全 文 ：植物科学学报　 ２０１３ꎬ ３１(６): ５６２~５６９
Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ
　 　 ＤＯＩ:１０􀆰 ３７２４ / ＳＰ􀆰 Ｊ􀆰 １１４２􀆰 ２０１３􀆰 ６０５６２
高羊茅 ＦａＣｈｉｔ１基因启动子的功能分析
王仕英１ꎬ 王浩如１ꎬ 王 健１ꎬ２∗
(１. 教育部药用植物资源与天然药物化学重点实验室ꎬ西北濒危药材资源开发国家工程实验室ꎬ
陕西师范大学生命科学学院ꎬ 西安 ７１００６２ꎻ ２. 安康学院农学与生命科学学院ꎬ 陕西安康 ７２５０００)
摘　 要: 用含有不同长度 ＦａＣｈｉｔ１基因启动子区域与 ＧＵＳ基因融合构建植物表达载体 ｐＦａＣｈｉｔ１Ｐ￣Ⅰ、 ｐＦａＣｈｉｔ１Ｐ￣
Ⅱ以及 ｐＦａＣｈｉｔ１Ｐ￣Ⅲ并分别对烟草进行转化ꎬ 经真菌激发子、 干旱、 机械损伤以及乙烯等多种胁迫处理后测定
ＧＵＳ活性ꎮ 启动子缺失分析实验结果显示ꎬ 真菌激发子对 ＦａＣｈｉｔ１ 基因启动子所介导的 ＧＵＳ 诱导表达效果最
强ꎬ 而机械损伤只能微弱地诱导 ＧＵＳ基因表达ꎻ ＦａＣｈｉｔ１基因启动子－６５１ ｂｐ以内的序列均能介导 ＧＵＳ基因的
诱导表达ꎬ 同时－９３５ ｂｐ与－２３３ ｂｐ之间的区域是该启动子响应真菌激发子、 乙烯以及机械损伤胁迫所必需的ꎮ
表明 ＦａＣｈｉｔ１启动子是一个多胁迫诱导型启动子ꎮ
关键词: 高羊茅ꎻ ＦａＣｈｉｔ１基因ꎻ 启动子缺失分析
中图分类号: Ｑ９４３􀆰 ２　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ２０９５￣０８３７(２０１３)０６￣０５６２￣０８
　 　 　 收稿日期: ２０１３￣０４￣２４ꎬ 修回日期: ２０１３￣１０￣０８ꎮ
　 基金项目: 国家自然科学基金(３１１７０２８１)ꎻ 陕西省自然科学基金(２０１１Ｋ￣１６￣０２￣０１)ꎻ 陕西省教育厅自然科学专项基金(１１ＪＫ０６１０)ꎻ
安康学院高层次人才专项基金(ＡＹＱＤＺＲ２００９２６)ꎮ
　 作者简介: 王仕英(１９８９－)ꎬ 女ꎬ 硕士研究生ꎬ 主要从事植物基因工程及转基因植物研究ꎮ
　 ∗通讯作者(Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ􀆰 Ｅ￣ｍａｉｌ: ｗａｎｇｊｉａｎｓｗｊ＠１６３􀆰 ｃｏｍ)ꎮ
Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＦａＣｈｉｔ１ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ
Ｒｅｇｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｆｅｓｔｕｃａ ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ
ＷＡＮＧ Ｓｈｉ￣Ｙｉｎｇ１ꎬ ＷＡＮＧ Ｈａｏ￣Ｒｕ１ꎬ ＷＡＮＧ Ｊｉａｎ１ꎬ２∗
(１. Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｏｆ Ｅｎｄａｎｇｅｒｅｄ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｃｒｕｄｅ Ｄｒｕｇｓ ｉｎ Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ ｏｆ Ｃｈｉｎａꎬ
Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｓｈａａｎｘｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｘｉ􀆳ａｎ ７１００６２ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２. Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ
ａｎｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ Ａｎｋａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ａｎｋａｎｇꎬ Ｓｈａａｎｘｉ ７２５０００ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｂｙ ｆｕｎｇａｌ ｅｌｉｃｉｔｏｒｓꎬ ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎꎬ
ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｗｏｕｎｄｉｎｇꎬ ａｎｄ ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ ｕｓｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ
ｆｕｓｉｏｎｓ ｏｆ ＦａＣｈｉｔ１ ５􀆳 ｕｐｓｔｒｅａｍ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ＧＵＳ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ ( ｐｒｏｍｏｔｅｒ￣ＧＵＳ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ ａｓ ｐＦａＣｈｉｔ１Ｐ Ⅰ￣ꎬ ｐＦａＣｈｉｔ１Ｐ￣Ⅱ ａｎｄ ｐＦａＣｈｉｔ１Ｐ￣Ⅲꎬ
ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ) . Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＦａＣｈｉｔ１ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｃｏｎｆｅｒｒｅｄ ｔｈｅ
