全 文 ：武汉植物学研究 2004，22(5)：449~454
Journal of Wuhan Botanical Research
野牛草幼穗愈伤组织的诱导及植株再生
李瑞芬r，孙振元 ，魏建华 ，王宏芝
(1．北京市农林科学院农业生物技术研究中心，北京 100089；2．中国林业科学院林业研究所，北京 100091)
摘 要：以野牛草[Buchloe dactyloides(Nutt．)Engelm．]幼穗为外植体，建立了愈伤组织诱导、继代培养和植株再
生体系。结果表明，雌穗比雄穗难以脱分化形成愈伤组织；小于8 mm雄幼穗在2 mg／L 2，4一D培养基上的愈伤组织诱
导率为80．O ～86．8 ；添加10 mg／L AgNO。对愈伤组织诱导率影响不明显，但可改善愈伤组织质量。2 mg／L
2，4-D结合0．1 mg／L 6-BA的培养基有利于愈伤组织的继代培养；继代超过 3次、继代间隔超过 3周，愈伤组织分化
能力明显下降。雄穗愈伤组织在含1．0 mg／L 6-BA培养基上，弱光条件下分化出芽的频率较高，达31．8 ～35．O％；
附加 3 麦芽糖既可减轻褐化程度，又利于丛生芽的分化。分化苗在1／2 MS+0．3 mg／L IBA培养基上的生根率为
62．5 。
关键词：野牛草；幼穗；雄株；愈伤组织；植株再生
中图分类号 ：S688．4；Q943．1 文献标识码：A 文章编号：1000—47OX(2OO4)O5一O449一O6
Callus Induction from Immature InflOrescence
and Plant Regeneration of Buffalograss
LI Rui—Fen 。，SUN Zhen—Yuan。，WEI Jian—Hua ，WANG Hong—Zhi
(1．Beijing Agro—biotechnology Research Center，BeOing Academy of Agricultural and Forestry Sciences，Beijing 100089，China，
2．Institute of Forestry，The Chinese Academy of Forestry Sciences，Beijing 100091，China)
Abstract：Female and male immature inflorescences of buffalograss[Buchloe dactyloides(Nutt．)
Engelm． were used as explants to develop a tissue culture system for callus induetion，subculture
and plant regeneration．The result showed that it iS more difficult to dedifferentiate to form callus
from female inflorescences than male ones．Calus was initiated in induetion medium containing
2 mg／L 2，4一D from less than 8 mm male inflorescence，the frequency was 80．0 一86．8 ．The
inclusion of 1 0 mg／L AgNO3 in medium had no stimulatory efect on the frequency of calus
induction，however it could improve callus quality．The combination of 2 mg／L 2，4一D with
0．1 mg／L 6一BA contributed to callus subculture．The regenerating potential of callus derived
from male inflorescence decreased while the calli were subeultured over 3 times with the internal
of more than 3 weeks．The frequency of regenerating shoot ranged from 31．8 to 35．O in
medium containing 1．0 mg／L 6一BA under the dim light．The addition of 3 maltose into
