全 文 ：植物科学学报　 ２０１５ꎬ ３３(４): ５５４~５６３
Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ
　 　 ＤＯＩ:１０􀆰 １１９１３ / ＰＳＪ􀆰 ２０９５－０８３７􀆰 ２０１５􀆰 ４０５５４
利用 ＳＳＲ荧光标记对野慈姑异交率的估测
李 婷１ꎬ 覃道凤１ꎬ 戴 璨１ꎬ２ꎬ３∗
(１. 湖北大学资源环境学院ꎬ 武汉 ４３００６２ꎻ ２. 湖北省生物资源绿色转化协同创新中心ꎬ 武汉 ４３００６２ꎻ
３. 区域开发与环境响应湖北省重点实验室ꎬ 武汉 ４３００６２)
摘　 要: 对自交亲和植物交配系统进行估测ꎬ 有利于了解植物的繁殖状态、 自异交进化的轨迹和特定种群的自然
历史或选择压力ꎮ 自交亲和的野慈姑有性繁殖和克隆繁殖并存ꎬ 且其花序内和无性系分株间存在雌雄花同时开
放的现象即给自交带来了机会ꎮ 本研究利用 ＳＳＲ标记估测野慈姑自然种群的异交水平ꎬ 并比较分析异交率估测
中荧光定量法的准确性和优势ꎬ 探讨野慈姑不同自然种群微卫星位点的多态性ꎮ 结果表明ꎬ 从 ２８对 ＳＳＲ引物中
筛选出 ３对多态性较高的引物ꎬ 其多种群水平的位点数分别是 ５、 ６、 ６ꎻ 对 １ 个自然种群的 ６ 棵植株共计 ３１ 个
果实的异交率进行估测ꎬ 其整体异交率为 ９２􀆰８７％ ± ２􀆰５％ꎬ 揭示了野慈姑自然种群的交配系统以异交为主ꎬ 且
无性繁殖对后代的贡献有限ꎻ 单引物水平下ꎬ 荧光定量技术检测出的多态性位点数和杂合率均高于 Ｎａｔｉｖｅ￣
ＰＡＧＥ成像电泳ꎬ 且其对异交率估测的结果也更准确ꎻ 另外ꎬ 从检测效率实验耗时和实验成本等方面综合分析ꎬ
本研究推荐使用荧光定量技术ꎮ
关键词: 野慈姑ꎻ 异交率ꎻ ＳＳＲ标记ꎻ 位点多态性ꎻ 荧光定量
中图分类号: Ｑ９４８􀆰１２＋２􀆰６　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ２０９５￣０８３７(２０１５)０４￣０５５４￣１０
　 　 　 收稿日期: ２０１５￣０５￣１１ꎬ 退修日期: ２０１５￣０６￣０９ꎮ
　 基金项目: 国家自然科学基金面上项目(３１２７０２７９)ꎻ 教育部留学回国人员科研启动基金ꎮ
　 作者简介: 李婷(１９９０－)ꎬ 女ꎬ 硕士研究生ꎬ 研究方向为植物地理学(Ｅ￣ｍａｉｌ: ３７８０４５７８９＠ｑｑ􀆰 ｃｏｍ)ꎮ
　 ∗通讯作者(Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ􀆰 Ｅ￣ｍａｉｌ: ｄａｉｃａｎ＠ｈｕｂｕ􀆰 ｅｄｕ􀆰 ｃｎ)ꎮ
Ａｎ Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｏｕｔｃｒｏｓｓｉｎｇ Ｒａｔｅ ｉｎ Ｓａｇｉｔｔａｒｉａ ｔｒｉｆｏｌｉａ
Ｕｓｉｎｇ ＳＳＲ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍａｒｋｅｒｓ
ＬＩ Ｔｉｎｇ１ꎬ ＱＩＮ Ｄａｏ￣Ｆｅｎｇ１ꎬ ＤＡＩ Ｃａｎ１ꎬ２ꎬ３∗
(１. Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ Ｈｕｂｅｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｗｕｈａｎ ４３００６２ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ
２. Ｈｕｂｅｉ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｇｒｅｅｎ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏ￣Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓꎬ Ｗｕｈａｎ ４３００６２ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ
３. Ｈｕｂｅｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅꎬ Ｗｕｈａｎ ４３００６２ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｔｈｅ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍｓ ｉｎ ｓｅｌｆ￣ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｐｌａｎｔｓ ｃａｎ ｈｅｌｐ ｕｓ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄ
ｔｈｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｐｌａｎｔｓꎬ ｔｈｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｔｒａｊｅｃｔｏｒｉｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｏｕｔｃｒｏｓｓｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｌｆｉｎｇꎬ
ａｎｄ ｔｈｅ ｎａｔｕｒａｌ ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ. Ｓａｇｉｔｔａｒｉａ ｔｒｉｆｏｌｉａ ｉｓ ａ ｓｅｌｆ￣
ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｓｐｅｃｉｅｓꎬ ｗｉｔｈ ｂｏｔｈ ｓｅｘｕａｌ ａｎｄ ｃｌｏｎａｌ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ. Ｍａｌｅ ａｎｄ ｆｅｍａｌｅ ｆｌｏｗｅｒｓ
ｓｏｍｅｔｉｍｅｓ ｃｏ￣ｂｌｏｏｍ ａｍｏｎｇ ａｎｄ ｗｉｔｈｉｎ ｉｎｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓꎬ ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ ｃｒｅａｔｉｎｇ ａ ｃｈａｎｃｅ ｏｆ
ｇｅｉｔｏｎｏｇａｍｙ. Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙꎬ ｗｅ ｕｓｅｄ ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ ｔｏ ｅｓｔｉｍａｔｅ ｔｈｅ ｏｕｔｃｒｏｓｓｉｎｇ ｒａｔｅ ｏｆ Ｓ. ｔｒｉｆｏｌｉａ
