InnerMongoliaAgriculturalUniversity,Hohhot,InnerMongolia010018,China;
3.PlantProtectionStationofKangbaoCounty,Kangbao,HebeiProvince076650,China)
Abstract:Thispaperstudiedthebowelamylase,protease,esterenzymeandlipaseofLoxostegesticticalis
5-instarlarvafedbyoptimalfeedformulawhichwasselectedbyexperiencescreeningandorthogonaltest.
ResultsshowedthatthefeedeffectofartificialdietHGafteraddingsucrosewasclosertothatofChenopo-
diumalbum.Theamylase,protease,esteraseandlipaseactivitiesofartificialdiet12weredifferentfrom
thoseofcontrolgroup.Inaddition,theeffectsofartificialdietHGand12oncarboxylesterasegenetran-
scriptionlevelsofLoxostegesticticaliswerestudiedusingRT-PCR.ArtificialdietHGwassuperiortoar-
tificialdiet12.TheseresultsprovidedatheoreticalbasisforfurtherimprovementofLoxostegesticticalis
L.artificialfeedingandfeedformula.
Keywords:Loxostegesticticalis;Artificialdiets;Digestiveenzymes;Carboxylesterase;RT-PCR
　　草地螟(LoxostegesticticalisL.)是我国北方
地区间歇性暴发的一种害虫,给农牧业生产造成了
巨大的经济损失[1]。在对该虫的综合防治中,天敌
的保护利用及新型生物农药开发成为研究的热点。
然而天敌的扩繁和生物农药的筛选和测定等均需要
大量发育一致的草地螟试虫,所以草地螟的室内人
工饲养成为当前重要的研究内容之一[2]。
昆虫的中肠是分泌消化酶、消化食物和吸收养
分的主要部位,进入体内的营养物质在血液、脂肪体
等组织中在酶的作用下进一步代谢,这些酶活性强
弱与饲料吸收利用有着直接的联系[3]。因此,分析
人工饲料中营养成分对消化酶活性的影响,不仅可
以作为饲料中各营养成分消化、吸收和利用的重要
指标,而且对人工饲料的合理配制具有重要意义。
羧酸酯酶广泛分布于多种组织中,能有效地催
化含酯键、酰胺键和硫酯键的内源性和外源性化合
收稿日期:2012-05-16;修回日期:2012-09-25
基金项目:公益性行业(农业)科研专项(201103002);农业部“948”项目(2011-G4)资助
作者简介:吴晋华(1986-),女,山西太原人,硕士研究生,研究方向为生物化学与分子生物学,E-mail:wujinhua1986@163.com;∗通信作者
Authorforcorrespondence,E-mail:liuaiping806@sohu.com
草　地　学　报 第20卷
物水解[4-6]。消化道中羧酸酯酶的活性反映了2方
面的信息:首先羧酸酯酶是昆虫体内重要的解毒酶
系之一,不仅与昆虫抗药性有关,而且可减轻或使昆
虫免受来自植物次生物质的毒害,从而增强昆虫对
不同品种植物的适应性。昆虫体内酯酶的活力大小
可反映其消化食物能力的强弱,酯酶活力越大,消化
食物能力越强[7-8]。作者在研究不同人工饲料对草
地螟幼虫生长繁殖影响的基础(另文发表)上,深入
研究饲料成分对草地螟中肠主要消化酶活性的影
响,并利用 RT-PCR方法,通过研究试验筛选出的
2种人工饲料对草地螟羧酸酯酶基因转录水平的影
响,在分子水平确认羧酸酯酶分泌量的变化,旨在从
分子水平快速评价草地螟饲料配方的优劣,本研究
可为草地螟人工规模化饲养提供理论依据,同时可
为天敌昆虫的消化生理和营养需求积累基础资料。
1　材料与方法
1.1　供试虫源
草地螟成虫采自河北康保县。在人工气候箱内
(T=(23±1)℃,RH60%~70%,光照L∶D=16h∶
8h)用10%葡萄糖水饲养至产卵,每天早上收集草
地螟卵,放在铺有保湿滤纸的培养皿中,3d后收集
初孵幼虫供试。
1.2　人工饲料的配置
饲料HG配方:酪蛋白4g、酵母粉1.6g、麦麸
4g、琼脂3g、山梨酸0.2g、蔗糖8g、抗坏血酸0.