ｓｔｒｏｎｇｅｓｔ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＧＵＳ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｆｕｎｇａｌ ｅｌｉｃｉｔｏｒｓꎬ ｂｕｔ ｔｈｅ ｌｅａｓｔ
ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｗｏｕｎｄｉｎｇꎻ ＧＵＳ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ
ｆｏｕｒ ｓｔｒｅｓｓ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ｉｎ ｌｅａｖｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ６５１ ｂｐ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｏｆ ｔｈｅ ＦａＣｈｉｔ１ ｓｔａｒｔ ｃｏｄｏｎꎬ
ａｎｄ ｔｈｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｂｅｔｗｅｅｎ ９３５ ｂｐ ａｎｄ ２３３ ｂｐ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｏｆ ｔｈｅ ＦａＣｈｉｔ１ ｓｔａｒｔ ｃｏｄｏｎ ｗａｓ
ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｏ ｄｉｒｅｃｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｆｕｎｇａｌ ｅｌｉｃｉｔｏｒｓꎬ ｅｔｈｙｌｅｎｅꎬ ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎꎬ
ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｗｏｕｎｄｉｎｇ. Ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＦａＣｈｉｔ１ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｗａｓ ａ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｔｒｅｓｓ
ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｔａｌｌ ｆｅｓｃｕｅ (Ｆｅｓｔｕｃａ ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ)ꎻ ＦａＣｈｉｔ１ ｇｅｎｅꎻ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ
　 　 在植物应答病原菌及相关环境胁迫时ꎬ 防御基
因的转录调控起着非常重要的作用ꎮ 植物识别病原
体后ꎬ 通过一系列信号转导最终诱导相关植物防卫
反应基因的表达[１]ꎮ 在众多植物防御基因的启动
子序列中ꎬ 存在大量能够快速应答多种环境胁迫因
子的顺式作用元件且在功能上已被鉴定ꎮ
为了深入了解植物在其防御反应过程中几丁质
酶基因表达的转录调控机制ꎬ 已有多种植物几丁质
酶基因的启动子序列被分离克隆[２ꎬ３]ꎮ 例如ꎬ 烟草
几丁质酶基因 ＣＨ４８和马铃薯几丁质酶基因 ＣｈｔＣ２
的启动子均含有典型的 ＧＣＣ 盒ꎻ 皱叶欧芹 ＰＲ￣１０
基因、 烟草 ＣＨＮ５０基因以及拟南芥 ＮＰＲ１ 基因的
启动子中都含有不同数量及存在形式的 Ｗ 盒[４－６]ꎮ
ＷＲＫＹ类转录因子通过与抗病基因启动子中的 Ｗ
盒结合ꎬ 激活下游基因的表达ꎬ 从而介导植物对病
原菌来源的激发子(Ｐａｔｈｏｇｅｎ￣ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｌｉｃｉｔｏｒｓ)、
机械损伤及衰老等胁迫因子的防御性应答ꎮ 此外ꎬ
在很多胁迫诱导基因中存在一种顺式作用元件
Ｇ￣Ｂｏｘ(ＣＡＣＧＴＧＧＣ)ꎬ 这是一类 ＭＹＢ和 ＭＹＣ类
转录因子识别序列(ＭＹＢＲＳꎬ ＭＹＣＲＳ) [７] ꎮ 通过
与报告基因的融合并转化至相应受体植物后分析
报告基因的表达情况ꎬ 可进一步鉴定启动子中与
该基因表达相关的各种顺式作用元件(Ｃｉｓ￣ａｃｔｉｎｇ
ｅｌｅｍｅｎｔｓ)ꎮ
目前ꎬ 转基因技术中所使用的启动子大多数为
组成型启动子ꎮ 抗逆基因在其启动下的表达虽然可
以提高植物的相关抗逆能力ꎬ 但其持续的表达对植
物来说是一种物质及能量的浪费ꎬ 存在可能妨碍转
化植株正常代谢从而导致其异常发育的情况[８]ꎮ
如果使用组织特异性启动子或病原诱导型启动子ꎬ
使外源基因能定时、 定点、 定量地在植物中表达ꎬ
则可以克服使用组成型启动子所引起的负面问题ꎮ
高羊茅(Ｆｅｓｔｕｃａ ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ)又称苇状羊茅ꎬ 具
有抗病性强、 抗旱、 耐瘠薄、 适应性广等优良性
状ꎬ 若能从中分离出其内源抗性基因启动子序列并
对其进行功能验证ꎬ 则能为其它相关草坪草的抗病
及抗逆基因工程提供优良的病原诱导型启动子ꎬ 使
外源转移基因能在胁迫诱导型启动子的控制下进行
有选择的诱导表达从而更好的适应逆境ꎮ 基于此ꎬ
本实验从高羊茅植株中分离了抗病原菌性能较强的
Ⅰ类几丁质酶基因 ＦａＣｈｉｔ１的启动子序列并对其功
能进行了初步鉴定ꎬ 以期为进一步深入开展植物抗
病相关启动子的研究和应用奠定基础ꎮ
１　 材料和方法
１􀆰 １　 材料
将‘秦烟 ９５’号烟草种子用 ７０％乙醇消毒
３０ ｓꎬ 无菌水冲洗 ３次ꎬ 置于 ＭＳ基本培养基中萌
发生长至幼苗ꎮ 转化烟草幼苗经卡那霉素筛选后于
２５℃室温中培育 ３ ~４ 周ꎬ 分别进行真菌激发子
(１００ μｇ / ｍＬ) (壳聚糖经过氧化氢水解后干燥而
成)、 甘露醇(３００ ｍｍｏｌ / Ｌ)、 乙烯(１ ｍｇ / ｍＬ)胁