ｉｎ ｎａｔｕｒａｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ. Ｏｕｒ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｅｍｐｈａｓｉｚｅｄ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｌｏｃｉ ｉｎ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｈｉｇｈｌｉｇｈｔｅｄ ｔｈｅ ａｃｃｕｒａｃｙ ａｎｄ ａｄｖａｎｔａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ｏｆ
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ. Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ３ ｏｕｔ ｏｆ ２８ ｐｒｉｍｅｒ
ｐａｉｒｓ ｈａｄ ｈｉｇｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍꎬ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ａｌｌｅｌｅｓ ａｔ ５ꎬ ６ꎬ ａｎｄ ６ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ
ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ. Ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒｓꎬ ｗｅ ｅｓｔｉｍａｔｅｄ ｔｈｅ ｏｕｔｃｒｏｓｓｉｎｇ ｒａｔｅ
ｆｏｒ ３１ ｆｒｕｉｔｓ ｆｒｏｍ ｓｉｘ ｐｌａｎｔｓ ｉｎ ａ ｎａｔｕｒａｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓ. ｔｒｉｆｏｌｉａꎬ ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ９２􀆰８７％ ± ２􀆰５％. Ｏｕｒ
ｓｔｕｄｙ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍａｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｓ. ｔｒｉｆｏｌｉａ ｗａｓ ｐｒｅｄｏｍｉｎａｔｅｌｙ ｏｕｔｃｒｏｓｓｉｎｇ ｉｎ ｎａｔｕｒａｌ
ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎａｌ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ ｗａｓ ｖｅｒｙ ｌｉｍｉｔｅｄ. Ｗｅ ａｌｓｏ
ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｗｏ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ ｉｎ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓꎬ ｎａｍｅｌｙ Ｎａｔｉｖｅ￣ＰＡＧＥ
ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ. Ｔｈｅ ｌａｔｔｅｒ ｙｉｅｌｄｅｄ ａ ｈｉｇｈｅｒ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｎ ａｌｌｅｌｅ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍꎬ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ ａｎｄ ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ ａ ｍｏｒｅ ａｃｃｕｒａｔｅ ｏｕｔｃｒｏｓｓｉｎｇ ｒａｔｅ. Ａｆｔｅｒ
ｃｏｎｓｉｄｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｓｔꎬ ｍａｎｐｏｗｅｒ ａｎｄ ｔｉｍｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅｌｙꎬ ｗｅ ｒｅｃｏｍｍｅｎｄ ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ
ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｓａｇｉｔｔａｒｉａ ｔｒｉｆｏｌｉａꎻ Ｏｕｔｃｒｏｓｓｉｎｇ ｒａｔｅꎻ ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓꎻ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍꎻ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ
ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
　 　 植物的交配系统是指种群中个体之间的交配式
样ꎬ 即自交和异交状态的总和[１]ꎬ 归根结底也就
是谁和谁交配及其频率的问题[２]ꎮ 达尔文早就注
意到ꎬ 异交产生的种子相比自交产生的种子具有更
高的活力和生育力ꎮ 与异交后代相比ꎬ 自交后代由
于较高的基因纯合度导致有害性状的表达从而降低
了其自身的质量ꎬ 这种质量的降低被称为自交衰
退ꎮ 自交ꎬ 尤其是专性自交ꎬ 会降低种群的杂合率
和多样性ꎬ 导致其不能迅速适应环境的改变[３]ꎮ
而异交植物的后代通过不同基因的组合产生了遗传
变异ꎬ 在短期内就可能产生异交优势ꎻ 从长期效益
来看ꎬ 异交还能积累更高水平的遗传多样性ꎬ 为适
应性进化带来更大的可能ꎮ 但当植物由于种群密度
低下或缺少传粉者等导致外来花粉量不足时ꎬ 自交
可以提高植物的结实ꎬ 即产生繁殖保障效应( ｒｅ￣
ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｓｓｕｒａｎｃｅ)ꎮ 例如ꎬ 当传粉者稀少时ꎬ
倒挂金钟属(Ｆｕｃｈｓｉａ)有些植物的花丝在开花后期
会一直生长ꎬ 直至和花柱等长并使雄蕊能够与柱头
接触产生自交[４]ꎮ 自交之利便是异交之弊ꎬ 两方
面选择压力的存在常常导致最适应的是权衡自交和
异交的混合交配系统ꎬ 如 Ｉｐｏｍｏｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ 的异
交率为 ６０％ ~ ８０％ꎬ 其花药与柱头间的距离(ａｎ￣
ｔｈｅｒ ｓｔｉｇｍａ ｄｉｓｔａｎｃｅꎬ ＡＳＤ)是影响自、 异交比率
的主要因素[５]ꎮ 现代繁殖生态学中交配系统的定
量测定已经成为相对独立的研究内容ꎬ 其相关的理
论、 方法和实践手段日益完善与成熟[６－１０]ꎬ 其中
自交和异交之间的相互演化也是系统发育检测的重
点[１１]ꎮ 多数被子植物都产生完全花(既有雄蕊又有