regeneration medium not only could alleviate browning，but also contributed to regenerate shoot．
The rooting rate of shoots was 62．5 in 1／2 MS medium containing 0．3 mg／L IBA．
Key words：Buffalograss；Immature inflorescence；Male plant；Callus；Plant regeneration
野 牛 草 [Buchloe dactyloides(Nut．)En—
gelm．]是禾本科野牛草属多年生草本植物，原产于
北美大平原。由于具有突出的抗旱特性 ，而且管理维
护水平要求较低，匍匐茎发达 ，扩展能力强等特点，
主要用于水土保持和城市绿化，尤其适合我国北方
干旱地区种植，被誉为“耐旱冠军”，是一种具有发展
前途的重要的暖季型草坪草种。
目前通过生物技术改良草坪草 已取得一定进
收稿日期 2004—02—20，修回日期；2004—06—02。
基金项 目 国家“863 计划项 目(2002AA241061)。
作者简介；李瑞芬(1970-)，女，博士，主要从事园林植物生物技术研究。
通讯作者(E—mail l liruifen@yahoo．corn．cn)。
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展[1]，但野牛草遗传转化研究报道较少[2]，主要原因
是由于难以建立高效、稳定的野牛草组织培养再生体
系。国外报道利用野牛草幼穗[3]、叶片基部和幼苗切
段[I]培养获得再生植株，但植株再生率较低；我国目
前尚未见野牛草组织培养和遗传转化的研究报道。
笔者以野牛草幼穗为外植体，初步探索了野牛
草幼穗离体培养再生植株的规律，建立了简单、稳定
的野牛草组织培养再生体系，为通过基因工程和离
体培养技术培育新品种提供理论依据和技术。
1 材料和方法
1．1 实验材料
野牛草的幼穗采自北京市农林科学院院内草坪
地。
1．2 实验方法
1．2．1 培养基和培养条件 MS为基本培养基，除
标明添加3 麦芽糖外，其余都加3％蔗糖，pH值5．8；
愈伤组织诱导和继代是在(25±1)℃、黑暗条件下进
行，分化、生根、壮苗培养均为(25±1)℃、光照条件。
1．2．2 材料灭菌处理 选取 3～10 mm雌穗，5～
15 mm 雄穗，7O％乙醇擦拭灭菌，无菌条件下剥取
幼穗，切成 3 mm大小，置于诱导培养基上。
1．2．3 愈伤组织的诱导培养和继代培养 诱导培养
基为①MS+2．0 mg／L 2，4-D；②MS+2．0 mg／L
2，4-D+10 mg／L AgNO3；③MS+4．0 mg／L 2，4一
D；④MS+4．0 mg／L 2，4-D+10 mg／L AgNO3。1个
月后统计愈伤组织诱导率和 I型愈伤组织频率(见
2．1．1)，并转入3种继代培养基。⑤MS+2．0 mg／L 2，
4一D；⑥MS+2．0 mg／L 2，4-D+3％麦芽糖；⑦MS+
2．0 mg／L 2，4-D+0．1 mg／L 6-BA。同时设置继代2
周和4周后统计Ⅲ型愈伤诱导率(见2．2．1)。
1．2．4 愈伤组织的分化培养 将经继代培养筛选出
的愈伤组织置于分化培养基。⑧MS+0．5mg／L
6-BA；⑨MS+0．5 mg／L 6-BA+3％麦芽糖；⑩)MS
+1．0 mg／L 6-BA；⑧MS+1．0 mg／L 6一BA+3％麦
芽糖，同时设置光照24 h和弱光12 h不同分化条件。
1．2．5 生根培养和壮苗培养 将分化出茎的株丛
转移至生根培养基。⑥1／2 MS+0．3 mg／L IBA；⑩
1／z MS+O．2 mg／L NAA。1个月后统计植株再生
频率。将分化出茎叶和根的再生苗转入 MS培养基
进行壮苗培养。
2 结果与分析
2．1 幼穗愈伤组织的诱导
2．1．1 幼穗大小和雌雄性对愈伤组织形成的影响
野牛草为雌雄异株植物，雄穗和雌穗形态差别较大。
选取 5～15 mm不等的雄幼穗分别接种于诱导培养
基上。从表 1可以看出，在相同培养基上(2，4一D浓度
为 2 rag／L)，雄幼穗小于 8 mm，愈伤组织诱导率为
86．8 0A，形成的愈伤组织大部分结构紧密，呈鲜亮的
淡黄色(见图 1：1)，这类愈伤组织在本系统中被称为
I型愈伤组织；幼穗大于 12 mm且小穗发育明显时，
愈伤组织诱导较困难，出愈率仅有 15．4 。可见，雄
穗的大小及发育程度对愈伤组织诱导率影响明显。野
牛草雌幼穗偏小，取材较难。在相同培养基上雌穗大
于 5 mm时，难以进行脱分化形成愈伤组织，小于
5 mm时，只有少数愈伤组织形成(8．o％～9．7 )
