全 文 ：第１９卷　第６期
　Ｖｏｌ．１９　 Ｎｏ．６
草　地　学　报
ＡＣＴＡ　ＡＧＲＥＳＴＩＡ　ＳＩＮＩＣＡ
　　　２０１１年　 １１月
　 Ｎｏｖ．　　２０１１
白颖苔草热激转录因子基因的克隆及其序列分析
孙　彦，党卫玲，杨春华，邸　超，周　禾＊
（中国农业大学动物科技学院草业科学系 草业科学北京市重点实验室，北京　１００１９３）
摘要：白颖苔草（Ｃａｒｅｘ　ｒｉｇｅｓｃｅｎｓ（Ｆｒａｎｃｈ．）Ｖ．Ｋｒｅｃｚ．）的热激转录因子基因是重要的耐热候选基因。通过序列多
重比对设计简并引物，扩增出白颖苔草的热击转录因子基因ｃＤＮＡ的中间片断，并在此基础上利用ＲＡＣＥ技术得
到３′端ｃＤＮＡ片段和５′端ｃＤＮＡ片段。结果表明：通过序列拼接获得该基因的全长ｃＤＮＡ（１２２６ｂｐ），命名为
ＣｒＨＳＦ。序列分析表明其含有一个完整的开放阅读框（１０３～１０２３ｂｐ），编码蛋白质含有３０６个氨基酸，分子量为
３８．７５ｋＤａ，等电点为５．８５。ＣｒＨＳＦ的氨基酸序列与ＯｓＨＳＦ的同源性为５９％，与已知的其他热激转录因子也具有
较高的同源性。在ＣｒＨＳＦ的氨基酸序列中没有预测到信号肽以及跨膜区域，但是具有多种翻译后修饰的加工位
点。
关键词：白颖苔草；热激转录因子；ＲＴ－ＰＣＲ；ＲＡＣＥ；基因克隆；序列分析
中图分类号：Ｑ９４３．２　　　　文献标识码：Ａ　　　　　文章编号：１００７－０４３５（２０１１）０６－１０３０－０６
Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ａ　Ｈｅａｔ　Ｓｈｏｃｋ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
Ｆａｃｔｏｒ　Ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍＣａｒｅｘ　ｒｉｇｅｓｃｅｎｓ
ＳＵＮ　Ｙａｎ，ＤＡＮＧ　Ｗｅｉ－ｌｉｎｇ，ＹＡＮＧ　Ｃｈｕｎ－ｈｕａ，ＤＩ　Ｃｈａｏ，ＺＨＯＵ　Ｈｅ＊
（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｇｒａｓｓｌａｎｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎａ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｇｒａｓｓｌａｎｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ｉｎ　Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１００１９３，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ＨＳＦｇｅｎｅ　ｃｌｏｎｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｒｉｇｅｓｅｃｅｎｔ　Ｓｅｄｇｅ（Ｃａｒｅｘ　ｒｉｇｅｓｃｅｎｓ（Ｆｒａｎｃｈ．）Ｖ．Ｋｒｅｃｚ．）ｉｓ　ａｎ　ｉｍ－
ｐｏｒｔａｎｔ　ｈｅａｔ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｃａｎｄｉｄａｔｅ　ｇｅｎｅ．Ａ　ｐａｉｒ　ｏｆ　ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ａｇａｉｎｓｔ　ｔｈｅ　ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ｒｅｇｉｏｎｓ
ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ａｍｐｌｉｆｙ　ａ　ｃＤＮＡ　ｓｅｇｍｅｎｔ（１８９ｂｐ）ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　Ｒｉｇｅｓｃｅｎｔ　Ｓｅｄｇｅ　ｂｙ　ＲＴ－ＰＣＲ．Ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｃＤＮＡ
ｓｅｇｍｅｎｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ｐｒｉｍｅｒｓ　ｏｆ　３′ＲＡＣＥ　ｗｅｒｅ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ａｎｄ　ａ　９０２ｂｐ　ｃＤＮＡ　ｓｅｇｍｅｎｔ　ｗａｓ　ａｃｑｕｉｒｅｄ．Ｔｈｅ