雌蕊)ꎬ 并且大多是自交亲和的ꎬ 因而是潜在的自
交者[１２－１４]ꎮ 对自交亲和物种的异交率进行估测能
够体现植物的繁殖状态、 自异交进化的轨迹和特定
种群的自然历史或选择压力ꎮ
野慈姑(Ｓａｇｉｔｔａｒｉａ ｔｒｉｆｏｌｉａ Ｌ.)是一种自交亲和、
雌雄异花同株的草本植物ꎬ 常见于水田及池塘
边[１５]ꎮ 野慈姑有性繁殖和克隆繁殖并存ꎬ 其单花
期为 １ ｄ左右ꎬ 花序基部为雌花ꎬ 上部为雄花ꎻ 侧
生花序的基部也可产生少数雌花ꎬ 上部均为雄花ꎮ
花序为由下而上顺次开放ꎬ 故雌花先于雄花开放ꎬ
且雌花在 １ ~ ２ ｄ内开放完毕ꎬ 然后雄花开放ꎮ 雌
雄花的开放表现为既有异时也有异位ꎬ 即雌雄功能
的隔离能很好的避免自交ꎬ 理论上野慈姑的异交率
应该趋近于 １００％ꎮ 然而ꎬ 自然状态下野慈姑的无
性繁殖能力也较强ꎬ 可通过地下茎或以球茎增殖的
方式形成新的个体ꎬ 因此就可能存在无性系分株之
间的传粉ꎬ 从而造成一定比例的自交ꎻ 此外ꎬ 在野
外观察中发现野慈姑同一花序上存在雌雄花同时开
放和同一植株上存在不同花序的雌雄花同时开放的
情况ꎬ 经过昆虫的随机访问也会产生自交的机会ꎮ
那么ꎬ 在野慈姑自然种群中是否存在一定程度的自
交或野慈姑交配系统中整体的异交水平如何ꎬ 是本
研究力图回答的两个科学问题ꎮ
微卫星(ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ)标记是由 ２ ~ ５ 个核
苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的重复
序列ꎬ 又称简单重复序列标记(ＳＳＲ)ꎮ 微卫星中
重复单位的数目是高度变异的ꎬ 且具有长度多态
性ꎬ 可用 ＰＣＲ (Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ)方法
检测[１６]ꎮ 微卫星标记广泛应用于遗传多样性和交
配系统的估测中[１７－２３]ꎬ 也被认为是目前最有效的
分子标记之一[２４]ꎮ 前期常用的检测异交率的分子
标记中ꎬ 同工酶标记[２５－２７]仅能反映编码区序列ꎬ
酶位点稀少ꎬ 检测率低ꎻ ＲＡＰＤ[２８－３１]为显性分子标
记ꎬ 不能鉴别杂合子ꎬ 从扩增的条带中很难鉴别
自、 异交个体ꎮ 而 ＳＳＲ 重复单位数量极多ꎬ 遍及
整个基因组ꎬ 能反映编码区和非编码区核苷酸遗传
变异ꎬ 具有较高的多态性[３２－３６]ꎻ 同时ꎬ ＳＳＲ 为共
显性标记ꎬ 能直接判断基因型且检出等位基因的灵
５５５　 第 ４期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 李 婷等: 利用 ＳＳＲ荧光标记对野慈姑异交率的估测
敏性高、 多态性好ꎮ
利用微卫星标记和 ＰＣＲ技术扩增的 ＤＮＡ片段
常用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Ｎａｔｉｖｅ￣ＰＡＧＥ)成
像分析ꎬ 但在 Ｎａｔｉｖｅ￣ＰＡＧＥ 实验操作过程中易产
生二次误差ꎬ 如存在结胶程度的差别、 电压不稳等
不可控因素、 凝胶成像效果差异、 读图个体差异
等ꎬ 最终会导致电泳条带统计结果的不同和分析误
差[３７]ꎮ 近年来发展起来的荧光定量法可以完全克
服 Ｎａｔｉｖｅ￣ＰＡＧＥ检测存在的这些缺陷ꎬ 微卫星位
点经荧光标记 ＰＣＲ 扩增再经遗传分析仪毛细管电
泳进行基因组扫描ꎬ 并利用 ｇｅｎｅｍａｐｐｅｒ 软件对
ＰＣＲ产物的大小和荧光信号的强弱进行图像收集
和分析ꎮ 荧光定量法在植物异交率估测方面已有应
用ꎬ 如 Ｒｅｕｓｃｈ[３８]利用微卫星标记的荧光定量技术
对浅海潮间带植物 Ｚｏｓｔｅｒａ ｍａｒｉｎａ 进行异交率估
测的结果显示ꎬ 该种的异交水平为 ９７％ꎬ 证明其
是以异交为主的植物ꎮ 鉴于荧光定量法的成本目前
比较高ꎬ 本研究拟用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳成
像和荧光定量两种方法估测野慈姑自然种群 ＳＳＲ
位点多态性和异交率ꎬ 并根据数据分析结果、 工作
量、 实验成本等比较两种方法的优劣ꎬ 以期为后续
植物亲系研究提供技术参考ꎮ
１　 材料与方法
１􀆰 １　 实验材料及处理
用于 ＳＳＲ引物筛选和微卫星位点多态性估测
的野慈姑自然种群材料详见表 １ꎮ ２０１３ 年 ７ 月ꎬ
根据每个自然种群大小确定取样株数ꎬ 同时为了避
免采集到克隆株ꎬ 样本之间的采集距离控制在
１０ ｍ 左右ꎻ 将采自湖北省内 ２２ 个自然种群的 ９７
株野慈姑栽植在中国科学院武汉植物园同质园内ꎬ
３个月后共存活 ９４ 株ꎻ 采集每一株野慈姑的新鲜
叶片ꎬ 分别放入置有干燥剂(变色硅胶)的取样袋
中干燥、 备用ꎮ
表 １　 湖北省野慈姑的采样分布信息
Ｔａｂｌｅ １　 Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｎａｔｕｒａｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｓａｇｉｔｔａｒｉａ ｔｒｉｆｏｌｉａ ｉｎ Ｈｕｂｅｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ
采集地点
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ
种群名称
Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ
经纬度
Ｌａｔｉｔｕｄｅ ａｎｄ ｌｏｎｇｉｔｕｄｅ
采集数量
Ｓａｍｐｌｅ Ｎｏ.
种群规模
Ａｂｕｎｄａｎｃｅ
(Ａｐｐｒｌ.)
蕲春沙径村 ＱＣＡ ３０°０′３７.５７″ Ｎꎬ １１５°２３′３６.２８″ Ｅ １ １
蕲春赤东镇 ＱＣＢ ３０°０４′１０.９２″ Ｎꎬ １１５°２１′５８.２８″ Ｅ １６ ８００
武穴大法寺镇 ＷＸＡ ２９°５５′５４.００″ Ｎꎬ １１５°０２′１３.５２″ Ｅ ４ ８００
阳新县马鞍山 ＹＸＡ ２９°５３′５２.３０″ Ｎꎬ １１５°２３′３６.５０″ Ｅ １ ２００
阳新县碧山村 ＹＸＢ ２９°５６′０２.８７″ Ｎꎬ １１５°１８′５３.０９″ Ｅ ５ １０００
阳新县仙岛湖 ＹＸＣ ２９°４８′０６.２１″ Ｎꎬ １１４°４９′３８.５１″ Ｅ ３ ４００
浠水县策湖 ＸＳＡ ３０°１５′０.４０″ Ｎꎬ １１５°０８′３７.７８″ Ｅ １ １０
鄂州市花马湖 ＥＺＡ ３０°１７′０２.１２″ Ｎꎬ １１５°０２′２８.１０″ Ｅ ３ ４００
鄂州永华村 ＥＺＢ ３０°１７′０２.０６″ Ｎꎬ １１４°５９′０７.８５″ Ｅ ４ ７００
鄂州三山湖 ＥＺＣ ３０°２１′４６.５３″ Ｎꎬ １１４°４４′１９.５５″ Ｅ ２ ５００
鄂州沅湾村 ＥＺＤ ３０°１７′３８.０７″ Ｎꎬ １１５°０１′３１.０５″ Ｅ ５ ５００
武汉江夏涨渡湖 ＷＨＡ ３０°３６′３８.０１″ Ｎꎬ １１４°４２′０７.３０″ Ｅ １１ ６００
