全 文 ：第 17 卷 第 3 期
Vol. 17 No . 3
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2009 年 5 月
May 2009
新疆和陕西三叶草属根瘤菌 16S rDNA
多态性及系统发育研究
吕 飞, 蒋 欣 , 徐佳洁, 朱 博, 韦革宏*
(西北农林科技大学生命科学学院; 陕西省农业分子生物学重点实验室, 陕西杨陵 712100)
摘要:为阐明西北部分地区三叶草属( T r if o lium L . )根瘤菌遗传多样性及系统发育地位, 于 2007 年 12 月采用 16S
rDNA PCRRFLP与 16S rDNA 全序列分析, 对 50 株分离自新疆和陕西地区的三叶草属根瘤菌进行系统研究。结
果表明:所有供试菌株产生了 5 种 16S rDNA 基因型,归属于根瘤菌属( Rhiz obium)、土壤杆菌属( A grobacter ium)、
叶杆菌属(P hy llobacter ium) 3 个系统发育分支, 表现出较为丰富的共生固氮体系多态性。其中, CCNWXJ0140 在
系统发育树中与三叶草叶杆菌模式菌株 P . tr if olii PET P02关系较近, 序列相似性为 98. 9% ,也扩大了可与三叶
草形成共生关系的根瘤菌种类的范围。通过不同地区同一寄主的三叶草根瘤菌的比较,发现其共生关系因地理分
布不同而具有多样性,因此, 对于丰富三叶草根瘤菌资源及其开发利用具有重要意义。
关键词:三叶草; 根瘤菌;遗传多样性; 叶杆菌; 16S rDNA
中图分类号: S154. 381 文献标识码: A 文章编号: 10070435( 2009) 03030406
16S rDNA Polymorphism and Phylogeny of Rhizobia Isolated from Trif olium
in Xinjiang Uygur Autonomous Region and Shaanxi Province
LV Fei, JIANG Xin, XU Jiajie, ZHU Bo, WEI Gehong*
( College of Life Sciences, Shaanx i Key Laboratory of Molecular Biology for Agricul tu re, Northw est
A & F University, Yangling, Sh aanxi Provin ce 712100, C hina)
Abstract: L it tle information w as available about T ri f ol ium rhizobia f rom the northw estern China. In order
to investig ate the genet ic diversity of T ri f ol ium rhizobia in Xinjiang Uygur A utonomous Reg ion and
Shaanx i province, f ifty rhizobial st rains isolated f rom Tr if olium spp. w ere characterized based on 16S rD
NA PCRRFLP and sequencing analy sis. Five genetic pat ter ns of 16S rDNA were obtained and they be
longed to Rhiz obium, A grobacter ium, and Phy l lobacter ium thr ough sequencing analy sis of 16S rDNA,
w hich revealed that Tr i f olium rhizobia had a higher diversity. In the phylog enet ic t ree of 16S rDN A, CC
NWXJ0140 w as closely related to g enus Phy l lobacterium and shared 98. 9% sequence homology w ith
Phy llobacter ium tr if ol ii PETP02. Comparing w ith pr evious studies, it had ex tended rhizobial species as
sociated w ith T ri f ol ium spp. Further analysis show these rhizobia didn t have geographical specif icity e
ven if they w ere isolated from same host plant . T herefore, our study of T r if ol ium spp. symbionts is of
value to rhizobial resource enr ichment and application in ag ricultur e.