ｐｒｉｍｅｒｓ　ｏｆ　５′ＲＡＣＥ　ｗｅｒｅ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ｆｒｏｍ　３′ｅｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｅｇｍｅｎｔ　ａｎｄ　ａ　３２３ｂｐ　ｃＤＮＡ　ｓｅｇｍｅｎｔ　ｗａｓ
ａｃｑｕｉｒｅｄ．Ｔｈｅ　ｆｕｌ－ｌｅｎｇｔｈ　ｃＤＮＡ（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ＣｒＨＳＦ，１２２６ｂｐ）ｗａｓ　ｇａｉｎｅｄ　ｂｙ　ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｔｈｅ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｓ　ｔｈａｔ　ｉｔ　ｃｏｎｔａｉｎｓ　ａｎ　ｏｐｅｎ－ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ　ｆｒｏｍ　１０３ｂｐ　ｔｏ　１０２３ｂｐ，ｅｎｃｏｄｉｎｇ　３０６
ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｒｅｓｉｄｕｅｓ，ｗｉｔｈ　３４．９３ｋＤａ　ｏｆ　ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｓｓ　ａｎｄ　５．７７ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ　ｐｏｉｎｔｓ．Ｔｈｅ　ｄｅｄｕｃｅｄ
ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｓｈｏｗｓ　５９％ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ　ｔｏ　ＯｓＨＳＦ　ａｎｄ　ｉｔ　ａｌｓｏ　ｓｈａｒｅｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ　ｗｉｔｈ　ｏｔｈｅｒ
ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ　ｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ．Ｉｎ　ａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅ　ＣｒＨＳＦ　ｃｏｎｔａｉｎｓ　ｎｏ　ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｓｉｇｎａｌ　ｐｅｐｔｉｄｅ，
ｂｕｔ　ｉｔ　ｃｏｎｔａｉｎｓ　ｓｅｖｅｒａｌ　ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ｓｉｔｅｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｃａｒｅｘ　ｒｉｇｅｓｃｅｎｓ（Ｆｒａｎｃｈ．）Ｖ．Ｋｒｅｃｚ．；Ｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ；ＲＴ－ＰＣＲ；ＲＡＣＥ；Ｍｏ－
ｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ
　　冷季型草坪草在我国北方生长良好、表现优良，
堪称北方地区的当家草种。但北京地区夏季高温高
湿的环境使得冷季型草坪草在病虫害侵扰下大面积
死亡，很难成功越夏，造成严重的经济损失。因此，
耐热、高抗型草坪草品种的选育工作急待开展。生
物体在高温环境中容易产生热激反应［１］。植物在热
激反应过程中能快速地产生热激蛋白（ｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋ
ｐｒｏｔｅｉｎ，ＨＳＰ）。热激蛋白能够消除热胁迫的影响，
有效地保护细胞和生物体［２～４］。目前已从多种真核
生物中克隆到ＨＳＦ（Ｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃ－