迫处理ꎬ 同时以清水处理作为阴性对照ꎮ 将幼嫩叶
片剪切成约 ５ ×５ ｃｍ 左右ꎬ 然后置于用清水浸泡
的滤纸上作为机械损伤胁迫ꎮ 以上处理时间均为
２４ ｈꎬ 温度为 ２５℃ꎮ
１􀆰 ２　 方法
１􀆰 ２􀆰 １　 植物表达载体的农杆菌转化
以 ＦａＣｈｉｔ１基因启动子为模板扩增－９３５ ｂｐ ~
＋１ ｂｐꎻ －６５１ ｂｐ~＋１ ｂｐꎻ －２３３ ｂｐ~＋１ ｂｐ区域ꎮ
ＰＣＲ回收产物经 Ｈｉｎｄ Ⅲ和 ＢａｍＨⅠ双酶切后连接
至植物表达载体 ｐＢＩ１２１ꎬ 分别命名为 ｐＦａＣｈｉｔ１Ｐ￣
Ⅰ、 ｐＦａＣｈｉｔ１Ｐ￣Ⅱ和 ｐＦａＣｈｉｔ１Ｐ￣Ⅲꎮ 农杆菌感受
态细胞的制备以及采用冻融法转化农杆菌等具体步
骤均按照分子克隆指南[９]进行ꎮ 向农杆菌感受态
细胞中加入 ０􀆰 １ μｇ 质粒 ＤＮＡꎬ 混匀ꎻ 冰上放置
１０ ｍｉｎꎬ 迅速置于液氮中速冻 ８ ｍｉｎꎬ 然后立即置
于 ２８℃水浴中热激 ５ ｍｉｎꎮ 加入 ５００ μＬ ＹＥＢ 液体
培养基ꎬ ２８℃、 缓慢振荡培养(小于 ２００ ｒ / ｍｉｎ)２~
３ ｈꎻ 取 １００ μＬ菌液分别涂布于含链霉素(１００ μｇ /
ｍＬ)和卡那霉素素(５０ μｇ / ｍＬ)的 ＹＥＢ固体培养基
上ꎮ ２８℃放置约 ４８ ｈ左右ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ２　 农杆菌介导的烟草遗传转化
取生长至 ５~６ 片真叶期的烟草无菌幼苗ꎬ 将
叶片剪成大小均一的小块ꎬ 转入 ＭＳ 预培养基
(３０ ｇ / Ｌ蔗糖、 ２ ｍｇ / Ｌ ６￣ＢＡ、 ０􀆰 １ ｍｇ / Ｌ ＮＡＡ)
上ꎬ ２５℃、 光照 １６ ｈ / ｄꎬ 预培养 ２~３ ｄꎮ 将预培
养后的材料取出ꎬ 放在无菌的培养皿中ꎮ 向皿中倒
入稀释好的农杆菌菌液ꎬ 浸泡 １５ ｍｉｎꎬ 然后用无
菌滤纸吸干多余菌液ꎬ 接入 ＭＳ 预培养基上ꎬ 暗
３６５　 第 ６期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 王仕英等: 高羊茅 ＦａＣｈｉｔ１基因启动子的功能分析
处、 ２５℃共培养 ２ ~３ ｄꎮ 将共培养的叶片外植体
转入含有 ２００ ｍｇ / Ｌ Ｃｅｆ(羧卞青霉素)的 ＭＳ 脱菌
培养基上ꎬ ２５℃、 光照 １６ ｈ / ｄꎬ 预培养 ２ ~３ ｄꎮ
将脱菌处理的外植体转入 ＭＳ 筛选培养基(３０ ｇ / Ｌ
蔗糖、 ２ ｍｇ / Ｌ ６￣ＢＡ、 ０􀆰 １ ｍｇ / Ｌ ＮＡＡ、 １００ ｍｇ / Ｌ
Ｋａｎ、 ２００ ｍｇ / Ｌ Ｃｅｆ)上进行选择培养ꎬ ２５℃、 光
照 １６ ｈ / ｄꎬ 每 ２ ~３ 周更换一次新鲜的筛选培养
基ꎮ 待绿芽长至 １ ｃｍ 左右时ꎬ 切下并插入 ＭＳ 生
根培养基(３０ ｇ / Ｌ蔗糖、 ０􀆰 ２ ｍｇ / Ｌ ＮＡＡ、 ５０ ｍｇ /
Ｌ Ｋａｎ、 ２００ ｍｇ / Ｌ Ｃｅｆ)上进行生根培养ꎮ 待根系
形成后取出小苗ꎬ 洗净根上的琼脂ꎬ 移入花盆中ꎬ
室温常规培养ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ３　 转基因烟草植株基因组 ＤＮＡ及 ＲＮＡ的提取
取新鲜幼嫩叶片约 １ ~２ ｇꎬ 迅速放入 ２ ｍＬ
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中ꎬ 置于液氮罐中快速冷冻ꎮ 然后采
用植物 ＤＮＡ大量提取试剂盒(宝泰克生物有限公
司ꎬ 北京)提取基因组 ＤＮＡꎬ 具体提取方法及步骤
按试剂盒说明进行ꎬ 通过紫外分光光度计将 ＤＮＡ
浓度调至 １ μｇ / μＬꎬ 置于－２０℃保存备用ꎮ 对于转
基因烟草植株总 ＲＮＡ 的提取采用盐酸胍法ꎬ 具体
步骤严格参照分子克隆指南[９]进行ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ４　 转基因烟草的 ＰＣＲ 检测及 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交
鉴定
使用引物 ＶＦ１ (５′￣ＡＣＡＧＡＧＣＡＡＣＣＧＡＡＴＴＴ￣
ＧＡＣＴＴ￣３′) 和 ＶＲ ( ５′￣ＣＡＣＴＴＣＣＴＧＡＴＴＡＴＴＧＡＣ￣
ＣＣＡＣＡ￣３′)对转 ｐＦａＣｈｉｔ１Ｐ Ⅰ￣或 ｐＦａＣｈｉｔ１Ｐ￣Ⅱ的
烟草植株进行 ＰＣＲ 检测ꎬ 使用引物 ＶＦ２ ( ５′￣
ＡＣＧＣＧＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＴＧ￣３′)和 ＶＲ对转 ｐＦａ￣
Ｃｈｉｔ１Ｐ￣Ⅲ的烟草植株进行 ＰＣＲ检测ꎮ ＰＣＲ反应程
序分别为: ９４℃预变性 ５ ｍｉｎꎬ ９４℃变性 １ ｍｉｎꎬ
６０℃退火 ４５ ｓꎬ ７２℃延伸 １ ｍｉｎꎬ ３０ 个循环ꎬ
７２℃延伸 １０ ｍｉｎ和 ９４℃预变性 ５ ｍｉｎꎬ ９４℃变性
１ ｍｉｎꎬ ５８℃退火 ３０ ｓꎬ ７２℃延伸 ４５ ｓꎬ ３０ 个循
环ꎬ ７２℃延伸 １０ ｍｉｎꎮ 对于 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交ꎬ 将启
动子中 ５６０ ｂｐ的 ＤＮＡ片段用地高辛标记成探针ꎬ
探针制备过程以及合适浓度的确定主要参照 ＤＩＧ
Ｈｉｇｈ Ｐｒｉｍｅ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｔａｒｔｅｒ
Ｋｉｔ Ｉ中的标准程序进行ꎮ 将约 ４０ μｇ转基因烟草基
因组 ＤＮＡ、 １０ μＬ １０×缓冲液、 １０ μＬ乙酰化 ＢＳＡ
与 １００ Ｕ内切酶(ＢａｍＨ Ⅰ、 Ｈｉｎｄ Ⅲ或 ＥｃｏＲ Ⅰ)
加 ｄｄ Ｈ２Ｏ 至总体积为 １００ μＬꎬ 均匀混合ꎬ ３７℃
酶切过夜ꎮ 次日于 ０􀆰 ７％琼脂糖凝胶中以 １ Ｖ / ｃｍ
恒压电泳ꎬ 待 ＤＮＡ 迁移至凝胶全长的 ２ / ３ 至 ３ / ４
处停止电泳ꎮ ＤＮＡ 向尼龙膜的转移、 杂交以及杂
交信号的检测等具体步骤严格参照分子克隆指