Key words: T ri f ol ium L. ; Rhizobia; Genet ic diversity; Phy l lobacter ium; 16S rDNA
根瘤菌 豆科植物的共生固氮体系是生物固氮
中固氮效率最高的体系之一, 每年固氮量占全球生
物固氮量的 65%以上,因此研究根瘤菌对自然界氮
素循环和环境可持续发展具有重要意义[ 1]。近年
来,随着现代分子生物学技术的发展和应用, 16S
rDNA 序列及其 RFLP 指纹图谱分析已成为系统分
类研究的最合适指标和手段, 并被广泛地应用于根
瘤菌的遗传特征和分子差异研究中 [ 2, 3]。
三叶草属( T ri f ol ium L. )是豆科草本植物, 广
泛分布于南北纬 25~ 63, 覆盖整个亚热带、温带和
亚寒带,年降水量超过 600 mm 的地区均有其自然
分布,是世界上最重要的牧草之一[ 4] 。它不仅具有
生长范围广、易于种植、便于管理等优点, 而且优越
的固氮性能、与禾本科牧草的良好组合生长能力,使
其对草地畜牧业的发展和维持草地生态系统的稳定
都具有极其重要的作用。目前, 国内外有关三叶草
收稿日期: 20081013;修回日期: 20090319
基金项目:国家自然科学基金( 30670372) ;科技部农业微生物菌种资源整理、整合及共享试点子项目( 2005DKA21201)
作者简介:吕飞( 1984 ) ,男,汉族,硕士研究生,研究方向为根瘤菌多样性, Email: dest inyl f@ yah oo. com. cn; * 通讯作者 Author for cor
respondence, Email: w eigehong@ yahoo. com. cn
第 3期 吕飞等:新疆和陕西三叶草属根瘤菌 16S rDNA 多态性及系统发育研究
属根瘤菌系统分类及多样性研究的报道较少。本研
究采用 16S rDNA PCRRFLP 和序列分析对分离
自我国新疆和陕西地区的三叶草属根瘤菌进行系统
分类及多样性研究,以初步确定三叶草属根瘤菌的
系统发育地位, 为更好地利用三叶草根瘤菌种质资
源提供科学的理论依据。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 供试菌株 2006年 7月对新疆和陕西部分
地区的三叶草根瘤菌进行资源收集。根瘤装入含有
硅胶的离心管, 带回室内, 先用无菌水洗涤后, 95%
表 1 供试菌株及其来源
T able 1 T ested strains and o rig in
菌株 St rain 寄主 H ost plan t 来源 Geographical origin
CCNWXJ0199, CCNWXJ016, CCNWXJ0144 白花三叶草 T . rep ens L. 新疆昭苏县 Zhaosu county, Xinj iang
( 8108128 , 4314417N)
CCNWXJ0160 紫叶三叶草 T . rep ens var. Pu rpurascens 新疆昭苏县 Zhaosu county, Xinj iang
( 8108128 , 4314417N)
CCNWXJ0140, CCNWXJ0163 草莓三叶草 T . f rag i f er um L. 新疆昭苏县 Zhaosu county, Xinj iang
( 8108128 , 4314417N)
CCNWXJ0156 五叶草 T . lup inaster L. 新疆昭苏县 Zhaosu county, Xinj iang
( 8108128 , 4314417N)
CCNWXJ0167 五叶草 T. lup inast er L. 新疆伊犁哈萨克 Ili Kazak, Xinjian g
( 8481193E, 4441494N)
CCNWXJ0150 白花三叶草 T . rep ens L. 新疆巩留县 Gon gliu county, Xinjiang
( 8223329E, 4335758N)
CCNWXJ0154 白花三叶草 T . rep ens L. 新疆库车县 Kuqa county, Xinjiang
( 8296333E, 4168441N)
CCNWXJ0176, CCNWXJ0155 白花三叶草 T . rep ens L. 新疆阿拉尔市 Alar city, Xinjiang
( 8041326E, 4031667N)
CCNWXJ0170 白花三叶草 T . rep ens L. 新疆民丰县 M infeng county, Xinjiang
( 8263257E, 3706545N)