ｔｏｒ）基因。如酵母、大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ　Ｍｅｒｒ．）、果
蝇（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
收稿日期：２０１１－０６－１０；修回日期：２０１１－０９－１３
基金项目：草业科学北京市重点实验室开放课题项目资助
作者简介：孙彦（１９６５－），女，内蒙古通辽人，副教授，博士研究生，主要从事草坪科学与管理及草种子检验方面的研究，Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｔｓｏｆｆｉｃｅ＠
ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ；＊通信作者 Ａｕｈｔｏｒ　ｆｏｒ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ，Ｅ－ｍａｉｌ：Ｚｈｏｕｈｅ＠ｃａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
第６期 孙彦等：白颖苔草热激转录因子基因的克隆及其序列分析
ｔｈａｌｉａｎａ）、人、番茄（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、水稻
（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．）、紫花苜蓿 （Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｓａｔｉｖａ
Ｌ．）和玉米（Ｚｅａ　ｍａｙｓ　Ｌ．）等均已分离到 ＨＳＦ 基
因［５～９］，但有关草坪草热激因子基因的报道很
少［１０］。
白 颖 苔 草 （Ｃａｒｅｘ　ｒｉｇｅｓｃｅｎｓ （Ｆｒａｎｃｈ．）Ｖ．
Ｋｒｅｃｚ．）是很好的疏林游乐草坪植物。主要分布于
华北、西北及辽宁、河南、山东等地。该草叶绿、纤
细，外形整齐美观，抗瘠薄、耐旱性强。在我国北方
地区多用作观赏和装饰性草坪，也可用作人流量不
多的公园、庭院、街道、花坛等的绿化材料。白颖苔
草是北京地区野生的当家草种，在北京夏天极端高
温的条件下仍然生长良好，返青早，绿期约为２５０ｄ，
生长整齐，是具有很大发展潜力的野生草坪资源。
因此，如果从白颖苔草中克隆出耐热基因，将之转入
北方不耐热的其他冷季型草坪草中，是提高其耐热
性加速育种进程的捷径［７］。
１　材料与方法
１．１材料
１．１．１　植物材料、菌株和克隆载体　白颖苔草：由
中国农业大学草地研究所提供。大肠杆菌：ＤＨ５α
菌株，中国农业科学院北京畜牧兽医研究所保存。
克隆载体：ｐＭＤ－１８Ｔ（ＴａＫａＲａ公司）。
１．１．２　化学试剂及工具酶　琼脂糖凝胶ＤＮＡ片
段回收试剂盒为北京ＴＩＡＮＧＥＮ公司产品，逆转录
试剂盒为 Ｐｒｏｍｅｇａ公司产品。３′－ＲＡＣＥ 试剂盒
（ＴａＫａＲａ公司）。５′－ＲＡＣＥ 试剂盒（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公
司）。ＤＥＰＣ为 ＡＭＲＥＳＣＯ公司产品，Ｔｒｉｓ为Ｓｉｇ－
ｍａ公司产品，琼脂糖为Ｓｐａｎｉｓｈ公司产品，氨苄青
霉素钠盐、水饱和酚（ｐＨ５．４）为上海生工产品，异硫
氰酸胍购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司。Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶购自
北京ＴＩＡＮＧＥＮ公司。ＥｘＴａｑ酶（ＴａＫａＲａ公司）。
１．２　方法
１．２．１　ＲＮＡ的提取及ｃＤＮＡ的合成　白颖苔草
４０ｄ幼苗全株采用异硫氰酸胍法［１０］提取总ＲＮＡ。
用１％琼脂糖凝胶电泳检测总ＲＮＡ纯度质量及完
整性，紫外光分光光度计测量 Ａ２６０／２８０值，评估
ＲＮＡ纯度及浓度。ＲＮＡ逆转录为ｃＤＮＡ的方法
参照Ｐｒｏｍｅｇａ公司试剂盒［１１］。
１．２．２　利用ＲＡＣＥ技术获得基因序列［１２～１６］　搜
索ＧｅｎＢａｎｋ，将各种植物的热激转录因子氨基酸序
列进行同源性比较，找出高度同源的区段，根据同源
性高和简并性低的原则，利用ＤＮＡＭＡＮ和Ｐｒｉｍｅｒ
５．０生物软件设计一对简并引物ＣＳ１和ＣＳ２，用于
扩增ＣｒＨＳＦ基因的中间片段。引物由上海生工合
成。ｃＤＮＡ第１链的合成参照Ｐｒｏｍｅｇａ公司的产