南[９]和试剂说明书进行ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ５　 转基因烟草的 ＧＵＳ荧光活性测定
新鲜转基因烟草叶片组织 ＧＵＳ 蛋白的提取、
ＧＵＳ 酶反应及荧光测定等步骤均按照 Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ
等[１０]的方法进行ꎮ 对于 ＧＵＳ提取液蛋白含量的测
定以及酶活力的计算ꎬ 则采用 Ｂｒａｄｆｏｒｄ的方法[１１]ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ６　 转基因烟草中 ＧＵＳ 基因 ｍＲＮＡ 表达水平
的 Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交
以 ｐＢＩ１２１ 中 ＧＵＳ 编码区内一段 ４００ ｂｐ 的
ＤＮＡ序列为模板将其用地高辛标记成探针ꎮ 探针
的制备及其合适浓度的确定均同 １􀆰 ２􀆰 ４ 所述ꎻ
ＲＮＡ变性凝胶电泳、 碱性条件下 ＲＮＡ向尼龙膜的
转移、 杂交以及杂交信号的检测等过程均严格参照
分子克隆指南[９]进行ꎮ
２　 结果与分析
２􀆰 １　 含不同 ＦａＣｈｉｔ１ 启动子区域转基因烟草植株
的 ＰＣＲ鉴定
使用农杆菌介导法转化烟草ꎬ 获得了含不同长
度的 ＦａＣｈｉｔ１ 基因启动子驱动 ＧＵＳ 表达 ( ｐＦａ￣
Ｃｈｉｔ１Ｐ Ⅰ￣、 ｐＦａＣｈｉｔ１Ｐ￣Ⅱ和 ｐＦａＣｈｉｔ１Ｐ￣Ⅲ)的转化
植株ꎬ 其中转 ｐＦａＣｈｉｔ１Ｐ Ⅰ￣载体获得了来自独立转
化事件的卡那霉素抗性植株 ２０ 株ꎬ 转 ｐＦａＣｈｉｔ１Ｐ￣
Ⅱ和 ｐＦａＣｈｉｔ１Ｐ￣Ⅲ载体分别获得了来自独立转化
事件的卡那霉素抗性植株 ３ 株及 ２ 株ꎮ 使用 ＶＦ１ /
ＶＲ及 ＶＦ２ / ＶＲ分别对上述转基因植株进行 ＰＣＲ 鉴
定ꎬ 结果见图 １和图 ２ꎮ 转化株均能扩增出相应大
小的特异性条带(７８０ ｂｐ、 ４８５ ｂｐ)ꎬ 而非转化株
没有扩增出条带ꎬ 结果初步证明外源基因已经整合
到烟草基因组中ꎮ
２􀆰 ２　 转基因烟草的 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定
为了进一步确定外源基因整合的拷贝数ꎬ 将从
转 ｐＦａＣｈｉｔ１Ｐ￣Ⅰ基因烟草 ＰＣＲ 鉴定中呈阳性结果
的植株分别随机选择 ３ 个独立转化系提取基因组
ＤＮＡꎬ 用 ＥｃｏＲ Ⅰ(１、 ３、 ５泳道)和 ＢａｍＨ Ⅰ(２、
４６５ 植 物 科 学 学 报 第 ３１卷　
N P 1 2 3 4 5 6 7 8 M
bp
2000
1000
500
250
Ｍ: ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒꎻ １~５: ｐＦａＣｈｉｔ１Ｐ Ⅰ￣转化株的 ＰＣＲ 扩增
结果ꎻ ６ ~ ８: ｐＦａＣｈｉｔ１Ｐ￣Ⅱ转化株的 ＰＣＲ 扩增结果ꎻ Ｐ:
ｐＦａＣｈｉｔ１Ｐ Ⅰ￣载体的 ＰＣＲ 扩增结果ꎻ Ｎ: 野生型烟草植株
的 ＰＣＲ扩增结果ꎮ
Ｍ: ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒꎻ １ － ５: ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ
ｐＦａＣｈｉｔ１Ｐ Ⅰ￣ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｔｏｂａｃｃｏꎻ ６－８: ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａ￣
ｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｐＦａＣｈｉｔ１Ｐ￣Ⅱ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｔｏｂａｃｃｏꎻ Ｐ:
ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｐＦａＣｈｉｔ１Ｐ Ⅰ￣ ｖｅｃｔｏｒꎻ Ｎ:
ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｗｉｌｄ ｔｏｂａｃｃｏ.
图 １　 转 ｐＦａＣｈｉｔ１Ｐ Ⅰ￣或 ｐＦａＣｈｉｔ１Ｐ￣Ⅱ载体
转基因烟草的 ＰＣＲ鉴定
Ｆｉｇ􀆰 １　 ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｉｇｈｔ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ
ｌｉｎｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐＦａＣｈｉｔ１Ｐ Ⅰ￣ｏｒ ｐＦａＣｈｉｔ１Ｐ￣Ⅱ
N 1 2 3 M
bp
2000
1000
500
250
Ｍ: ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒꎻ Ｎ: 野生型烟草植株的 ＰＣＲ 扩增结果ꎻ １:
ｐＦａＣｈｉｔ１Ｐ￣Ⅲ载体的 ＰＣＲ 扩增结果ꎻ ２ꎬ ３: ｐＦａＣｈｉｔ１Ｐ￣Ⅲ转化
的 ２株烟草植株的 ＰＣＲ扩增结果ꎮ
Ｍ: ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒꎻ Ｎ: ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｗｉｌｄ ｔｏｂａｃ￣
ｃｏꎻ １: ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｐＦａＣｈｉｔ１Ｐ￣Ⅲ ｖｅｃｔｏｒꎻ ２ꎬ
３: ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｔｗｏ ｐＦａＣｈｉｔ１Ｐ￣Ⅲ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ
ｔｏｂａｃｃｏ ｐｌａｎｔｓ.