武汉江夏蔡白湖 ＷＨＢ ３０°１１′５３.８５″ Ｎꎬ １１４°１６′３０.８９″ Ｅ ４ ３００
武汉蔡甸余门村 ＷＨＣ ３０°２９′０７.７０″ Ｎꎬ １１３°５０′１８.２９″ Ｅ ３ ２００
武汉蔡甸丁湾村 ＷＨＤ ３０°３３′３６.５９″ Ｎꎬ １１３°５６′０５.１３″ Ｅ ３ ３００
武汉蔡甸汉蔡高速 ＷＨＥ ３０°３３′２９.４５″ Ｎꎬ １１４°０３′３４.８８″ Ｅ ３ ４００
武汉蔡甸官莲湖 ＷＨＦ ３０°２３′１４.５５″ Ｎꎬ １１４°０３′５６.６３″ Ｅ ３ ６００
荆州旧口镇 ＪＺＡ ３０°５２′６２.００″ Ｎꎬ １１２°３８′６２.００″ Ｅ ５ ６００
荆州后港镇 ＪＺＢ ３０°３２′２３.９９″ Ｎꎬ １１２°２２′４０.１０″ Ｅ ５ ２００
荆州后港镇 ＪＺＣ ３０°３１′４４.９１″ Ｎꎬ １１２°２２′１０.１０″ Ｅ ５ １５００
荆州十里铺镇 ＪＺＤ ３０°３６′２５.７４″ Ｎꎬ １１２°２１′２９.３６″ Ｅ ５ ２００
荆门雁门口镇 ＪＭＡ ３０°４９′４１.５７″ Ｎꎬ １１２°５０′１３.９２″ Ｅ ５ ４００
６５５ 植 物 科 学 学 报 第 ３３卷　
　 　 用于估测野慈姑自然种群异交水平的植株叶
片(母本)和果实(子代)取自湖北省沙洋县后港镇
泥塘(３０°３１′４４􀆰９１″Ｎꎬ １１２°２２′１０􀆰１０″Ｅ)ꎮ 其野
慈姑种群规模约 １５００ 株ꎬ ２０１３ 年 ７ 月中旬从中
随机选取 ６棵野慈姑的 ３１ 个果实ꎬ 顺次取下果实
并按图 １编号装袋ꎬ 同时取植株叶片放入置有变色
硅胶的取样袋中干燥即母本样本ꎮ 将取回的果实均
匀铺开放入 ４５℃烘箱灭菌 ４ ｈꎬ 然后随机取出若干
种子放入加水的烧杯中ꎬ 并置于人工气候箱(新苗
ＱＨＸ￣２５０ＢＳ￣Ⅲꎬ 上海新苗医疗器械制造有限公
司)中催芽ꎮ 气候箱的温度设定为 ３３℃ꎬ 光照强度
为 ３５００ ｌｘꎬ 光周期 １８ ｈ光照 / ６ ｈ黑暗ꎮ 每天观察
并确保所有种子浸泡在水中ꎬ 必要时加水和换水ꎮ
待新芽长出后ꎬ 于每个烧杯中随机取 ２０ 种芽ꎬ 进
行野慈姑母本干燥叶片和子代种芽 ＤＮＡ的提取ꎮ
7
6
5
4
3
2
9
9
8
8 1
图 １　 野慈姑的花序示意图和花朵顺次编号
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｉｎｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ
ｏｆ ｆｒｕｉｔｓ ｉｎ Ｓａｇｉｔｔａｒｉａ ｔｒｉｆｏｌｉａ
１􀆰 ２　 基因组 ＤＮＡ提取
选用康为世纪植物基因组 ＤＮＡ 提取试剂盒
(型号为 ＣＷ０５５３)提取野慈姑干燥叶片及子代种
芽的基因组 ＤＮＡꎮ 由于种芽组织较小不利于基因
组 ＤＮＡ的提取ꎬ 我们对野慈姑子代种芽 ＤＮＡ 提
取的 ４个中间步骤进行了改良: (１)将液氮研磨后
的粉末收集到离心管(自备)中ꎬ 加入 ７００ μＬ ６５℃
预热的 Ｂｕｆｆｅｒ ＧＰ１ꎬ 迅速颠倒混匀后置于 ６５℃水
浴 ４０ ｍｉｎꎬ 因为水浴时间越长ꎬ 裂解液将叶片组
织裂解的更加充分ꎻ (２)将吸附柱置于一个新的离
心管(自备)中ꎬ 并向吸附柱的中间部位悬空加入
５０ ~ １００ μＬ 灭菌水ꎬ 本实验灭菌水的最适量为
７５ μＬꎬ 因为此条件下所提取的 ＤＮＡ浓度均在相对
适中的范围内ꎻ (３)在加入灭菌水离心之前室温放
置时间 ≥ ５ ｍｉｎꎬ 尽量让无水乙醇挥发干净ꎬ 从而
使检测出的 ＤＮＡ条带较为清晰ꎻ (４)１０ ０００ ｒ / ｍｉｎ
离心 １ ｍｉｎ得到 ＤＮＡ 原液后ꎬ 再将其重新吸入到
离心管的吸附柱内并 １０ ０００ ｒ / ｍｉｎ离心 １ ｍｉｎꎬ 因
为子代种芽组织较小ꎬ 重复吸附及离心能提高子代
ＤＮＡ的浓度ꎮ
本实验提取的野慈姑干燥叶片及子代种芽基因
组 ＤＮＡ的质量经 １􀆰５％琼脂糖凝胶电泳检测发现ꎬ
目标条带明亮、 清晰ꎬ 无杂带、 无拖尾现象ꎻ 浓度
经紫外分光光度计测定ꎬ 其 ＯＤ２６０ / ＯＤ２８０的比值介
于 １􀆰８ ~ １􀆰９之间ꎬ 纯度较好ꎮ 野慈姑基因组 ＤＮＡ
浓度为: 干燥叶片均值 ４００ ｎｇ / μＬꎬ 子代种芽均值
２００ ｎｇ / μＬꎮ
１􀆰 ３　 ＳＳＲ引物筛选及 ＰＣＲ反应扩增体系
本实验所用 ＳＳＲ 引物选自 Ｗｕ 等[３９]从野慈姑
( Ｓ􀆰 ｔｒｉｆｏｌｉａ ) 和 Ｙａｋｉｍｏｗｓｋｉ 等[４０] 从 美 洲 慈 姑
(Ｓ􀆰 ｌａｔｉｆｏｌｉａ)中开发的共计 ２８ 对微卫星引物序列ꎬ
并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成ꎮ 以
１０份干燥叶片 ＤＮＡ 为模板ꎬ 采用合成的 ２８ 对引
物进行 ＰＣＲ扩增ꎬ 共筛选出能扩增出清晰的特异
性谱带的 ８对 ＳＳＲ引物(表 ２)ꎮ
ＰＣＲ反应体系为２５ μＬꎬ 主要包含 １ μＬ ４０ ｎｇ/ μＬ
模版 ＤＮＡ、 ２􀆰５ μＬ ｂｕｆｆｅｒ、 ０􀆰５ μＬ ｄＮＴＰｓ、 ＳＳＲ正
反引物各 ０􀆰３ μＬ、 ０􀆰２５ μＬ Ｔａｑ ＤＮＡ 酶、 ２０􀆰１５ μＬ
Ｈ２Ｏꎮ ＤＮＡ片段扩增在 ＰＣＲ 扩增仪(东胜)上进
行ꎬ 反应程序设置为: ９４℃ 预变性 ５ ｍｉｎꎻ ９５℃
变性 ４０ ｓꎬ ５１ ~ ６２℃退火 ４５ ｓꎬ ７２℃延伸 ４０ ｓꎬ
３０个循环ꎻ 最后 ７２℃ 延伸 ７ ｍｉｎꎮ
１􀆰 ４　 ＳＳＲ引物位点多态性
利用筛选出的 ８ 对 ＳＳＲ 引物对采自湖北省内
多个地区的 ９４株野慈姑基因组 ＤＮＡ 进行 ＰＣＲ 扩
增ꎬ 并经 １０％非变性聚丙烯酰胺电泳后放入凝胶
成像系统拍照、 保存ꎮ 电泳条件为: ２２０ Ｖ 恒压ꎻ
预电泳 ０􀆰５ ｈ后上样ꎬ 每孔 ６ μＬ 扩增产物加 ２ μＬ
花青素混合上样ꎻ 电泳 ４ ｈꎮ
７５５　 第 ４期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 李 婷等: 利用 ＳＳＲ荧光标记对野慈姑异交率的估测
表 ２　 野慈姑 ８对 ＳＳＲ引物序列及适宜的退火温度
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｏｒ ｅｉｇｈｔ ｐａｉｒｓ ｏｆ ＳＳＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ｉｎ Ｓａｇｉｔｔａｒｉａ ｔｒｉｆｏｌｉａ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
位点
Ｌｏｃｕｓ
ＳＳＲ引物序列(５ ′– ３′)
ＳＳＲ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
退火温度(℃)
Ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
引物来源
Ｐｒｉｍｅｒ ｓｏｕｒｃｅ
Ｎｏ.１４ Ｆ: ＧＣＡＣＡＴＧＣＧＡＧＡＧＴＴＴＴＣＡＡＲ: ＴＣＣＣＡＣＡＣＴＧＡＧＡＴＧＧＴＡＡＧＡ ５６ Ｗｕ ｅｔ ａｌ.