(见表 1)。总的来说，雌穗比雄穗难脱分化。
表 1 幼穗愈伤组织的诱导
Table 1 Callus induction from immature inflorescence
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嚣 5期 辛瑞等 等一野牛草劫船愈协组织的话导艟植诛再生
2 l 2 2，4-D和 AgNO 对幼穗愈伤组织诱导的作
用 当培养基巾 2．4-D敞度垧jJl1到 4 mg／I 时，在
幼神大_、一致的情况下，雄德鱼伤组织f【勺诱导卓为
80 1 ．与附加 2 mg／L 2，4 D的诱导率州比．差异
；廿盯显 但在血侮组织特志 12丛别较大 ．大部分结构
{垫软．颜也灰暗或呈透明状．该愈伤组织被l柞为 Ⅲ型
愈伤纽织。雌穗对 2，1-D讯 旺变化彩响下大．遮可
能与雌能 易脱丹化有关 从表 1辽可 看出．在
!．{一D!m lI_业 1mg／I的J1_f养基 【二附]】【_10mg，l
AgNO ．对雄穗愈伤组织的诱导率鼯响不明且 。但
添加 AgNO 对 1型愈伤占诱导愈伤的比例表现出
增加的也 添加 AgNO 对雌础愈伤诱导． 没有
著影响．在 2mg／L 2．4-D和 l【1mg／L AgNO 的
组 巾．便有 6．5％的 I型虑协组织出现
2 2 愈伤组织的继代培养
2 2 l 6 BA和爱芽糖对愈伤组织继代培 养的影
响 将潍德样诱导培养基上产生的 『 愈佑组织分
别 核 于3刊 继代培养基上 c 莨2，．2 后可啦
熊
： ●
】野 1 雄德淆导出的血 蛆崔 继代培荐巾的Ⅲ型血 蛆 ；3撼膪麻 组织的丹化培养枷枷情况．4愈饰主Il 在
1 0 ／I 6 BA(车) 膏 5 mg／l BA(右)培 养基 的分也比转 ；； 1 0mg／1 6 BA培辞甚 讣化出 茁；6不
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臣 l 野牛草雄糖愈伤组织的诱导和分他
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452 武 汉 植 物 学 研 究 第 22卷
现愈伤组织明显增大，结构紧密易碎，表面出现瘤状
突起，标志细胞开始分化，该愈伤被称作1型愈伤组
织。从表2可以看出，在只含2 mg／L 2，4-D的培养基
上，78 愈伤转变为 I型愈伤组织，其余颜色灰暗，发
育不健康。在含2 mg／L 2，4-D的培养基上添加 3 麦
芽糖，愈伤组织生长缓慢，可见，添加麦芽糖不利于愈
伤组织的继代培养。添加o．1 mg／L 6-BA进行继代培
养，93．6 愈伤组织表面出现瘤状突起(图 1：2)，表
明 2 mg／L 2，4一D结合0．1 mg／L 6-BA的继代培养
有利于愈伤组织向着分化的方向发展。
表 2 野牛草雄穗愈伤组织的继代培养
Table 2 Subculture for callus derived from immature male inflorescence of buffalograss
2．2．2 继代间隔对愈伤组织继代培养的影响 在继
代培养过程中发现每次继代的间隔对雄穗愈伤组织
的培养很重要。随着继代时间的延长，少数表面出现
瘤状突起的愈伤组织开始变得灰暗，4周后底部出现
褐化现象。从表 2可知，4周后 3种继代培养基上的
I型愈伤组织频率都明显下降，而且2 mg／L 2，4-D
与0．1 mg／L 6-BA组合上的nl型愈伤组织下降更明
显，下降到 59．6 。随着继代次数的增加，继代间隔
要求更严，继代间隔超过2周，愈伤质量明显下降。由
此表明野牛草幼穗的继代培养时间不超过2～3周。
2．3 愈伤组织的分化
2．3．1 6一BA浓度和麦芽糖对愈伤组织分化的影
响 将继代1～2次的Ⅲ型愈伤组织分别接种在4种分
化培养基上(见表3)，在见光分化时愈伤组织转绿的
同时出现褐化(见图1：3)。在相同光照条件和分化时
间下，愈伤组织在含1．0 mg／L 6-BA培养基上转绿比
在0．5 mg／L 6一BA上早3～5 d，相应出现褐化现象也
较严重(见图1：4)。但每隔15 d转移1次可减轻褐化程
度，转移2～3次后将再生出芽的愈伤统计为“再生愈
伤”，结果发现在含1．0 mg／L 6-BA培养基上再生愈
伤的频率相对较高，为27．3 ～35．0 (见图1：5)。
对O．5 mg／L 6-BA水平的培养基来说，麦芽糖取代蔗
糖可以促进苗的分化。这不仅表现在再生愈伤频率的
提高(见表3)，而且在相同条件下褐化程度较轻。不添
加麦芽糖的组合，大部分愈伤分化出的是单苗(见图
1：6)，添加麦芽糖有助于丛生苗的分化(见图1：7)。