CCNWXJ0187, CCNWXJ0136, CCNWXJ0190 白花三叶草 T . rep ens L. 新疆特克斯县 T ek es county, Xin jiang
( 8181698E, 4323936N)
CCNWXJ0188 红花三叶草 T . pr aten se L. 新疆特克斯县 T ek es county, Xin jiang
( 8181698E, 4323936N)
CCNWXJ0179, CCNWXJ0198, CCNWXJ0159, CC
NWXJ0185, CCNWXJ0169, CCNWXJ0143, CCNWXJ0138
五叶草 T . lup inaster L. 新疆阿勒泰市 Altay city, Xinjian g
( 8815329E, 4786373N)
CCNWXJ0153, CCNWXJ0168, CCNWXJ0200 紫叶三叶草 T . rep ens var. Pu rpurascens 新疆阿勒泰市 Altay city, Xinjian g
( 8815329E, 4786373N)
CCNWXJ0164, CCNWXJ0135 红花三叶草 T . pr aten se L. 新疆阿勒泰市 Altay city, Xinjian g
( 8815329E, 4786373N)
CCNWXJ0181, CCNWXJ0142, CCNWXJ0134,
CCNWXJ0139
白花三叶草 T . rep ens L. 新疆阿勒泰市 Altay city, Xinjian g
( 8815329E, 4786373N)
CCNWXJ0173, CCNWXJ0158 五叶草 T . lup inaster L. 新疆察布查尔县 Qabqal county, Xinjiang
( 8109914E, 4671632N)
CCNWXJ0161 红花三叶草 T . pr aten se L. 新疆察布查尔县 Qabqal county, Xinjiang
( 8109914E, 4671632N)
CCNWXJ0177, CCNWXJ0180 白花三叶草 T . rep ens L. 新疆察布查尔县 Qabqal county, Xinjiang
( 8109914E, 4671632N)
CCNWXJ0197 紫叶三叶草 T. repens var. Purpurascens 新疆察布查尔县 Qabqal county, Xinjiang
( 8109914E, 4671632N)
CCNWSX0858, CCNWSX0859, CCNWSX0860 白花三叶草 T . rep ens L. 陕西眉县 Mei coun ty, Shaanxi
( 10776264E, 3432314N)
CCNWSX0857, CCNWSX0856, CCNWSX0855 白花三叶草 T . rep ens L. 陕西户县 Hu coun ty, Shaanxi
( 10861254E, 3411667N)
CCNWSX0861, CCNWSX0862, CCNWSX0864,
CCNWSX0865, CCNWSX0863
白花三叶草 T . rep ens L. 陕西周至县 Zh ou zhi county, Shaan xi
( 10821562E, 3418348N)
酒精浸泡 30 s,再用 1 g / L 的升汞消毒 5 min, 然后 采用平板划线法分离、纯化菌株, 挑取单菌落,革兰
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草 地 学 报 第 17卷
氏染色,镜检, 斜面保藏[ 5]。本研究共分离得到 50
株菌,菌株编号、宿主植物名称及来源见表 1。
1. 1. 2 引物 来源于 E. coli 16S rDNA 序列保守
区域的 2个引物 P1 ( 5CGGGATCCAGAGT T T
GAT CCT GGCT CAGAACGAACGCT3) 和 P6
( 5CGGGA TCCTACGGCT ACCT T GT TACGAC
TT CACCCC3) ,分别对应于 E. col i 的第 8~ 37
碱基位置和第 1479~ 1506碱基位置[ 6]。
1. 2 菌体培养及总 DNA的提取
2007年 12月将活化的菌株接种于 TY 液体培
养基中,在 28 条件下, 150 r/ min震荡培养至对数
生长期, 8000 r/ m in 离心收集菌体, 然后依次用 10
mmo l/ L Tr isHCl洗涤 3次, 溶菌酶破壁,蛋白酶处