品说明书进行。
ＣＳ１：５′－ＣＣＹＣＣＧＴＴＹＣＴＧＡＢＳＡＡＧＡＣＫＴＡ－３′
ＣＳ２：５′－ＡＡＷＣＣＡＴＡＲＧＴＲＴＴＳＡＧＣＴＧＹＣ－３′
３′端序列的获得使用的是 ＴａＫａＲａ公司的３′－
Ｆｕｌ　ＲＡＣＥ　Ｃｏｒｅ　Ｓｅｔ，运用Ｐｒｉｍｅｒ　５．０软件结合已
知序列中间片断及ＤＮＡＭＡＮ软件设计３′端特异
性 引 物 ＧＳＰ３，ＧＳＰ３：５′－ＧＡＡＣＴＴＣＴＣＣＡＧＣＴ－
ＴＣＧＴＣＡＧＧＣ－３′。用ＧＳＰ３作为上游引物，用１个
含有部分接头序列的通用引物（３－ｓｉｔｅｓ　Ａｄａｐｔｏｒ　Ｐｒｉｍ－
ｅｒ）作为下游引物，序列为：５′－ＣＴＧＡＴＣＴＡＧＡＧＧ－
ＴＡＣＣＧＧＡＴＣＣ －３′。以ｃＤＮＡ第１链为模板，进行
ＰＣＲ循环，ＰＣＲ扩增程序：９４℃下预变性３ｍｉｎ后，
９４℃变性３０ｓ，５８℃退火３０ｓ，７２℃延伸７０ｓ，共４０
个循环，最后７２℃下延伸５ｍｉｎ，把目的基因３′末端
的ｃＤＮＡ片段完整扩增出来。
以获得基因的３′末端为基础，参照Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ
公司的Ｔｈｅ　ＳＭＡＲＴＴＭＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｋｉｔ说明书扩增ＣｒＨＳＦ 基因的５′端序列。用５′－
ＲＡＣＥ特定的带有Ｏｌｉｇｏ　ｄＴ的５′－ＣＤＳ作为引物，
５′－ＲＡＣＥ　ＣＤＳ　Ｐｒｉｍｅｒ：５′－（Ｔ）２５Ｎ－１Ｎ－３′（Ｎ＝Ａ，
Ｃ，Ｇ，或 Ｔ；Ｎ－１＝Ａ，Ｇ或 Ｃ）。而上游接头引物
ＳＭＡＲＴⅡ ＡＴＭ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：５′－ＡＡＧＣＡＧＴＧ－
ＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＧＣＧＧＧ－３′。
其３′端带有的３个ｄＧ可以与第１链ｃＤＮＡ
３′端的ｄＣ配对，从而退火延伸合成ｃＤＮＡ第２链。
利用该试剂盒附带的上游通用引物 ＵＰＭ，其包含
长度不同、部分序列相同的２个引物，序列如下：
Ｌｏｎｇ：５′－ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ
ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ－３′，
Ｓｈｏｒｔ：５′－ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ－３′，
结合下游的基因特异性引物ＧＳＰ５，其序列为：
ＧＳＰ５：５′－ＴＣＣＣＡＣＡＣＡＡＣＧＡＡＧＣＴＡＴＴＡＣＣＡＧ－
３′，ＰＣＲ扩增程序：９４℃变性５ｓ，７２℃延伸３ｍｉｎ，共
５个循环，９４℃变性５ｓ，７０℃退火１０ｓ，７２℃延伸３
ｍｉｎ，共５个循环，最后９４℃变性５ｓ，６８℃退火１０
ｓ，７２℃延伸２ｍｉｎ，共２５个循环，即可扩增出目的基
因ｃＤＮＡ的５′端。目的条带经胶回收纯化后，连接
到ｐＧＥＭ２ＴＥａｓｙ载体上，转化大肠杆菌ＤＨ５α，委
１３０１
草　地　学　报 第１９卷
托上海生工公司进行测序，测序后进行序列拼接得
到ＣｒＨＳＦ基因的ｃＤＮＡ全长序列。
１．２．３　序列分析　ＰＣＲ扩增确认为阳性的克隆送
到上海生工生物工程公司测序。序列分析所用的软
件为ＤＮＡＭＡＮ（３．０版本，Ｌｙｎｎｏｎ　Ｂｉｏｓｏｆｔ）。同源
性检索分析通过在线 ＢＬＡＳＴ 软件进行（网站为
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ）。
２　结果与分析
２．１　白颖苔草总ＲＮＡ的提取
总ＲＮＡ的质量是关系逆转录ｃＤＮＡ完整性的
重要因素。提取的白颖苔草总ＲＮＡ用无ＲＮａｓｅ的
ＤＮａｓｅⅠ处理，除去污染的基因组ＤＮＡ，用０．８％琼
脂糖非变性凝胶电泳鉴定，结果如图１所示。２８Ｓ
ＲＮＡ和１８ＳＲＮＡ条带清晰，浓度比例符合要求，
表明提取的 ＲＮＡ 完整性较好。提取的 ＲＮＡ 的
ＯＤ２６０／ＯＤ２８０都介于１．８～２．０之间，表明无蛋白质
和苯酚污染，说明ＲＮＡ的纯度比较高，可以用于下
面的试验。
图１　从白颖苔草中提取的总ＲＮＡ
Ｆｉｇ．１　Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　ｆｒｏｍ　Ｒｉｇｅｓｃｅｎｔ　Ｓｅｄｇｅ