15g、干灰菜(Chenopodiumalbum)粉15g、水100
mL。
饲料12配方:酪蛋白6g、酵母粉4g、麦麸9
g、琼脂4.5g、山梨酸0.15g、尼泊金0.1g、蔗糖12
g、胆固醇0.3g、多种维生素1g、无机盐3.75g、抗
坏血酸0.3g、氯化胆碱0.075g、干灰菜粉10g、水
100mL。
1.3　草地螟虫源饲养
将配制好的饲料切块分别装入编号的透明塑料
养虫盒中。将刚孵化的草地螟幼虫接入养虫盒,置
于人工气候箱(T=(23±1)℃,RH60%~70%,光
照L∶D=16h∶8h)饲养,以新鲜苜蓿(Medicago
sativa)叶和灰菜叶作为人工饲料的对照(H)。每盒
接30头,每个配方重复3次。待幼虫长至1龄末
时,将幼虫分开单头饲养。低龄幼虫每天换一次饲
料,大龄幼虫每3d更换一次饲料。
1.4　酶活动的测定
中肠酶液的制备:取5龄第2天幼虫冰浴中解
剖,用预冷的0.15mol·L-1NaCl溶液冲去体液,
取中肠(第1对胸足和第3对腹足之间)及其内含物
冰冻储存(-20℃)。待测试前取出消融,按照体重
以10mL·g-1的比例加入预冷的0.15mol·L-1
NaCl溶液,冰浴中匀浆,12000r·min-1,4℃离心
15min后得到上清液作为测试中肠酶液。将原酶
液稀释10~20倍。
中肠蛋白质总量测定:以牛血清蛋白作标准,参
照Bradford[9]的考马斯亮蓝G-250染色法测定。
蛋白酶活性测定[10]:以质量分数2%干酪素溶
液作为底物与酶反应,在680nm波长下测定反应
液的吸光度值。
中肠淀粉酶比活力的测定:采用二硝基水杨酸
法[11]。以质量分数1%的淀粉溶液作为底物与酶反
应,在490nm波长下测定反应液的吸光度值。
中肠酯酶活力测定:参照施特尔马赫 B 方
法[12],以0.0003mol·L-1α-醋酸萘酯为底物与酶
反应,于600nm处测定吸光度值。根据标准曲线
方程,求转化生成α-萘酚的量。酶活力单位(U)以
μmol·mg-1·min-1表示。
中肠脂肪酶比活力的测定:参照王静[13]酸碱滴
定法进行,以聚乙醇烯橄榄油为底物的标准氢氧化
钠溶液滴定。
1.5　草地螟羧酸酯酶mRNA的表达量测定
总RNA的提取:将20mg草地螟中肠组织从
-80℃取出后立即充分研磨,立即按照TIANGEN
公司的RNApreppure动物组织总RNA提取试剂
盒说明进行操作,提取总RNA。
RNA浓度测定:取5μL的RNA样品,稀释到
5mL,紫外分光光度计分别测定260和280nm波
长下RNA样品的OD值,然后计算样品中RNA的
浓度。
RNA电泳:1.2%琼脂糖凝胶电泳,0.5×TAE
缓冲液,GoldView染色。电压90V,20min,RNA
5μL,6×buffer1μL。同时,用2000bp标准分子
量DNA6μL做为 Marker,凝胶成像分析仪观察结
果。
cDNA第1链合成:总RNA浓度经测定后,使
用cDNA 第1链合成试剂盒合成cDNA(采用
0711
第6期 吴晋华等:人工饲料对草地螟消化酶活性及羧酸酯酶mRNA表达量的影响
Stratagene公司的cDNASynthesisKit)第1链。按
反转录试剂盒说明书进行。25℃10min,42℃30
min,然后85℃5min灭活AMV,合成好的cDNA
置于-20℃保存待测。
半定量 RT-PCR:由 GenBank查得目的基因
mRNA序列,利用Primer5.0和Primer3.0软件
自行设计目的基因引物序列,由Invingens公司提
供,如表1所示。
18S与CarE的PCR扩增程序为(25μL):94℃
预变性5min,94℃30s,53℃30s,72℃1min,共
30个循环,最后72℃延伸7min。
电泳检测扩增结果:PCR 产物经体积分数
1.5%琼脂糖凝胶电泳和GoldView染色后用 UVP
成像系统成像,Quantityone4.6.5分析各条带积
分光光密度(IOD),以目的基因与18S内标基因
IOD值之比作为各目的基因表达水平。
1.6　数据处理
采用Excel2003软件进行数据整理,运用 DPS
统计软件对试验数据进行方差分析[14],试验数据以
“平均值±标准误差(Mean±SD)”表示。显著性测
定采用Duncan氏新复极差法。
表1　羧酸酯酶LstiCarE基因与18S内标基因上下游引物序列
Table1　TheupstreamanddownstreamprimersofcarboxylesteraseLstiCarEgeneand18SrRNAgene
目的基因Purposegene 上游引物 Upstreamprimer 下游引物 Downstreamprimer 产物大小Productsize