图 ２　 转 ｐＦａＣｈｉｔ１Ｐ￣Ⅲ载体转基因烟草的 ＰＣＲ鉴定
Ｆｉｇ􀆰 ２　 ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｉｇｈｔ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ
ｌｉｎｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐＦａＣｈｉｔ１Ｐ￣Ⅲ
４、 ６泳道)各自进行单酶切ꎬ 用 ＢａｍＨⅠ和 Ｈｉｎｄ Ⅲ
进行双酶切(７、 ８、 ９泳道)(图 ３中 １、 ３、 ５ 泳道
和 ２、 ４、 ６泳道以及 ７、 ８、 ９ 泳道所对应的样品
相一致)ꎬ 酶切后的基因组 ＤＮＡ 分别与来自启动
子中 ５６０ ｂｐ 的 ＤＮＡ 探针 (探针制备见方法
１􀆰 ２􀆰 ４)杂交ꎮ 杂交结果表明ꎬ 在所检测的 ｐＦａ￣
Ｃｈｉｔ１Ｐ Ⅰ￣转化系中ꎬ 融合基因已整合到烟草基因
组中ꎬ ２个转化系整合了 ２ 个拷贝ꎬ １ 个转化系整
合了 １个拷贝(图 ３)ꎮ 其中ꎬ 由于在标记的杂交探
针内部有一个 ＥｃｏＲⅠ酶切位点ꎬ 所以 １、 ３、 ５ 泳
道所对应的样品分别有 １个和 ２个拷贝ꎬ 与 ２、 ４、
６泳道和 ７、 ８、 ９泳道杂交结果一致ꎮ
P N 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Ｐ: 质粒 ｐＦａＣｈｉｔ１Ｐ Ⅰ￣用 ＢａｍＨ Ⅰ和 Ｈｉｎｄ Ⅲ双酶切ꎻ Ｎ: 未转化
烟草基因组 ＤＮＡ用 ＢａｍＨ Ⅰ和 Ｈｉｎｄ Ⅲ双酶切ꎻ １、 ３、 ５: 基因
组 ＤＮＡ用 ＥｃｏＲ Ⅰ单酶切ꎻ ２、 ４、 ６: 基因组 ＤＮＡ用 ＢａｍＨ Ⅰ
单酶切ꎻ ７~９: 基因组 ＤＮＡ用 ＢａｍＨ Ⅰ和 Ｈｉｎｄ Ⅲ双酶切ꎮ
Ｐ: Ｐｌａｓｍｉｄ ｐＦａＣｈｉｔ１Ｐ Ⅰ￣ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ ＢａｍＨ Ⅰ ａｎｄ Ｈｉｎｄ Ⅲꎻ
Ｎ: Ｎｏｎ￣ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ ＢａｍＨ
Ⅰ ａｎｄ Ｈｉｎｄ Ⅲꎻ １ꎬ ３ꎬ ５: Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ ＥｃｏＲ
Ⅰ ｆｒｏｍ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｔｏｂａｃｃｏ ｐｌａｎｔｓꎻ ２ꎬ ４ꎬ ６: Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ
ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ ＢａｍＨ Ⅰ ｆｒｏｍ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｔｏｂａｃｃｏ ｐｌａｎｔｓꎻ ７－９:
Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ ＢａｍＨ Ⅰ ａｎｄ Ｈｉｎｄ Ⅲ ｆｒｏｍ ｔｒａｎｓ￣
ｆｏｒｍｅｄ ｔｏｂａｃｃｏ ｐｌａｎｔｓ.
图 ３　 ｐＦａＣｈｉｔ１Ｐ Ⅰ￣烟草转化株系的 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ
ｐｌａｎｔｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｗｉｔｈ ｐＦａＣｈｉｔ１Ｐ Ⅰ￣
２􀆰 ３　 ＦａＣｈｉｔ１启动子不同区域对多种胁迫的应答
特征
为了进一步研究 ＦａＣｈｉｔ１基因启动子不同区段
所起的转录调控作用ꎬ 本实验对不同长度启动子转
化烟草株系在几种胁迫条件下的 ＧＵＳ 荧光活性进
行了测定ꎮ 首先ꎬ 用 １００ μｇ / ｍＬ 真菌激发子对含
不同长度启动子转化烟草株处理 ２４ ｈꎬ 然后检测
转基因烟草叶片组织中的 ＧＵＳ酶活性ꎮ 从图 ４: Ａ
可看出ꎬ －９３５ ｂｐ和－６５１ ｂｐ的 ＦａＣｈｉｔ１启动子介
导的 ＧＵＳ诱导表达活性分别约为对照组的 ６􀆰 ５ 倍
和 ５􀆰 １ 倍ꎬ 略低于阳性对照 ３５Ｓ 启动子介导的
ＧＵＳ表达ꎬ 然而ꎬ －２３３ ｂｐ 的 ＦａＣｈｉｔ１ 启动子几
乎未检测到 ＧＵＳ 活性ꎮ 这一结果表明 ＦａＣｈｉｔ１ 启
动子－９３５ ｂｐ 与－２３３ ｂｐ 之间的片段中存在的 Ｗ￣
Ｂｏｘ可能是该启动子响应真菌激发子所需要的ꎬ 但
是否在该区域内还存在其它真菌激发子协同响应元
件ꎬ 还有待后续实验进一步证实ꎮ １􀆰 ０ ｍｇ / ｍＬ 乙
烯溶液喷洒处理 ２４ ｈ 后检测结果显示(图 ４: Ｂ)ꎬ
与清水处理组对照相比ꎬ －９３５ ｂｐ、 －６５１ ｂｐ Ｆａ￣
Ｃｈｉｔ１启动子介导的 ＧＵＳ 活性值分别为对照组的
５􀆰 ０、 ２􀆰 ５ 倍ꎬ 而－２３３ ｂｐ ＦａＣｈｉｔ１ 启动子的转化
烟草株没有检测到 ＧＵＳ 活性ꎮ 在乙烯处理条件
下ꎬ 不同长度的 ＦａＣｈｉｔ１ 启动子介导的 ＧＵＳ 活性
５６５　 第 ６期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 王仕英等: 高羊茅 ＦａＣｈｉｔ１基因启动子的功能分析
值与真菌激发子的胁迫诱导相似ꎬ 只是相应的数值
略低ꎬ 表明 ＦａＣｈｉｔ１启动子－９３５ ｂｐ与－２３３ ｂｐ之
间的片段是该启动子响应乙烯胁迫所需要的ꎮ 甘露
醇干旱胁迫处理 ２４ ｈ 后ꎬ 检测结果显示 (图 ４:
Ｃ)ꎬ －９３５ ｂｐ、 －６５１ ｂｐ、 －２３３ ｂｐ 的 Ｆａｃｈｉｔ１ 基
因启动子介导的 ＧＵＳ 活性分别为对照组的 ５􀆰 ４、
４􀆰 ７５及 ２􀆰 ２５ 倍ꎬ 表明 ＧＵＳ 诱导表达随着 Ｆａ￣
Ｃｈｉｔ１基因启动子片段的不断缺失逐渐变弱ꎮ 为了
确定 ＦａＣｈｉｔ１基因启动子能否响应损伤胁迫ꎬ 将上
述烟草转化株系机械损伤处理ꎬ 从图 ４: Ｄ 可见ꎬ
－９３５ ｂｐ、 －６５１ ｂｐ的 ＦａＣｈｉｔ１ 基因启动子只能轻