２．２　白颖苔草热激转录因子基因ｃＤＮＡ部分序列
的克隆及ＣｒＨＳＦ基因３′端和５′端序列的克隆和全
序列的拼接
２．２．１　白颖苔草热激转录因子基因ｃＤＮＡ部分序列
的克隆　采用异硫氢酸胍法提取总ＲＮＡ，利用ＤＮＡ－
ＭＡＮ和Ｐｒｉｍｅｒ　５．０生物软件设计一对简并引物，用
于扩增基因的中间片段。通过 ｍＲＮＡ的逆转录，
ＰＣＲ扩增，ＰＣＲ产物的回收和纯化等程序获得。如
图２所示，阳性克隆经测序得到一段１８９ｂｐ的序列，
用琼脂糖凝胶试剂盒回收纯化扩增的片段，连接到
ｐＭＤ－１８Ｔ克隆载体上，转化大肠杆菌ＤＨ５α。从转化
的平板上挑选白斑摇菌，随机挑选几个进行菌体
ＰＣＲ，其中扩增出目的片段的可能为阳性克隆，测序
以确定其正确性。将该序列及其编码的氨基酸序列
在ＧｅｎＢａｎｋ中进行ＢＬＡＳＴ分析，结果显示这一序列
与许多植物的热激转录因子基因具有同源性，说明得
到的中间片段的序列可能是白颖苔草热激转录因子
基因，并将该基因命为ＣｒＨＳＦ。
２．２．２　ＣｒＨＳＦ基因３′端序列的克隆　总ＲＮＡ用
Ｏｌｉｇｏ　ｄＴ－３ｓｉｔｅｓ　Ａｄａｐｔｏｒ引物逆转录，然后根据中
间片段序列设计一个基因特异性引物（ＧＳＰ３）。用
ＧＳＰ３与Ａｄａｐｔｏｒ　Ｐｒｉｍｅｒ进行ＰＣＲ扩增，ＰＣＲ产物
电泳结果显示在１０００ｂｐ附近有单一条带（图３），与
预计的目的带片段大小相符。回收纯化ＰＣＲ产物，
连接载体，转化，鉴定阳性克隆。阳性克隆经测序其
长度为９０２ｂｐ。在其末端有一Ｐｏｌｙ（Ａ）结构，证明
３′端序列完整。
２．２．３　ＣｒＨＳＦ基因５′端序列的克隆　依据Ｃｌｏｎ－
ｔｅｃｈ公司的 Ｔｈｅ　ＳＭＡＲＴＴＭＲＡＣＥ 技术逆转录总
ＲＮＡ得到ｃＤＮＡ。然后根据中间片段序列设计一
个基因特异性引物（ＧＳＰ５）。用 ＧＳＰ５与通用引物
ＵＭＰ扩增，ＰＣＲ产物电泳显示在３５０ｂｐ附近有单
图２　ＣｒＨＳＦ　ｃＤＮＡ中间片段扩增结果
Ｆｉｇ．２　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ＣｒＨＳＦ　ｃＤＮＡ　ｆｒａｇｍｅｎｔ
注：泳道６，７，８为ＣｒＨＳＦ　ｃＤＮＡ片段，泳道 Ｍ为分子量标准（ＤＬ２０００）
Ｎｏｔｅ：Ｌａｎｅ　６，７，８ｉｎｄｉｃａｔｅｓ　ＣｒＨＳＦ　ｃＤＮＡ　ｆｒａｇｍｅｎｔ，Ｌａｎｅ　Ｍ　ｉｎｄｉｃａｔｅｓ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｒｋｅｒ（ＤＬ２０００）
２３０１
第６期 孙彦等：白颖苔草热激转录因子基因的克隆及其序列分析
图３　ＣｒＨＳＦ　３′－ＲＡＣＥ扩增的片断
Ｆｉｇ．３　３′－ＲＡＣＥ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ＣｒＨＳＦ
注：泳道１为ＣｒＨＳＦ　３′末端扩增片段，泳道 Ｍ 为分子量标准（ＤＬ２０００）
Ｎｏｔｅ：Ｌａｎｅ　１ｉｎｄｉｃａｔｅｓ　ｔｈｅ　３′ｅｎｄ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｏｆ　ＣｒＨＳＦ，
Ｌａｎｅ　Ｍ　ｉｎｄｉｃａｔｅｓ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｒｋｅｒ（ＤＬ２０００）
一条带（图４），与预计的目的带片段大小相符。回
收纯化ＰＣＲ产物，连接载体，转化，进行阳性克隆的
鉴定。阳性克隆经测序其长度为３２３ｂｐ。
图４　ＣｒＨＳＦ　５′－ＲＡＣＥ扩增的片断
Ｆｉｇ．４　５′－ＲＡＣＥ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ＣｒＨＳＦ
注：泳道１为ＣｒＨＳＦ　５′末端扩增片段，泳道 Ｍ 为分子量标准（ＤＬ２０００）
Ｎｏｔｅ：Ｌａｎｅ　１ｉｎｄｉｃａｔｅｓ　ｔｈｅ５′ｅｎｄ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｏｆ　ＣｒＨＳＦ，
Ｌａｎｅ　Ｍ　ｉｎｄｉｃａｔｅｓ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｒｋｅｒ（ＤＬ２０００）
２．２．４　ＣｒＨＳＦ 基因ｃＤＮＡ 全序列的获得　将３′
和５′端序列拼接，获得全长为１２２６ｂｐ的ＣｒＨＳＦ
基因ｃＤＮＡ，其含有一个完整的开放阅读框（１０３～