[３９]
Ｎｏ.１９ Ｆ: ＣＣＴＡＡＣＴＧＧＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＴＲ: ＣＴＧＣＣＣＣＴＴＴＣＴＴＣＡＡＣＣＴＣ ５６ Ｗｕ ｅｔ ａｌ.
[３９]
Ｎｏ.２４ Ｆ: ＧＡＡＣＧＴＴＧＧＧＣＴＴＴＧＴＴＣＡＴＲ: ＡＧＡＡＴＧＴＧＴＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧ ５６ Ｗｕ ｅｔ ａｌ.
[３９]
Ｎｏ.２５ Ｆ: ＡＡＧＡＣＣＧＴＴＴＴＣＧＧＧＴＣＴＴＣＲ: ＡＴＣＡＡＴＣＣＡＣＡＡＴＣＧＧＧＡＡＡ ５３ Ｗｕ ｅｔ ａｌ.
[３９]
Ｎｏ.３３ Ｆ: ＡＧＡＴＴＧＡＣＣＧＧＣＴＡＡＴＣＣＡＡＲ: ＧＡＧＣＧＣＣＧＡＧＧＴＡＣＡＡＧＴＡＧ ５５ Ｗｕ ｅｔ ａｌ.
[３９]
Ｎｏ.３９ Ｆ: ＡＣＣＡＴＧＡＣＡＴＣＣＣＡＣＡＣＡＧＡＲ: ＴＧＧＴＧＴＡＧＴＡＧＴＣＴＡＴＧＴＣＡＡＡＧＧＡ ５５ Ｗｕ ｅｔ ａｌ.
[３９]
Ｎｏ.２３ Ｆ: ＡＧＡＴＴＧＡＣＣＧＧＣＴＡＡＴＣＣＡＡＲ: ＧＡＧＣＧＣＣＧＡＧＧＴＡＣＡＡＧＴＡＧ ５９ Ｗｕ ｅｔ ａｌ.
[３９]
Ｎｏ.０５ Ｆ: ＡＣＡＴＧＡＣＡＡＴＴＧＣＣＡＣＡＡＣＧＲ: ＡＣＴＣＣＡＴＧＴＧＣＣＴＧＴＴＣＣＡＴ ５７ Ｗｕ ｅｔ ａｌ.
[３９]
　 　 因样本量太小不具有代表性ꎬ 我们首先根据野
慈姑自然种群规模的大小ꎬ 剔除了样本量小于 ５个
的居群ꎻ 同时ꎬ 为了统计每个自然种群的位点多态
性ꎬ 也为了挑选多样性高的引物作异交率估测ꎬ 需
确定 ９４株野慈姑的基因型ꎮ 其方法是: 根据图 ２
画出 ４ 个标准值位点ꎬ 自上而下分别标为 Ａ、 Ｂ、
Ｃ、 Ｄꎻ 若仅出现一个标准位点记做 ＡＡ、 ＢＢ、 ＣＣ
或 ＤＤ的纯合体ꎬ 反之记作不同组合的杂合体ꎬ 而
无法统计的类型用“􀅰”代替ꎮ ９４株野慈姑的基因型
确定后ꎬ 分别计算居群内每个引物的杂合率(即杂
合体植株数量 /能够分辨基因型的植株总数)和位
点数(即标准位点的总数)ꎬ 以及 ２２ 个种群的整体
杂合率和位点数ꎮ
１􀆰 ５　 异交率的统计
对 Ｎａｔｉｖｅ￣ＰＡＧＥ 成像结果的统计是根据凝胶
电泳成像中谱带的显示ꎬ 并对比图片中子代与母本
的条带ꎬ 若子代出现唯一非母本带ꎬ 记作异交ꎬ 反
之记作自交ꎮ 例如ꎬ 图 ３ 显示的 ２０ 个子代中ꎬ １０
和 １４为异交后代ꎬ 其余为自交ꎮ 多引物结果的综
合依据是只要有一个引物给出异交即为异交ꎮ
对荧光定量结果的统计方法是将出现非母本扩
增带的个体记作异交个体ꎮ 例如ꎬ 图 ４显示的野慈
姑母本 ＤＮＡ 扩增条带大小为 １７７ 和 １８３ꎬ 而子代
ＤＮＡ扩增条带大小为 １７７ 和 １８７ꎬ 即子代中出现
了非母本条带 １８７ꎬ 则该子代记作异交ꎮ
此外ꎬ我们还对同一ＰＣＲ扩增产物进行２种
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
A
B
C
D
图 ２　 ＳＳＲ引物对 ２２株野慈姑叶片 ＤＮＡ的 ＰＣＲ扩增片段
Ｆｉｇ􀆰 ２　 ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ ２２ ＤＮＡ ｓａｍｐｌｅｓ ｏｆ Ｓａｇｉｔｔａｒｉａ ｔｒｉｆｏｌｉａ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＳＳＲ ｐｒｉｍｅｒ
８５５ 植 物 科 学 学 报 第 ３３卷　
!" 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
图 ３　 野慈姑 ＱＣＢ居群 １个母本和 ２０个子代在 ２５号 ＳＳＲ引物位点的扩增结果
Ｆｉｇ􀆰 ３　 ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ａｔ Ｎｏ. ２５ ｌｏｃｕｓ ｏｆ ａ ｍｏｔｈｅｒ ａｎｄ ２０ ｐｒｏｇｅｎｉｅｓ ｉｎ ａ
Ｓａｇｉｔｔａｒｉａ ｔｒｉｆｏｌｉａ ｐｌａｎｔ ｆｒｏｍ ＱＣＢ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ
30000
30000
25000
25000
20000
20000
15000
15000
10000
10000
5000
5000
0
0
168
168
180
180
192
192
204
204
216
216
228
228