微诱导 ＧＵＳ表达ꎬ 与清水处理组对照相比ꎬ ＧＵＳ
诱导表达活性分别约为对照组的 ２􀆰 ４ 及 ２􀆰 １ 倍ꎬ
而且－２３３ ｂｐ 的 ＦａＣｈｉｔ１ 基因启动子不能再诱导
ＧＵＳ表达ꎮ
２􀆰 ４　 ｐＦａＣｈｉｔ１Ｐ Ⅰ￣转化系烟草中 ＧＵＳ 基因的
ｍＲＮＡ表达水平
鉴于 ＧＵＳ基因的 ｍＲＮＡ 表达水平比 ＧＵＳ 酶
活性更能直接反映 ＧＵＳ 基因的转录调控ꎬ 本实验
对在同样胁迫条件下处理的 ｐＦａＣｈｉｔ１Ｐ Ⅰ￣烟草转化
A B
C D
G
U
S/
0
1
G
U
S
ac
tiv
ity
G
U
S/
0
1
G
U
S
ac
tiv
ity
G
U
S/
0
1
G
U
S
ac
tiv
ity
G
U
S/
0
1
G
U
S
ac
tiv
ity
0
50
100
150
200
250
300
-935bp -651bp -233bp N P
ddH O2
ddH O2 ddH O2
ddH O2 !" Ethylene#$%& Elicitor
0
50
100
150
200
250
300
-935bp -651bp -233bp N P
0
50
100
150
200
250
300
-935bp -651bp -233bp N P
()* Mannitol
0
50
100
150
200
250
300
-935bp -651bp -233bp N P
+,-. Wounding treatment
×6.5 ×5.1 ×1.2 ×1.0 ×1.0 ×5.0 ×2.5 ×1.2 ×1.0 ×1.0
×5.4 ×2.4×4.75 ×2.1×2.25 ×1.0×1.0 ×1.0×1.0 ×1.0
2345 67FaChit1
Modified promoterFaChit1
2345 67FaChit1
Modified promoterFaChit1
2345 67FaChit1
Modified promoterFaChit1
2345 67FaChit1
Modified promoterFaChit1
(
)
4-
M
U
p
m
ol
m
g
m
in
-1
-1
(
)
4-
M
U
p
m
ol
m
g
m
in
-1
-1
(
)
4-
M
U
p
m
ol
m
g
m
in
-1
-1
(
)
4-
M
U
p
m
ol
m
g
m
in
-1
-1
Ａ: 真菌激发子胁迫ꎻ Ｂ: 乙烯胁迫ꎻ Ｃ: 甘露醇胁迫ꎻ Ｄ: 机械损伤胁迫ꎮ 横坐标上的数字为不同 ＦａＣｈｉｔ１启动子区域与对照处理的
ＧＵＳ诱导表达倍数ꎮ Ｎ: 未转化烟草ꎻ Ｐ: ｐＢＩ１２１质粒ꎮ
Ａ: Ｅｌｉｃｉｔｏｒ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎꎻ Ｂ: Ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎꎻ Ｃ: Ｍａｎｎｉｔｏｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔꎻ Ｄ: Ｗｏｕｎｄｉｎｇ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ. Ｎｕｍｂｅｒｓ ｕｎｄｅｒ ｂａｒ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｆｏｌｄ￣
ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｏｆ ＧＵＳ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｆｔｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｖｅｒｓｕｓ ｃｏｎｔｒｏｌ. Ｎ: Ｕｎｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｗｉｌｄ ｔｏｂａｃｃｏ ｐｌａｎｔꎻ Ｐ: ｐＢＩ１２１ ｖｅｃｔｏｒ.
图 ４　 含有不同长度 ＦａＣｈｉｔ１启动子转基因烟草在不同胁迫处理 ２４ ｈ后叶片组织中的 ＧＵＳ活性变化
Ｆｉｇ􀆰 ４　 ＧＵＳ ａｃｔｉｖｉｔｙ ２４ ｈ ａｆｔｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ｉｎ ｌｅａｆ ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ
ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ｏｆ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＦａＣｈｉｔ１ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｎｄ ＧＵＳ ｇｅｎｅ ＯＲＦ
６６５ 植 物 科 学 学 报 第 ３１卷　
系中的 ＧＵＳ基因的 ｍＲＮＡ 表达水平进行了分析ꎮ
Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交结果显示(图 ５)ꎬ ｐＦａＣｈｉｔ１Ｐ Ⅰ￣转化
系烟草中 ＧＵＳ基因的 ｍＲＮＡ表达水平在 ４种不同
的胁迫处理下与高羊茅中 ＦａＣｈｉｔ１ 基因的表达水平
保持相对的一致性ꎻ 然而从整个表达水平上看ꎬ 转
基因烟草中 ＧＵＳ 基因的 ｍＲＮＡ 表达量要低于 Ｆａ￣
Ｃｈｉｔ１基因的 ｍＲＮＡ水平ꎮ 推测导致这种现象的原
因可能有两个ꎬ 一是外源性融合基因 ｐＦａＣｈｉｔ１ＰⅠ￣
ＧＵＳ的不稳定性ꎬ 二是可能在 ＦａＣｈｉｔ１ 基因启动
子－９３５ ｂｐ上游还存在相应的增强子序列元件ꎮ
A B C D E
1.8 kb GUS
rRNA
　 　 　 Ａ: Ｈ２Ｏꎻ Ｂ: 真菌激发子ꎻ Ｃ: 甘露醇ꎻ Ｄ: 乙烯ꎻ
　 　 　 Ｅ: 机械损伤ꎮ
　 　 　 Ａ: Ｈ２Ｏꎻ Ｂ: Ｅｌｉｃｉｔｏｒꎻ Ｃ: Ｍａｎｎｉｔｏｌꎻ Ｄ: Ｅｔｈｙｌｅｎｅꎻ
　 　 　 Ｅ: Ｗｏｕｎｄｉｎｇ.