１０２３ｂｐ），编码３０６个氨基酸（图５），推测其分子量
为３４．９３ｋＤａ（ｐＩ＝５．７７）。
２．３　ＣｒＨＳＦ核苷酸序列同源性分析
ＣｒＨＳＦ核苷酸序列与ＯｓＨＳＦ的相似性最高，
与其他植物的热激转录因子碱基序列也有较强的同
源性，如大豆、拟南芥、烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ）、
玉米、番茄、花椰菜（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｏｌｅｒａｃｅａ　ｖａｒ．ｂｏｔｒｙ－
ｔｉｓ）、甜菜（Ｂｅｔａ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）、向日葵（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ　ａｎｎ－
ｕｕｓ）和紫花苜蓿等，但同源性最高的为禾本科植物，
如玉米和水稻，这反映了ＣｒＨＳＦ核苷酸序列的种
属特异性和密码子偏爱性。
２．４　ＣｒＨＳＦ蛋白序列分析
２．４．１　ＣｒＨＳＦ蛋白序列同源性分析　ＣｒＨＳＦ的
氨基酸序列与其他植物的热激转录因子有较强的同
源性，如拟南芥、烟草、番茄、大豆、玉米、水稻、紫花
苜蓿等（图６）。
２．４．２　ＣｒＨＳＦ 蛋白结构域分析　在ｈｔｔｐ：／／ｃａ．
ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／网站上用Ｓｃａｎ　ｐｒｏｓｉｔｅ程序对ＣｒＨＳＦ
编码蛋白的氨基酸序列进行分析。发现其含有一个
保守结构域（ＤＢＤ）。该ＤＢＤ为热激转录因子所共
有，表明ＣｒＨＳＦ蛋白属于热激转录因子。
２．４．３　ＣｒＨＳＦ蛋白疏水性分析　信号肽位于分泌
蛋白的Ｎ端，当蛋白跨膜转移位置时被切掉。信号
肽的特征是包括一个正电荷区域、一个疏水性区域
和不带电荷但具有极性的区域。使用ＳｉｇｎａｌＰ　２．０
版（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ－２．
０／）对ＣｒＨＳＦ 序列进行信号肽分析。用 ｍｅａｎ　Ｓ－
ｓｃｏｒｅ来判断是否为分泌蛋白，ＣｒＨＳＦ预测结果为
其不存在分泌蛋白的信号肽。
使用 ＴＭＨＭＭ 软件（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．
ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ／）对 ＣｒＨＳＦ跨膜区及膜内
外区进行整体的预测，结果显示ＣｒＨＳＦ不存在跨
膜区。结合信号肽分析以及跨膜区分析，结果发现
ＣｒＨＳＦ不存在信号肽以及跨膜区区域。即ＣｒＨＳＦ
不是膜蛋白，也不是分泌蛋白。
３　结论与后续研究
本试验通过ＤＮＡＭＡＮ 软件多重比较不同植
物来源的热激转录因子的氨基酸序列，找出保守区
域，根据保守区域设计简并引物，用简并引物扩增出
白颖苔草热激转录因子基因ｃＤＮＡ 的中间片段。
根据中间片段序列设计用于扩增５′端和３′端的特
异引物，通过ＲＡＣＥ法获得全长１２２６ｂｐ的ＣｒＨＳＦ
基因ｃＤＮＡ序列。其含有一个完整的开放阅读框
（１０３～１０２３ｂｐ），编码３０６个氨基酸，推测其分子量
为３４．９３ｋＤａ（ｐＩ＝５．７７）。同源性比较显示其与其
他植物热激转录因子具有高度的同源性。其中与水
稻同源性最高。具有典型的ＤＮＡ结合域，没有信
３３０１
草　地　学　报 第１９卷
图５　克隆的ＣｒＨＳＦ基因核苷酸序列及其编码的氨基酸序列
Ｆｉｇ．５　Ｄｅｄｕｃｅｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ＣｒＨＳＦ
号肽以及跨膜区域，含有１个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化
位点、３个Ｎ端酰基化位点、２个Ｎ端糖基化位点、３
个蛋白激酶Ｃ磷酸化位点和１个ｃＡＭＰ和ｃＧＭＰ
依赖的蛋白激酶磷酸化位点等翻译后的修饰作用位
点。
本试验所克隆的基因很可能是白颖苔草热激转
录因子基因，但需要进一步确认并对其功能进行分
析。首先构建ＣｒＨＳＦ真核表达载体；将ＣｒＨＳＦ基因
表达载体转化烟草，分析ＣｒＨＳＦ基因的转化以及基
因表达情况；分析ＣｒＨＳＦ基因对植物耐热性的影响。
参考文献