!" Mother
#$ Offspring
图 ４　 野慈姑ＷＨＦ居群 １个母本和 １个子代在 ２５号 ＳＳＲ引物位点上扩增条带的定量分析
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｅｓ ａｔ Ｎｏ􀆰 ２５ ｌｏｃｕｓ ｏｆ ａ ｍｏｔｈｅｒ ａｎｄ
ｐｒｏｇｅｎｙ ｉｎ ａ Ｓａｇｉｔｔａｒｉａ ｔｒｉｆｏｌｉａ ｐｌａｎｔ ｆｒｏｍ ＷＨＦ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ
方法(Ｎａｔｉｖｅ￣ＰＡＧＥ 和荧光定量)检测ꎬ 并从单引
物水平上对位点多态性和杂合率进行统计比较ꎮ
１􀆰 ７　 数据统计
采用逻辑斯蒂回归对野慈姑主、 侧枝异交率进
行比较ꎬ 其中响应变量是每个子代的自交或者异交
属性ꎬ 固定的变异来源( ｆｉｘｅｄ ｅｆｆｅｃｔ)是果实主、
侧枝的位置ꎬ 另一个随机的变异来源 ( ｒａｎｄｏｍ
ｅｆｆｅｃｔ)是嵌套在位置下的每个果实ꎮ 采用简单回
归对野慈姑顺次结实的异交率进行趋势分析ꎮ 另
外ꎬ 比较 Ｎａｔｉｖｅ￣ＰＡＧＥ 成像和荧光定量两种方法
的优劣时ꎬ 重点分析每个引物对应的子代自异交结
果的一致性ꎬ 如果一致记为“０”ꎬ 不一致记为“１”ꎮ
由于荧光定量检测的结果更加准确可靠ꎬ 我们还对
一致性数据与“０”进行单样本 Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ检测ꎮ
２　 结果与分析
２􀆰 １　 野慈姑微卫星引物的筛选和位点多态性
根据已确定的野慈姑基因型ꎬ 对野慈姑不同居
群的位点多态性进行了统计(表 ３)ꎮ 对 ８ 对 ＳＳＲ
引物在不同居群中的 ＰＣＲ扩增产物进行了 Ｎａｔｉｖｅ￣
ＰＡＧＥ成像检测ꎬ 发现 ５号、 ２３号、 １９ 号、 ３３ 号
引物扩增的背景清晰度不高且杂带多ꎬ 故剔除这些
引物ꎻ 根据杂合基因型出现频率统计杂合率ꎬ 显示
３９号 ＳＳＲ引物的杂合度最低(表 ３)ꎬ 遂将其剔除ꎻ
９５５　 第 ４期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 李 婷等: 利用 ＳＳＲ荧光标记对野慈姑异交率的估测
表 ３　 野慈姑不同居群的微卫星位点多态性
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｌｏｃｉ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｓａｇｉｔｔａｒｉａ ｔｒｉｆｏｌｉａ
种群
Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ
Ｌｏｃｕｓ Ｎｏ. １４ Ｌｏｃｕｓ Ｎｏ. ２４ Ｌｏｃｕｓ Ｎｏ. ２５ Ｌｏｃｕｓ Ｎｏ. ３９
位点数 Ａ 杂合率 Ｈｏ 位点数 Ａ 杂合率 Ｈｏ 位点数 Ａ 杂合率 Ｈｏ 位点数 Ａ 杂合率 Ｈｏ
ＱＣＢ ４ ０.３１ ５ ０.００ ５ ０.００ ２ ０.００
ＥＺＤ １ ０.８０ ３ ０.２０ ３ ０.４０ ２ ０.８０
ＷＨＡ ４ ０.１０ ４ ０.１０ ３ ０.６４ ２ ０.００
ＪＺＡ ２ ０.００ ４ ０.１７ ４ ０.６７ １ ０.００
ＪＺＢ ２ ０.００ ２ ０.００ ２ １.００ １ ０.００
ＪＺＣ ２ ０.００ ３ ０.２０ ５ ０.８０ １ ０.００
ＪＺＤ ２ ０.００ ４ ０.２０ ２ ０.８０ １ ０.００
ＪＭＡ １ ０.００ ２ ０.８０ ２ ０.８０ １ ０.００
Ａｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ５ ０.２６ ６ ０.２６ ６ ０.６７ ３ ０.１１
　 　 注: 种群名称的字母缩写同表 １ꎻ Ａ: 检测到的等位基因数ꎻ Ｈｏ: 杂合率ꎮ
Ｎｏｔｅｓ: Ｎａｍｅ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｉｓ ｔｈｅ ｓａｍｅ ａｓ Ｔａｂｌｅ １ꎻ Ａ: Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ａｌｌｅｌｅｓ ｉｎ ａ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎꎻ Ｈｏ: Ｒａｔｉｏ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ.