理, 酚/氯仿/异戊醇抽提, 乙醇沉淀等步骤提取
DNA,最后溶于双蒸水中[ 7]。
1. 3 16S rDNA PCR扩增
以总 DNA 为模板, P1和 P6 为引物进行 PCR
扩增。PCR扩增体系为: 0. 25 L 5 U/L T aq酶, 5
L 10 缓冲液, 4 L10 mmo l/ L dNTP, 3 L 25
mmo l/ L MgCl2 , 10 mol/ L P1 和 P6各 1 L, 2. 5
L 25 ng /L 模板DNA,加 ddH2O至 50 L。PCR
扩增条件为: 95 预变性 5 min; 94 变性 1 m in,
56 退 1 min, 72 延伸 2 min, 共 32个循环; 最后
72 再延伸 6 m in[ 8] , - 20 保存。扩增产物用 1%
的琼脂糖凝胶电泳检测。
1. 4 16S rDNARFLP分析
采用 SelenskaPobell的方法 [ 9] , 选用 4种限制
性内切酶 M sp 、H ae、H inf 和 H ha 分别酶
切。酶切反应体系均为 20 L, 其中 PCR产物 10
L,在 37 水浴中酶切 4 h 左右, 2%琼脂糖凝胶电
泳, EB染色, BioRad凝胶成像系统拍照。
1. 5 16S rDNA全序列测定及分析
根据 16S rDNARFLP 图谱分析结果, 选取每
种图谱类型组合中的代表菌株进行 16S rDNA全序
列测定,将测得的 16S rDNA 全序列与从 GenBank
( NCBI)中获得的根瘤菌已知种及相关种进行多重
序列比较,用 Clustal X[ 10] 和 Treeconw [ 11]程序进行
序列的编辑和分析,按照 Neighborjoining 法 [ 12] 构
建出以 16S rDNA 全序列为基础的系统分类树状
图。并用 DNAman软件计算出相关 16S rDNA 序
列间相似性。
2 结果与分析
2. 1 供试菌株 16S rDNA PCR扩增结果
以总 DNA 为模板, P1和 P6 为引物, 供试菌株
的 16S rDNA PCR产物均能在 1%琼脂糖凝胶电泳
检测出大约 1. 5 kb的条带。部分菌株的 16S rDNA
电泳图谱如图 1。
图 1 部分供试菌株的 16S rDNA PCR扩增产物电泳图谱
F ig . 1 Electrophor etog ram o f 16S rDNA PCR products
for pa rt of t ested strains
19. 为供试菌株编号; M . DNA marker13
19. th e serial num ber of the tested st rains; M . DNA mar ker13
2. 2 16S rDNARFLP分析
扩增产物分别用 4 种限制性内切酶( M sp 、
H ae、H inf 和 H ha ) 进行酶切, 经 2%琼脂糖
凝胶电泳后成像。供试根瘤菌的 Msp 和 H inf
酶切各有 4种图谱类型, H ae和 H ha 酶切各有
3种图谱类型(图 2)。电泳图谱上不同菌株间迁移
率相同的带被认为是同一个性状, 随机标记为 A
D。所有供试菌株的 16S rDN A 的 4种酶切图谱类
型共有 5 种不同组合类型 (表 2 ) , 其中 类型
( AAA A)有 15株菌, 类型( BBBB)有 8株菌, 类
型( BCCC)有 2株菌, 类型( CBBB)有 10株菌,
类型( DBDB)有 15株菌。由表 2可知, 红花三叶草
和五叶草根瘤菌的酶切图谱分别有 3 种不同类型
( 类型、类型、类型和 类型、类型、类
型) ,草莓三叶草根瘤菌的酶切图谱有 2种( 类型
和类型) , 紫叶三叶草根瘤菌的酶切图谱只有 1种
( 类型) ,而白花三叶草根瘤菌的酶切图谱 5种类
型都有。结果表明, 分离自三叶草的根瘤菌 16S
rDNARFLP 图谱存在一定差异。
2. 3 16S rDNA全序列相似性比较及系统分类分析
根据不同基因型的代表菌株与相关模式菌株的
16S rDNA 序列进行相似性比较, 构建出系统分类
树状图(图 3)。由图 3可知, 代表菌株分别归属于
根瘤菌属 ( Rhiz obium)、土壤杆菌属( A gr obacter i
um)、叶杆菌属( Phy l lobacterium)的系统分支上。
306
第 3期 吕飞等:新疆和陕西三叶草属根瘤菌 16S rDNA 多态性及系统发育研究
图 2 供试菌株 16S rDNARFLP 酶切组合图谱
F ig . 2 16S rDNARFLP rDNA types of fingerprint patterns