图 ５　 ｐＦａＣｈｉｔ１Ｐ Ⅰ￣转化系烟草叶片中 ＧＵＳ基因
经不同胁迫处理后的 ｍＲＮＡ表达水平
Ｆｉｇ􀆰 ５　 ＲＮＡ ｇｅｌ ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ＧＵＳ ｍＲＮＡ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ
ｉｎ ｌｅａｆ ｔｉｓｓｕｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｔｏｂａｃｃｏ ｐｌａｎｔｓ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ
ＧＵＳ ｄｒｉｖｅｎ ｂｙ ｔｈｅ －９３５ ｂｐ ｒｅｇｉｏｎ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｏｆ ｔｈｅ ＦａＣｈｉｔ１
ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｃｏｄｏｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ａｆｔｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ
３　 讨论
植物防卫基因的启动子区域内具有多个能快速
响应病原菌侵袭的顺式调控元件ꎬ Ｗ￣Ｂｏｘ 就是其
中最重要的一类[１ꎬ１２－１４]ꎮ 例如ꎬ 烟草Ⅰ类几丁质酶
基因 ＣＨＮ５０ 启动子中的 Ｗ￣Ｂｏｘ 就能够与相关的
ＷＲＫＹ转录因子进行特异性结合[５]ꎮ 本实验中我
们发现ꎬ 在 ＦａＣｈｉｔ１Ｐ Ⅰ￣及 ＦａＣｈｉｔ１Ｐ￣Ⅱ转化系烟草
植株中ꎬ 由启动子－９３５ ｂｐ 及－６５１ ｂｐ 两个片段
所介导的 ＧＵＳ表达活性并没有多大的差别ꎻ 另一
方面ꎬ 从图 ４: Ａ 可以看出ꎬ 位于 －９３５ ｂｐ 与
－６５１ ｂｐ之间的 ２８４ ｂｐ 的区域的确增强了 ＧＵＳ
表达活性ꎬ 这一实验结果暗示位于 －６５１ ｂｐ 与
－２３３ ｂｐ之间的 ４１８ ｂｐ 的区域对真菌激发子的胁
迫响应是必需的ꎬ 而且似乎 Ｗ￣Ｂｏｘ 之间存在着一
定的协同关系ꎬ 这种协同关系能进一步增强它们对
目的基因的调控表达ꎮ Ｅｕｌｇｅｍ等报道ꎬ 单独的Ｗ￣
Ｂｏｘ对真菌激发子的胁迫响应是相当低的ꎬ 然而多
个 Ｗ￣Ｂｏｘ的共同存在能大大提高其响应程度ꎬ 显
示出一定的协同效应[１５]ꎮ 可能在植物体内 Ｗ￣Ｂｏｘ
作为一类通用的调控元件不仅需要 Ｗ￣Ｂｏｘ 与之相
应的转录因子之间的结合ꎬ 而且还需要启动子内其
它相关 ＤＮＡ调控元件与之相应的转录因子之间的
结合以及二者之间的相互作用[１６]ꎮ
尽管在 ＦａＣｈｉｔ１基因的－９３５ ｂｐ启动子中没有
典型的脱水响应元件 ( ＤＲＥＢꎬ ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｒｅ￣
ｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ)ꎬ 但是转化烟草对干
旱胁迫具有较强的响应ꎮ 一般而言ꎬ 在胁迫诱导基
因的启动子中常常存在 ＡＢＲＥ(ＡＢＡ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅ￣
ｍｅｎｔ)以及 ＭＹＣ或 ＭＹＢ识别序列[１７]ꎮ ＦａＣｈｉｔ１基
因的－９３５ ｂｐ 启动子中也含有这些调控元件ꎬ 包
括 １０个左右的 ＭＹＣ 或 ＭＹＢ 识别序列以及 ４ 个
ＡＢＲＥꎬ 因此ꎬ 这些调控元件可能参与 ＦａＣｈｉｔ１ 基
因的干旱胁迫应答ꎮ
作为一种信号分子ꎬ 乙烯在植物体响应多种环
境胁迫应答的过程中起着重要的作用ꎮ 病原菌的侵
染能导致植物体内乙烯的快速合成ꎬ 继而通过以乙
烯为信号分子的信号转导途径诱导相关防卫基因的
表达ꎮ 本实验中观察到ꎬ 含有 ＦａＣｈｉｔ１ 启动子的 ３
个片段(－９３５ ｂｐ、 －６５１ ｂｐ和－２３３ ｂｐ)的转基因
烟草植株叶片组织都能够响应乙烯并表达产生不同
程度的 ＧＵＳ 活性ꎮ 但是 ＦａＣｈｉｔ１ 启动子却不含有
典型的乙烯响应元件 ＧＣＣ￣Ｂｏｘꎮ 这种情况在先前
也有过报道ꎬ 如一些参与果实成熟以及器官衰老有
关的基因中ꎬ 没有 ＧＣＣ￣Ｂｏｘ 的存在ꎬ 但仍然受乙
烯诱导[１８－２０]ꎬ 说明除了 ＧＣＣ￣Ｂｏｘ 以外ꎬ 其它一
些顺式调控元件以及相关的一些转录因子可能也参
与乙烯途径的调控ꎮ 例如ꎬ 拟南芥的 ＡｔＥＲＦ１４ 是
一个受乙烯诱导的转录因子ꎬ 不仅能够调控含有
ＧＣＣ￣Ｂｏｘ的基因表达ꎬ 也能调控不含 ＧＣＣ￣Ｂｏｘ
基因(ＡｔＥＲＦ)的表达ꎮ ＡｔＥＲＦ１４可能与其它的顺式
调控元件结合ꎬ 或者与其它调控蛋白结合后继而激
活 ＡｔＥＲＦ的表达[２１]ꎮ 番茄 Ｐｔｉ４ 转录调控蛋白在拟
南芥中过量表达后ꎬ 能与不含 ＧＣＣ￣Ｂｏｘ 的启动子
序列结合从而激活目的基因的表达[１９]ꎮ 这些都暗
示着ꎬ 在 ＦａＣｈｉｔ１基因启动子中ꎬ 可能存在还没有
被特征化的乙烯响应元件ꎮ
基因工程技术是改良作物抗逆性的最经济、 也
７６５　 第 ６期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 王仕英等: 高羊茅 ＦａＣｈｉｔ１基因启动子的功能分析
是最有前景的方法ꎬ 胁迫诱导型启动子能调节基因
表达的时空性ꎬ 促使外源基因在逆境胁迫条件下表
达相应的蛋白ꎬ 如增加胁迫蛋白的含量ꎬ 提高抗氧
化剂基因的表达水平ꎬ 增加可溶性物质的积累等ꎬ
既可节约细胞内代谢能量ꎬ 又不影响植物的正常生
长发育ꎬ 避免外源基因对植物的不良效应ꎬ 同时转
基因植株还能更好地适应相应的逆境胁迫[２２]ꎮ 本
实验研究的高羊茅 ＦａＣｈｉｔ１的启动子不但能够响应
病原菌的侵染ꎬ 而且还具有响应相关逆境胁迫的
功能ꎬ 因此将该基因及其启动子作为一个完整抗
胁迫基因对其它植物进行遗传改良值得进一步的
研究ꎮ
参考文献:
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１３２６.