羧酸酯酶LstiCarE基因
Carboxylesteras-eLstiCarEgene
TATCCATGGCGGAGCTTATC GTCCAGCCAAGACGTAGAGC 408bp
18S内标基因18SrRNAgene CAGGTCTGTGATGCCCTTAGA GGGAATTCCTCGTTCATGG 156bp
2　结果与分析
2.1　人工饲料对草地螟消化酶活性的影响
由测得的牛血清标准曲线可知(图1),回归方
程为y=3.0819x+0.0108,R2=0.9994。y为吸光
值,x为牛血清蛋白浓度(mg·mL-1)。
图1　牛血清标准曲线
Fig.1　Standardcurveofbovineserumalbumin
　　由测得的α-萘酚标准曲线可知(图2),回归方
程为y=0.5128x-0.0047,R2=0.9998。y为吸光
值,x为α-萘酚浓度(×10-4mol·L-1)。
　　由测得的麦芽糖标准曲线可知(图3),回归方
程为y=1.6944x+0.0657,R2=0.9969。y为吸光
值,x为麦芽糖浓度(mg·mL-1)。
　　由测得的酪氨酸标准曲线可知(图4),回归方
程为y=0.0089x+0.0077,R2=0.9975。y为吸光
值,x为酪氨酸浓度(μg·mL-1)。
图2　α-萘酚标准曲线
Fig.2　Standardcurveofα-naphthol
图3　麦芽糖标准曲线
Fig.3　Standardcurveofmaltose
　　草地螟中肠总蛋白量测定结果如图5所示,幼虫
取食人工饲料HG和12后总蛋白量活性分别为0.052
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草　地　学　报 第20卷
和0.059mg·mL-1,略低于对照组 H 的0.076
mg·mL-1,且三者之间差异不显著。
图4　酪氨酸标准曲线
Fig.4　Standardcurveoftyrosine
图5　人工饲料对草地螟中肠蛋白质含量的影响
Fig.5　Effectofartificialdietonmidgutprotease
contentofLoxostegesticticalis
　　草地螟取食人工饲料后,其中肠蛋白酶活性测定
结果如图6所示,人工饲料 HG和对照组 H的蛋白
酶活性分别为6.18和7.91U(μg·min-1·mg-1,下
同),均显著高于人工饲料12(P<0.05)。可能是在
人工饲料12中添加的蛋白质(酪蛋白、酵母粉)含量
高于幼虫本身所需所致。
图6　人工饲料对草地螟中肠蛋白酶活性的影响
Fig.6　Effectofartificialdietonmidgut
proteaseofLoxostegesticticalis
　　草地螟中肠淀粉酶活性测定结果如图7所示,
对照组的淀粉酶活性为13.29U,显著高于2种人
工饲料的淀粉酶活性(P<0.05)。饲料组HG与12
的淀粉酶活性相差不大,分别为0.18和1.29U。
草地螟取食饲料后的中肠淀粉酶活性,随饲料中蔗
糖添加量的增加而增大。
图7　人工饲料对草地螟中肠淀粉酶活性的影响
Fig.7　Effectofartificialdietonmidgut
amylaseofLoxostegesticticalis
　　草地螟中肠酯酶活性测定结果如图8所示,对
照组H酯酶活性最高,为12.77U;其次是人工饲
料HG,其酯酶活性(11.97U)仅次于对照组;人工
饲料12的最低,仅约为人工饲料 HG酯酶活性的
1/2。人工饲料HG和对照组H的酯酶显著高于人
工饲料12的(P<0.05)。
图8　人工饲料对草地螟中肠酯活性的影响
Fig.8　Effectofartificialdietonmidgut
esteraseofLoxostegesticticalis
　　草地螟中肠脂肪酶活性测定结果如图9所示,
人工饲料12脂肪酶活性最高,为0.68U,约为其他
2组脂肪酶活性的2~3倍,且与其他2组差异显著
(P<0.05),这可能是在人工饲料12中添加了胆固
醇的原因。
2711
第6期 吴晋华等:人工饲料对草地螟消化酶活性及羧酸酯酶mRNA表达量的影响
图9　人工饲料对草地螟中肠脂肪酶的影响
Fig.9　Effectofartificialdietonmidgut
lipaseofLoxostegesticticalis
2.2　人工饲料对草地螟羧酸酯酶 mRNA丰度的
影响
草地螟RNA的提取:采用RNApreppure动物
组织总RNA提取试剂盒提取的总 RNA,经电泳检
测,显示28S和18SRNA条带清晰,用紫外分光光度