图中大写字母分别代表 4种限制性酶切图谱类型; M . DL 100 bp
Capital let ters in the f igure repres ent al l RFLP pat terns ; M . DL 100 bp
表 2 供试菌株的 16S rDNARFLP 图谱类型
Table 2 T he tested st rains and the types of 16S rDNARFLP fingerprint patterns
菌株
St rain
酶切图谱类型
16S rDNA RFLP pat tern
Msp H ae H inf H ha
16S rDNA 酶切
图谱类型组合
Combined pat tern
of 16S rDNA
CCNWXJ0199, CCNWXJ0197, CCNWXJ0179, CCNWXJ0153, A A A A ( AAAA)
CCNWXJ0180, CCNWXJ0168, CCNWXJ0160, CCNWXJ0164,
CCNWXJ0198, CCNWXJ0200, CCNWXJ0166, CCNWXJ0140,
CCNWXJ0167, CCNWXJ0135, CCNWXJ0150
CCNWXJ0181, CCNWXJ0188, CCNWX J0154, CCNWXJ0156, B B B B ( BBBB)
CCNWXJ0142, CCNWXJ0134, CCNWXJ0177, CCNWSX 0863
CCNWXJ0161, CCNWXJ0144 B C C C ( BCCC)
CCNWSX0855, CCNWSX0856, CCNWSX0857, CCNWSX0858, C B B B ( CBBB)
CCNWSX0859, CCNWSX0860, CCNWSX 0861, C CNWSX0862,
C CNWSX0864, CCNWSX0865
CCNWXJ0155, CCNWXJ0170, CCNWXJ0190, CCNWXJ0158, D B D B ( DBDB )
CCNWXJ0159, CCNWXJ0185, CCNWXJ0139, CCNWX J0169,
C CNWXJ0136, CCNWXJ0173, CCNWXJ0143, CCNWX J0138,
C CNWXJ0187, CCNWXJ0163, CCNWXJ0176
总数 Total 4 3 4 3 5
类型的代表菌株 CCNWXJ0188、类型的
代表菌株 CCNWXJ0161和类型的代表菌株 CC
NWSX0857与三叶草根瘤菌( R. t rifolii ARPV02)
的亲缘关系最近,序列相似性分别为99. 9%、100%、
99. 9% ,与豌豆根瘤菌( R . legum ino sarum USDA
2370)序列相似性分别为99. 7%、99. 8%和 99. 7%。
3个供试菌株与根瘤菌属内各已知种的模式菌株的
16S rDNA 全序列相似性最小, 为97. 1% ,但均大于
目前界定属内 16S rDNA 序列相似性 95% 的标
准[ 1 3] ,说明这 3 株菌所代表的 类型、类型和
类型共 20 株菌在系统分类上位于根瘤菌属分支。
但这 3株菌分离自新疆和陕西的不同地区,它们之
间的相似性均为 99. 9% ,都存在一个碱基的差异,
CCNWXJ0188和 CCNWXJ0161 都分离自同一寄
主红花三叶草, 但还是存在一个碱基的差异, CC
NWX J0188 和 CCNWSX0857 与三叶草根瘤菌
( Rhizobium trifoli i ARPV02)分别存在 1、2 个碱
基差异。说明来自不同地区同一寄主三叶草的根瘤
307
草 地 学 报 第 17卷
图 3 16S rDNA全序列系统分类树状图
F ig . 3 Phylogenetic tr ee based on the 16S rDNA gene sequences
分支上数字表示树形可信度,括号内为 GenBank登录号
T he num ber s on the b ranches s tand for the reliabilit ies, GenBank access ion numbers are show n in paren thes is
菌也存在一定差异。类型共 15株菌,其代表菌株
CCNWXJ0190 与 土 壤 杆 菌 ( A g. tumef aciens
LMG196) 序列相似性为 99. 3%, 与土壤杆菌属
( A grobacter ium)各菌株共同构成了一个小的发育
分支。类型的代表菌株 CCNWXJ0140与叶杆菌