剩余的 ３ 对多态性高的 １４ 号、 ２４ 号、 ２５ 号 ＳＳＲ
引物ꎬ 其多种群水平的位点数分别为 ５、 ６、 ６ꎮ
２􀆰 ２　 野慈姑自然种群的异交率
利用 Ｎａｔｉｖｅ￣ＰＡＧＥ 对野慈姑自然种群异交率
的估测结果显示ꎬ 主枝异交率为 ８９􀆰６３％ ±
１􀆰７６％、 侧枝异交率为 ９８􀆰３１％ ± ０􀆰９６％ꎬ 整体异
交率为 ９２􀆰８７％ ± ２􀆰５％ꎬ 且主、 侧枝异交率差异
不显著(Ｆ１ꎬ２８ ＝ ２􀆰７９ꎬ Ｐ ＝ ０􀆰１１)ꎬ 表明野慈姑自
然种群是以异交为主的交配系统ꎮ
２０１３年我们从随机选取的 ６ 个植株上共采集
到 ３１个果实ꎬ 因有 ２ 个果实几乎没有发芽ꎬ 故统
计时删去即共计 ２９ 个果实ꎬ 其中①位置有 ５ 个果
实(Ｎ ＝ ５)ꎻ ②位置 Ｎ ＝ ５ꎻ ③位置 Ｎ ＝ ４ꎻ ④位
置 Ｎ ＝ ５ꎻ ⑤位置 Ｎ ＝ ４ꎻ ⑥位置 Ｎ ＝ ４ꎻ ⑦位置
Ｎ ＝ ２ꎮ 对野慈姑花序内从基部到末梢(图 １ 中
① ~ ⑦)顺次结实的异交率趋势分析表明(图 ５)ꎬ
果实异交率水平没有显著的递增或递减趋势(Ｆ１ꎬ２８＝
０􀆰４６ꎬ Ｐ ＝ ０􀆰５０)ꎮ
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
1 2 3 4
!"#$ Fruit position
5 6 7
%
&

O
ut
cr
os
si
ng
ra
te
F = P =1 28, 0.46 0.50,
图 ５　 野慈姑顺次结实的异交率
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｏｕｔｃｒｏｓｓｉｎｇ ｒａｔｅ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｆｒｕｉｔｓ
ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｏｆ Ｓａｇｉｔｔａｒｉａ ｔｒｉｆｏｌｉａ
２􀆰 ３　 非变性聚丙烯凝胶电泳成像和荧光定量法的
对比
对同一 ＰＣＲ 扩增产物进行了两种方法(Ｎａｔｉｖｅ￣
ＰＡＧＥ成像和荧光定量)的检测ꎬ 并从位点多态性、
杂合率两个方面进行比较(表 ４)ꎬ 结果表明荧光定
量检测出 ３对引物的多态性位点数量、 杂合率均高
于非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳成像ꎬ 暗示 Ｎａｔｉｖｅ￣
ＰＡＧＥ电泳成像法对不同等位基因的分辨率不高ꎻ
荧光定量检测出的单引物异交率均值为 ３８􀆰９％ ±
７􀆰１％ꎬ Ｎａｔｉｖｅ￣ＰＡＧＥ成像的单引物异交率均值为
２８􀆰９％ ± ５􀆰９％ꎬ 即电泳成像的方法显著低估了野
慈姑自然种群的异交水平(ｔ ＝ １０􀆰９２ꎬ ｄｆ ＝ １７９ꎬ Ｐ ＝
０􀆰０００１)ꎮ
表 ４　 Ｎａｔｉｖｅ￣ＰＡＧＥ成像和荧光定量对野慈姑中
３对 ＳＳＲ引物位点扩增结果的检测
Ｔａｂｌｅ ４　 Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ＳＳＲ ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒｓ
ｉｎ Ｓａｇｉｔｔａｒｉａ ｔｒｉｆｏｌｉａꎬ ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ
ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｉｍａｇｉｎｇ
ａｎｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ＳＳＲ引物
电泳
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
杂合率
Ｈｏ
位点数
Ａ
Ｎｏ. １４
Ｎａｔｉｖｅ￣ＰＡＧＥ
荧光定量 Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
０.５３
０.８７
５
８
Ｎｏ. ２４
Ｎａｔｉｖｅ￣ＰＡＧＥ
荧光定量 Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
０.０８
０.４５
５
８
Ｎｏ. ２５
Ｎａｔｉｖｅ￣ＰＡＧＥ
荧光定量 Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
０.３７
０.４５
５
６
　 　 注: Ａꎬ 等位基因数ꎻ Ｈｏꎬ 杂合率ꎮ
Ｎｏｔｅ: Ａꎬ Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ａｌｌｅｌｅｓꎻ Ｈｏꎬ Ｒａｔｉｏ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ.
０６５ 植 物 科 学 学 报 第 ３３卷　
３　 讨论
本研究结果显示ꎬ 野慈姑的整体异交水平为
９２􀆰８７％ꎬ 即自交率为 ７􀆰１３％ꎬ 暗示其自然种群有
一定程度的自交ꎮ 野慈姑自交亲和ꎬ 并存在雌、 雄
花同时开放的情况ꎬ 这可能为其自交提供了机会ꎮ
有学者认为ꎬ 自交是对繁殖保障选择压力的适应ꎬ
如 Ｄｕａｎ 等发现 Ｇｅｎｔｉａｎｏｐｓｉｓ ｐａｌｕｄｏｓａ 的柱头和
花药的距离伴随着花朵开放时间的推移而逐渐变
小ꎬ 也就是说该植物在花朵开放后期为其自交提
供了繁殖保障[４１] ꎻ 也有学者认为ꎬ 有花植物大多
是两性的ꎬ 为了增加被昆虫传粉的机会ꎬ 其通常
会通过增加花展示( ｆｌｏｒａｌ ｄｉｓｐｌａｙ)而提高繁殖水
平ꎬ 自交因而成为了昆虫随机传粉不可避免的副
产物[４２ꎬ４３] ꎮ 对于野慈姑而言ꎬ 花序内存在雄花与
后序开放的雌花之间自交的情况ꎬ 但我们的实验
结果显示其自交率处于非常低的水平ꎬ 且该物种野
外的座果率和结实率都很高[４４]ꎬ 对自交繁殖保障
的选择压力应该很小ꎬ 故推测传粉者的随机行为造
成了野慈姑在自然种群中由于花开放式样引起的不
可避免的自交ꎮ 此外ꎬ Ｂａｒｒｅｔｔ 等[４５]发现美洲慈姑
(Ｓａｇｉｔｔａｒｉａ ｌａｔｉｆｏｌｉａ)的自交水平超过 ５０％ꎬ 并认为
这种较高的自交水平是由美洲慈姑无性系分株间的
传粉所造成ꎮ 但本实验中野慈姑自然种群的异交水
平非常高ꎬ 说明无性系分株之间的传粉十分有限ꎮ
Ｃｈｅｎ等研究认为野慈姑在同域中的遗传变异较