计检测OD260/OD280比值在1.9~2.0之间,说明提取
的RNA完整,在提取过程中没有降解,纯度高,质量
良好,可以进行下一步PCR扩增(图10)。
图10　总RNA提取电泳图
Fig.10　ElectrophoresisoftotalRNA
　　通过Quantityone4.6.5分析图11和图12中
各条带积分光光密度(IOD),结果显示(表2),饲料
HG和12的CarE基因mRNA的丰度与对照组相
比,差异均有统计学意义(P<0.05),对照组的mR-
NA表达量最高,为1.02;其次饲料 HG的表达量
为0.95,饲料12的表达量为0.85。可见草地螟幼
虫对饲料 HG对草地螟羧酸酯酶基因的转录水平
高于饲料12的,即饲料HG饲喂的草地螟体内的羧
酸酯酶分泌量高于饲料12饲喂的。饲料 HG与对
照组差异不显著,而饲料12与对照组差异显著。由
于昆虫体内酯酶的活力大小可反映其消化食物能力
图11　各组18S内标基因PCR产物电泳图
Fig.11　PCRproductsof18SrRNAgene
图12　羧酸酯酶LstiCarE基因PCR产物电泳图
Fig.12　PCRproductsofcarboxylesteraseLstiCarEgene
的强弱,酯酶活力越大,消化食物能力越强,所以草
地螟幼虫对饲料 HG的消化能力大于对饲料12的
消化能力,草地螟饲料配方HG优于饲料配方12。
表2　人工饲料与对照组CarE基因 mRNA的丰度
Table2　mRNAabundanceofCarEgene
frombothartificialdietandcontrolgroups
组别
Group
CarE 基因 mRNA丰度
mRNAabundanceofCarEgene
对照 HControlH 1.02±0.021a
饲料 HGArtificialdietHG 0.95±0.013a
饲料12Artificialdiet12 0.85±0.013b
3　讨论与结论
草地螟人工饲料的研究[15-16]与饲料效果评价一
直以来都依靠传统的方法,但其饲养周期长,饲养过
程受到许多因素的影响,试验偏差大,成本高。因
此,探索快速有效的评价饲料效果的新方法是研究
重点之一。
林美珍等[17]对优化的饲料配方饲养的大草蛉
(Sympetrumcroceolum)3龄幼虫中肠蛋白酶、海藻
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草　地　学　报 第20卷
糖酶和脂肪酶3种消化酶进行活性测定表明,人工
饲料组的蛋白酶活力比饲喂蚜虫对照组高3.88倍,
海藻糖酶活力高出比例为0.65,脂肪酶活力相差比
例为0.46;说明该人工饲料中的蛋白含量偏高,而
脂类含量则有所偏低。本研究通过在前人研究上试
验可知,取食人工饲料的草地螟5龄幼虫的几种中
肠消化酶活性与取食灰菜相比,酶活性有的偏高,有
的偏低,同样也说明人工饲料中营养成分比例与草
地螟天然食物相比有一定差距。本次酶活性测定结
果表明,饲料HG的饲养效果更接近于草地螟天然
食料,只是蔗糖的添加量需稍做改动;饲料12的淀
粉酶、蛋白酶、酯酶和脂肪酶都与对照组相差较多,
蛋白含量、脂类含量与糖类含量都需做进一步的修
正与试验。由于消化酶的活性受各方面因素的影
响,对于草地螟消化酶活性与饲料之间的关系还有
待进一步深入的研究。
姜巨峰等[18]研究了4种蛋白水平的饲料对鲮
(Cirrhinusmolitorella)生长、消化酶活性及类胰岛
素生长因子(IGF-I)mRNA表达水平的影响,发现
不同饲料蛋白水平下,蛋白酶活性与特定生长率成
正相关性,鲮肝组织中IGF-ImRNA的表达量与特
定生长率成正相关性,鲮肝组织IGF-ImRNA的表
达量与蛋白酶活性也成正相关,所以用鲮肝组织
IGF-ImRNA的表达量可以快速鉴定饲料的质量。
黎军胜[19]以半定量RT-PCR法测定了不同品种、体
重、环境温度、饲料蛋白水平和外源酶对罗非鱼
(Tilapia)胰蛋白酶 mRNA表达量的影响,所以可
以从分子水平来快速评价昆虫人工饲料配方的好
坏。现已明确,草地螟体内酯酶的活力大小可反映
其消化食物能力的强弱,酯酶活力越大,消化食物能
力越强[7-8]。本研究通过 RT-PCR 方法,比较饲料
HG和12对草地螟羧酸酯酶基因的转录水平的高
低,从而在分子水平上快速评估出饲料 HG优于饲
料12。
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(责任编辑　刘云霞)
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