表 3 野牛草雄穗愈伤组织的分化培养
Table 3 Regeneration of callus derived from immature male inflorescence of buffalograss
2．3．2 光照强度对愈伤分化的影响 由于野牛草
愈 伤在分化时容易发生褐化，设置了弱光(遮光)
12 h进行分化试验。尽管弱光推迟了再生苗出现的
时间，但从表 3可以看出，12 h弱光比24 h强光不
同程度地提高了再生愈伤的出现频率。
2．3．3 继代次数对愈伤分化的影响 对继代不同
次数的愈伤进行了分化对比试验。结果发现，继代
1次愈伤的分化率相对较高(见图2) 继代 2～3次
后，褐化加剧，分化率下降；继代 4次后，愈伤组织几
乎没有分化能力。可见，继代次数可降低野牛草愈伤
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第 5期 李瑞芬等：野牛草幼穗愈伤组织的诱导及植株再生 453
亘
继代次数
No of subcultures
图 2 继代次数对愈伤组织分化率的影响
Fig．2 The efect of subculture number on
regeneration frequency of calus
组织的分化能力，继代次数不宜超过 2次。
2．4 生根培养和植株再生
再生出的野牛草幼苗生长非常缓慢，幼苗基部
的愈伤完全褐化，有些小苗逐渐枯萎死亡。将小苗基
部褐化的愈伤除去，接种在 2种生根培养基上诱导
生根。结果发现，在 1／2 MS+0．3 mg／L IBA组合的
培养基上，生根率为 62．5 (见表 4)，比 1／2 MS+
0．2 mg／L NAA组合有利于野牛草幼苗的生根培
养(见图 1：6，7)，有的小苗不能再生出根，逐渐死
亡。获得的完整再生植株壮苗培养后盆栽成活(见图
】：8)。
表 4 再生苗的生根培养
Table 4 Rooting culture of regenerated shoot
3 讨论
野牛草是雌雄异株植物，本试验分别以雌、雄幼
穗为外植体，发现在相同条件下雄穗比雌穗容易脱
分化形成愈伤组织。这不仅由于形态和生理等方面
的差别造成，而且可能由于内源激素水平不同造成。
Yin和 Quinn认为赤霉素(GA。)调控野牛草雌雄性
别的分化和表达，雄株含有较高水平的赤霉素Ls]。有
研究表明赤霉素可降低植物组织对乙烯等物质的敏
感程度 J。所以，内源赤霉素含量可能是造成雌性和
雄性幼穗脱分化难易的主要原因，这与 Fei等报道
的结果一致[3]。同时得到这样的启发：在取穗之前喷
施 GAs溶液或采穗后浸泡 GA。溶液可能有助于愈
伤组织的诱导，特别是可能提高雌穗的脱分化能力，
这将有待于进一步证实和研究。
本研究在添加 10 mg／L AgNOs后并未发现愈
伤组织诱导率明显增加，但愈伤组织质量有所改善。
在继代培养中添加低浓度的 6一BA有利于胚性愈伤
组 织 的 形 成，这 与 在 结 缕 草 (Zoysia japonica
Steud．)[ 、狗 牙 根 [Cynodon dactylon (L．)
Pers．] 等暖季型草坪草上观察到的结果相同，表
明这些 C4暖季型草坪草对 6一BA的作用 比较敏感。
继代可以扩繁和保持胚性愈伤，但本研究发现继代
次数和继代间隔对雄穗愈伤的分化率影响比较明
显，如果进行继代培养，不宜超过 3次，继代间隔不
超过 3周；如果进行遗传转化，最好在当代进行基因
枪轰击或农杆菌侵染。
野牛草雄穗愈伤组织在分化培养时容易发生褐
化，这不仅与愈伤质量和状态有关，还与分化条件有
关。在本研究中添加麦芽糖不仅可减轻褐化程度，还
有利于丛生芽的产生，这可能与麦芽糖作为碳源可
促进植物组织新陈代谢有关，有利于细胞再分化。弱
光也可在一定程度上减轻褐化，这可能是因为强光
会刺激乙烯产生，进而加剧褐化的产生。分化培养基
中激素种类、浓度合适与否也可能是引起褐化的重
要原因。在本试验中芽分化率较高的 6-BA浓度是
1．0 mg／L，这与实验所用材料的基因型和生长环境
条件有关[3]，但发现较高浓度的 6-BA容易使愈伤
组织较早发生褐化。Fei等提出在野牛草愈伤组织
继代培养中逐步降低 2，4-D浓度同时提高 6-BA水
平，可促进芽的分化和植株再生[9]。
野牛草植株再生过程中分化出的一部分小芽逐
渐枯黄死亡，有关原因及如何提高芽的分化率、成活
率需进一步研究。
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如 加 O
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