［１］　Ｚｈａｎｇ　Ｗ．Ｔｈｅ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋ　ｇｅｎｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ：
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Ｍｉｌｉｔａｒｉｓ　Ｔｅｒｔｉａｅ，２０００，２２（６）：３７２－３４３
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４３０１
第６期 孙彦等：白颖苔草热激转录因子基因的克隆及其序列分析
图６　ＣｒＨＳＦ的氨基酸序列分析
Ｆｉｇ．６　Ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＣｒＨＳＦ
注：ＣｒＨＳＦ与水稻等热激转录因子的同源性。所示基因编码蛋白在ＧｅｎＢａｎｋ或其他数据库中的登录号分别为：
Ｎｏｔｅ：Ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＣｒＨＳＦ　ｗｉｔｈ　ｏｔｈｅｒ　ｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｌｅａｓｅｄ　ｉｎ　ＧｅｎＢａｎｋ　ｏｒ　ｏｔｈｅｒ　ｄａｔａｂａｓｅｓ．
Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒｓ：
Ａｔ－ＨＳＦ６（ｒｅｆ｜ＮＰ＿１８８９２２．１｜），ＣｒＨＳＦ（ＥＦ５１４８９７），ＲＨＳＦ６（ｇｂ｜ＡＡＱ２３０６０．１），ＨＳＦ３０（ｅｍｂ｜ＣＡＡ４７８７０．１），ＢｏＨＳＦ（ｇｂ｜ＡＢＤ６５６２２．１），
ＧｍＨＳＦ８（ｇｂ｜ＡＡＳ１５８００．１），ＭｓＨＳＦ（ｇｂ｜ＡＢＪ０９０７４．１），ＬｐＨＳＦＡ３（ｇｂ｜ＡＡＦ７４５６３．１），ＢｖＨＳＦ（ｇｂ｜ＡＢＨ０８４３３．１），
ＨＨＳＦＡ９（ｇｂ｜ＡＡＭ４３８０４．１），ＮｔＨＳＦ（ｄｂｊ｜ＢＡＡ８３７１１．１）ａｎｄ　ＺｍＨＳＦ（ｅｍｂ｜ＣＡＡ５８１１７．１）
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ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　ｆｒｏｍ　Ｔａｘｕｓ　ｃｅｌｓ　ｗｉｔｈ　ｇｕａｎｉ－
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ｓｉｎｇｌｅ　ｇｅｎｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ［Ｊ］．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａ－
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ｔｅｒｍｉｎｉ　ｏｆ　ｃａｐｐｅｄ　ｖｉｒａｌ　ＲＮＡ　ｂｙ　５′－３′ｌｉｇａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ＰＣＲ［Ｊ］．Ｂｉｏ－
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ｅｎｄｓ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｕｌ　２ｌｅｎｇｔｈ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ＤＮＡｓ：
ｔｈｅｒｍａｌ　ＲＡＣＥ［Ｊ］．Ｍｅｔｈｏｄ　Ｅｎｚｙｍｏｌ，１９９３，２１８：３４０－３５６
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ｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　ＲＴ－ＰＣＲ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｃｈ，１９９４，２２（１０）：
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（责任编辑　李美娟）
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