大ꎬ 而在域间的变异较小[４６]ꎬ 表明野慈姑自然种
群的组成以实生苗居多ꎬ 无性系分株较少ꎬ 这也是
与其生境的短暂性质紧密相关的ꎮ 综上分析ꎬ 我们
认为野慈姑的自然种群有性繁殖中异交占绝对主导
地位ꎬ 无性繁殖对于后代的贡献十分有限ꎮ
本研究野慈姑主、 侧枝的异交水平分别为
８９􀆰６３％和 ９８􀆰３１％ꎬ 且两者差异不显著ꎬ 同时野慈
姑花序内顺次结实的异交水平差异也不显著ꎮ 根据
野慈姑花开放式样的特点ꎬ 后序开放的雌花有可能
与雄花同时开放ꎬ 从而带来雌雄异花同株授粉的可
能ꎬ 因此我们的实验假说是侧枝上后序开放的雌花
其自交水平要高于主枝上先开放的雌花ꎮ 然而ꎬ 实
验结果显示植株上顺次结实的异交水平相当ꎬ 这可
能有别于我们猜测的花序内同株异花授粉ꎬ 暗示其
有限的自交可能是由无性系分株之间的传粉造成ꎮ
另外ꎬ 由于野慈姑植株在一个花期内可以产生多个
花序ꎬ 花序之间有可能存在时间上的重叠(未发表
数据)ꎬ 那么后期产生的花序上雌花与前期产生的
花序上未结束开放的雄花之间可能产生花序间的同
株异花授粉ꎮ 不过ꎬ 由于本实验的样本量较小ꎬ 这
些推测需要更多的野外观察数据及实验分析去
验证ꎮ
汪小凡和陈家宽利用同工酶遗传标记检测的野
慈姑 ３ 个自然种群的异交率分别为 ９６􀆰１％ ±
２２􀆰９％(茶陵居群)、 ９８％ ± ２１％(红安居群)和
９１％ ± ２８􀆰５％(武汉居群) [１５]ꎬ 由于该实验仅从 ８
种同工酶谱中选出一种同工酶(酯酶同工酶)进行
野慈姑异交水平的估测ꎬ 导致其标准差非常大ꎬ 且
存在单个家系的异交率超过 １００％的情况ꎬ 误差也
较大ꎮ 本研究通过 ＳＳＲ 标记估测的野慈姑自然种
群的异交率为 ９２􀆰８７％ꎬ 而且单个家系的异交率均
处在合理水平ꎬ 总体标准差小于 ３％ꎮ 另外ꎬ 我们
比较了 ２种检测方法的精确性ꎬ 发现单引物水平下
荧光定量检测出的异交率高于 Ｎａｔｉｖｅ￣ＰＡＧＥ １０％
(表 ４)ꎻ 进一步推算出多引物水平(３个引物结合)
下荧光定量的异交率高于 Ｎａｔｉｖｅ￣ＰＡＧＥ 约 １１􀆰８％ꎮ
也就是说ꎬ 如果用更精确的荧光定量方法检测ꎬ 野
慈姑的异交水平估计会趋近 １００％ꎬ 高于同工酶检
测的野慈姑任何自然种群的异交率ꎮ 同时ꎬ 高水平
的异交率也暗示在对野慈姑的交配系统检测中ꎬ ３
个高多态性微卫星位点足以满足实验的需求ꎬ 体现
了微卫星标记相比同工酶标记具有无法比拟的优
越性ꎮ
本研究以相同的 ＤＮＡ样本为模板进行 ＳＳＲ位
点扩增ꎬ 并对其 ＰＣＲ 扩增产物进行了 Ｎａｔｉｖｅ￣
ＰＡＧＥ成像和荧光定量 ２ 种方法的检测ꎮ 若从完成
时间、 检测效率和实验成本上比较ꎬ 荧光定量法的
检测效率为 １９２样本 / ｈꎬ 完成整个研究的 １８６０ 个
样本需耗时 ２个月ꎬ 但每个样品的实验成本为 ４􀆰０
元ꎻ 而 Ｎａｔｉｖｅ￣ＰＡＧＥ成像检测的效率为 １２样本 / ｈꎬ
完成整个实验需耗时 １２ 个月ꎬ 且每个样品的实验
成本为 ０􀆰５元ꎮ 另外ꎬ 荧光定量检测结果的精确性
要远远高于 Ｎａｔｉｖｅ￣ＰＡＧＥ 成像ꎮ 基于实验要求和
以上的比较分析ꎬ 本研究首推荧光定量技术ꎬ 但由
１６５　 第 ４期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 李 婷等: 利用 ＳＳＲ荧光标记对野慈姑异交率的估测
于其目前的使用成本较高ꎬ 在对植物交配系统的异
交率进行估测时ꎬ 也可在满足实验目标的情况下根
据具体经费预算合理选择其他实验方法ꎮ
致谢: 感谢罗文杰、 廖明林、 梁熙健、 李季洋等人对
文稿提出的宝贵修改意见ꎻ 感谢中国科学院武汉植物园水
生植物适应性进化课题组提供的栽植场地ꎬ 以及杜智渊、
孙姗姗ꎬ 龙志成、 江小亮等人在实验技术上给予的指导和
帮助ꎮ
参考文献:
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ｐａｌｕｄｏｓａ (Ｇｅｎｔｉａｎａｃｅａｅ) ｉｎ ｔｈｅ Ｑｉｎｇｈａｉ￣Ｔｉｂｅｔａｎ
Ｐｌａｔｅａｕ[ Ｊ] . Ｊ Ｉｎｔｅｇｒ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌꎬ ２０１０ꎬ ５２ ( ６):
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ｒｅｎｃｅꎬ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｅｘｐｌａｎａｔｉｏｎｓꎬ ａｎｄ ｅｍｐｉｒｉｃａｌ ｅｖｉ￣
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ｄｅｒ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｉｎｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓ ｉｎ ａ ｍｏ￣
ｎｏｅｃｉｏｕｓ ｐｌａｎｔ Ｓａｇｉｔｔａｒｉａ ｔｒｉｆｏｌｉａ ( Ａｌｉｓｍａｔａｃｅａｅ)
[Ｊ] . Ａｎｎ Ｂｏｔꎬ ２００２ꎬ ９０(５): ６１３－６２２.
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ｔｈｅ ｏｕｔｃｒｏｓｓｉｎｇ￣ｓｅｌｆｉｎｇ ｐａｒａｄｉｇｍ ａｎｄ ｂｅｙｏｎｄ[Ｊ] .
Ｐｈｉｌｏｓ Ｔ Ｒ Ｓｏｃ Ｂꎬ ２００３ꎬ ３５８(１４３４): ９９１－１００４.
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ｒａｐｈｙ ｏｆ ａ ｍａｒｓｈ ｈｅｒｂ Ｓａｇｉｔｔａｒｉａ ｔｒｉｆｏｌｉａ (Ａｌｉｓｍａｔａ￣
ｃｅａｅ) ｉｎ Ｃｈｉｎａ ｉｎｆｅｒｒｅｄ ｆｒｏｍ ｃｐＤＮＡ ａｔｐＢ￣ｒｂｃＬ ｉｎ￣
ｔｅｒｇｅｎｉｃ ｓｐａｃｅｒｓ[Ｊ] . Ｍｏｌ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔ Ｅｖｏｌꎬ ２００８ꎬ
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(责任编辑: 刘艳玲)
３６５　 第 ４期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 李 婷等: 利用 ＳＳＲ荧光标记对野慈姑异交率的估测