属已知模式菌株 P. catacumbae CSC19 和 P. if
riqiyense STM370序列相似性分别为 99. 6%和 100%,
与三叶草叶杆菌模式菌株P. trif olii PETP02序列相
似性为 98. 9% , 因此以 CCNWXJ0140 为代表菌株
的 15株类型归属于叶杆菌属( Phy llobacterium)
的一个分支上。P . t ri f ol ii PETP02来源于西班牙
的三叶草, 是叶杆菌属的一个新种, CCNWXJ0140
与P . t ri f ol ii PET P02存在 15个碱基差异, 表明来
源于我国新疆的三叶草叶杆菌与 P. trif ol ii PETP02
在16S rDNA 序列上存在较大差异。
3 讨论
本研究对分离自我国新疆和陕西部分地区豆科
植物三叶草的根瘤菌进行了遗传多样性和系统发育
研究, 16S rDNA PCRRFLP 及其全序列测定分析
表明,分离自三叶草的根瘤菌仅在根瘤菌属、土壤杆
菌属、叶杆菌属上有所分布,与陈文新等[ 14] 分离自
三叶草的根瘤菌分别归属于快生根瘤菌属、中华根
瘤菌属、中慢生根瘤菌属和慢生根瘤菌属的研究结
果不一致,显示出其属、种在地区分布的局限性和专
一性,这可能与新疆和陕西所处的特殊地理位置和
环境有关。因为陈文新等 [ 14] 分离的根瘤菌主要来
自江西、湖北、云南、四川和浙江等省,自然生态条件
与西北地区差异明显。西北地区属干旱半干旱地
区,自然条件恶劣,降雨量少,土壤贫瘠,导致三叶草
308
第 3期 吕飞等:新疆和陕西三叶草属根瘤菌 16S rDNA 多态性及系统发育研究
在选择其共生根瘤菌时易受环境条件的影响, 限制
了共生根瘤菌属种范围, 例如许多研究发现, 实验室
条件下,豆科植物从土壤中更易捕获自然条件下很
难分离的根瘤菌;在交叉结瘤实验中, 根瘤菌 Rhi
z obium sp. NGR234可与 112属 232种豆科植物形
成共生固氮体系,虽然会产生 80多种不同的结瘤因
子,但识别过程仍受土壤环境的影响[ 15]。因此, 证
明了环境多样性影响寄主植物与共生细菌间共生关
系的多样性,而这种多样性在长期进化过程中即具
体生态环境下, 未必能够一直保持[ 16] 。
Mhamdi等[ 17] 用 gusA 基因标记从菜豆根瘤分
离得到的土壤杆菌, 通过一系列的结瘤试验证明: 土
壤杆菌不具备结瘤能力, 无法单独结瘤,但可存在于
豆科植物体内, 并在亲缘关系较近的根瘤菌协助下,
与根瘤菌共存于根瘤内。但其与根瘤菌共同定殖机
理,以及是否具有共生基因需做进一步研究。
叶杆菌是由 D. H .克内泽尔在 1984年发表的 1
属细菌。其表型性状与根瘤菌较相似, 特点是在紫
金牛科和茜草科中某些热带种的叶片上形成共生叶
瘤。目前, Angel Valverde等[ 18] 已证实叶杆菌能够
与羽扇豆共生结瘤。本研究发现叶杆菌在分离自我
国新疆的三叶草根瘤菌中也有分布,但与已发现的
三叶草叶杆菌 P. t ri f ol ii PETP02存在 15个碱基
的差异,而与分离自黄芪属的叶杆菌P . if riqiy ense
STM 370的 16S rDNA 序列相似度达 100%。目前
未见文献报道叶杆菌( P . i f r iqiy ense )的寄主范围
涉及三叶草,因此初步认为与三叶草共生的叶杆菌
CCNWXJ0140可能是叶杆菌 P . if r iqiy ense的一
个新生物型。本研究中的叶杆菌分离自三叶草属的
不同种(红花三叶草、白花三叶草、紫叶三叶草、草莓
三叶草和五叶草) ,表明叶杆菌与豆科植物之间的共
生结瘤关系非常复杂, 受到多种因素影响。而是否
与新疆所处的特殊地理位置和环境有关, 值得进一
步研究。因此, 需通过回接结瘤试验来验证叶杆菌
是否能与寄主共生结瘤, 还需通过对结瘤基因
( nod)和固氮基因( ni f )进行深入研究, 以此更深刻
地揭示三叶草属叶杆菌的遗传多样性。
4 结论
与新疆和陕西地区三叶草形成共生固氮体系的
根瘤菌,在系统分类上属于根瘤菌属、土壤杆菌属、
叶杆菌属,同时证明来自不同地区同一寄主的三叶
草根瘤菌在种内存在一定差异。
分离自我国新疆的三叶草叶杆菌 CCNWXJ0140
与三叶草叶杆菌 P . t ri f ol ii PET P02 存在较大差
异,分离自黄芪的叶杆菌 P. i f r iqiy ense STM 370
序列与前者相似性为 100%。
参考文献
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