[１５] 　 Ｅｕｌｇｅｍ Ｔꎬ Ｒｕｓｈｔｏｎ Ｐ Ｊꎬ Ｓｃｈｒｎｅｌｚｅｒ Ｅꎬ ｅｔ ａｌ.
Ｅａｒｌｙ ｎｕｃｌｅａｒ ｅｖｅｎｔｓ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｄｅｆｅｎｓｅ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ:
ｒａｐｉｄ ｇｅｎｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ＷＲＫＹ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃ￣
ｔｏｒｓ[Ｊ] . Ｅｍｂｏ Ｊꎬ １９９９ꎬ １８: ４６８９－４６９９.
[１６] 　 Ｓａｗａｎｔ Ｓ Ｖꎬ Ｋｉｒａｎ Ｋꎬ Ｍｅｈｒｏｔｒａ Ｒꎬ ｅｔ ａｌ. Ａ ｖａｒｉｅ￣
ｔｙ ｏｆ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ａｎｄ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｍｅ￣
ｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｃｉｓ￣ａｃｔｉｎｇ ＤＮＡ ｍｏｔｉｆｓ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｇｅｎｅ ｅｘ￣
ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｍｏｄｕｌａｔｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒｍｅｄ ｏｎ ａ ｂａｓａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ
[Ｊ] . Ｊ Ｅｘｐ Ｂｏｔꎬ ２００５ꎬ ５６(４１９): ２３４５－２３５３.
[１７] 　 Ｃｈｉｎｎｕｓａｍｙ Ｖꎬ Ｓｃｈｕｍａｋｅｒ Ｋꎬ Ｚｈｕ Ｊ Ｋꎬ ｅｔ ａｌ.
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｏｎ ｃｒｏｓｓ￣ｔａｌｋ ａｎｄ
ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｉｎ ａｂｉｏｔｉｃ ｓｔｒｅｓｓ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ[Ｊ] .
Ｊ Ｅｘｐ Ｂｏｔꎬ ２００４ꎬ ５５: ２２５－２３６.
８６５ 植 物 科 学 学 报 第 ３１卷　
[１８] 　 Ｒａｇｈｏｔｈａｍａ Ｋ Ｇꎬ Ｌａｗｔｏｎ Ｋ Ａꎬ Ｇｏｌｄｓｂｒｏｕｇｈ
ＰＢꎬ ｅｔ ａｌ. Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｅｔｈｙｌｅｎｅ￣ｒｅｇｕｌａ￣
ｔｅｄ ｆｌｏｗｅｒ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ￣ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ｃａｒｎａｔｉｏｎ
[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌꎬ １９９１ꎬ １７: ６１－７１.
[１９] 　 Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｈｙ Ｓꎬ Ｔｕｏｒｉ Ｒ Ｐꎬ Ｄ􀆳Ａｓｃｅｎｚｏ Ｍ Ｄꎬ ｅｔ
ａｌ. Ｔｈｅ ｔｏｍａｔｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ Ｐｔｉ４ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ
ｄｅｆｅｎｓｅ￣ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｉａ ＧＣＣ ｂｏｘ ａｎｄ
ｎｏｎ￣ＧＣＣ￣Ｂｏｘ ｃｉｓ￣ｅｌｅｍｅｎｔｓ[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌꎬ ２００３ꎬ
１５: ３０３３－３０５０.
[２０] 　 Ｐｉｒｒｅｌｌｏ Ｊꎬ Ｊａｉｍｅｓ￣Ｍｉｒａｎｄａ Ｆꎬ Ｓａｎｃｈｅｚ￣Ｂａｌｌｅｓｔａ Ｍ
Ｔ. Ｓ１￣ＥＲＦ２ꎬ ａ ｔｏｍａｔｏ ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｆａｃｔｏｒ
ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ ｓｅｅｄ ｇｅｒｍｉｎａ￣
ｔｉｏｎ[ Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙꎬ ２００６ꎬ ４７ ( ９): １１９５ －
１２０５.
[２１] 　 Ｏｎａｔｅ￣Ｓａｎｃｈｅｚ Ｌꎬ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｊ Ｐꎬ Ｙｏｕｎｇ Ｊ.
ＡｔＥＲＦ１４ꎬ ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ＥＲＦ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｔｒａｎ￣
ｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓꎬ ｐｌａｙｓ ａ ｎｏｎ￣ｒｅｄｕｎｄａｎｔ ｒｏｌｅ ｉｎ
ｐｌａｎｔ ｄｅｆｅｎｓｅ[Ｊ]. Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌꎬ ２００７ꎬ １４３: ４００－
４０９.
[２２] 　 于壮ꎬ 朱丽萍ꎬ 邹翠霞ꎬ 李秋莉. 胁迫诱导型启动
子在植物抗逆基因工程中的应用[Ｊ] . 植物生理学
通讯ꎬ ２００９ꎬ ４５(１１): １１４１－１１４５.
(责任编辑: 张 平)
９６５　 第 ６期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 王仕英等: 高羊茅 ＦａＣｈｉｔ１基因启动子的功能分析