全 文 ：植物生理学报 1 8 91 62( 4 ) : 3 33一 34 1
A` a t P勺 tP oy hs i ot lo’ c4 5扭a c i
从棒头草 ( p o加卿。 户嗯` 欠 Ne e ` e 二 s te ud )
幼穗培养获得体细胞胚和再生植株
陈东方 夏镇澳
( 中国科学院上海植物生理研究所)
提 要
棒头草幼穗在含 2, 4一D的 M s培养基上诱导出了胚性、 非胚性和中间型愈伤组 织` 根据
形态 、 淀粉粒等指标可将组成这些愈伤组织的细胞分为三类。 改变培养基中 2 , 4一D 的浓度 ,
能诱导三类愈伤组织相互转变。 从胚性愈伤组织中诱导形成了大量体细胞胚 , 体细胞胚是从
单个原胚细胞直接发育而来 , 它们能正常萌发 、 再生小植株。 这种再生能力现已保持了 34 个
易 小植株移植在土壤中可以正常生长 、 分粟 、 开花和结实。
关镜词 : 棒头革 , 幼称培养 ; 体细胞胚 , 再生植株
植物细胞和组织培养是高等植物细胞工程 、 基因工程和进一步改 良农作物的重要基
础之一 (罗士韦 19 7 8) 。 禾本科植物的离体培养是此领域中一个引人注意的研究课题 。
近年来 , 据不完全统计 , 有四十余种禾本科植物经组织培养得到了再生完整植株 , 并且
一在主要的农作物及一些牧草等植物的离体培养中观察到了体细胞胚发生的现象 (王大元
1 0 5 4 , 周俊彦 1 9 8 1 , 夏镇澳和宋永根 19 8 4 , C o n g er 1 9 5 2 ) 。
已知从外植体所诱导 的愈伤组织有胚性和非胚性的区别 , 但对这两类愈伤组织的关
系 、 它们的细胞组成和是否仅有这两类愈伤组织存在等方面尚不清楚。 弄清这些间题将
有利于控制一定类型愈伤组织的形成 , 对探索禾本科植物再生植株的途径有着重要钓意
义 , 也是解决禾本科植物原生质体培养这一难题的必要基础。 另外 , 在体细胞胚发生的
t一研究中 , 尚缺少系统完整的组织学观察。 本文报道棒头草幼穗培养获得体细胞胚及再生
植株的一些结果 。
材 料 与 方 法
培养基用 M u r a s h i g e 和 S k o o g 的无机盐及有机成分 , 附加蔗糖 30 9 / l , 肌醇 20 0 功 g / l为 基本
成分 , 其它附加物及激素的种类和浓度因培养目的不同而异 (表 1 ) 。 所有培养基中均加入 0 . 7 %琼脂
粉 , PH 值调至 5 . 8 , 高压灭菌。
当棒头草 (oP 加昭 o左沪咭口尤 N e s 0 S t eu d) 幼穗长度为 10 ~ 30 、 m m 时 , 将幼穗连同旗叶一起切
下 , 经流水冲洗 , 用 75 % 乙醇表面消毒 1 m in 。 .以后操作都在无菌条件下进行。 剥去旗叶 , 将幼穗取
出 , 切成 2~ 3 mm 长的切段 , 接种在 M s : 培养基上。 长出愈伤组织后 , 每 25 天左右继代一次。 继代
在 M s ; 、 M s : 和 M s : 三种培养基上循序进行 , 并周而复始 (即砧 lS , M s :今 M S: , M s : … … )。 出现
不同类型愈伤组织后 , 将各类愈伤组织分开 , 再分别在不同培养基上继代。
29 5 5年 1 1月 1 2日收到 .
33 4 植 物 生 理 学 · 报 12 卷
衰 1
T a bl
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各种培养签中的激紊组份
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培 养 基
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2
,
4一 D
(功 g / l )
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*
M S
: “ 培养基中只含1 2/ 的 M S 无机盐
M S
I I : m e d iu m ( 112 M S in o馆 a n ic s a l ts ) .
每次继代时 , 取部分愈伤组织 , 用醋酸洋红和碘一碘化钾溶液染色 , 压片后观察其细胞形态 , 并
分类计数不同形态的细胞。
体细胞胚发生的组织学观寮 将材料用 F A A 溶液固定 , 石蜡包埋 , 旋转式切片机切片 , 厚度为
8~ 12 拜m , 福斯特靴酸一三氯化铁染色 , 光学显微镜下观察。
体细胞胚的扫描电镜现察 材料用 2 %戊二醛和 1 %锹酸双固定后 , 再用 0 . 1 m ol / L p H 7 . 2 的
磷酸缓冲液洗涤 , 乙醇梯度脱水后置于乙酸乙醋中。 脱水后的材料用 C O : 法 临界点干 燥 , 镀金 ,
sI I P s
一
13 0 扫描电镜下观察。
实 验 结 果
~
、 愈伤组织诱导及不同类型愈伤组织形成
幼穗切段接种在 M S : 培养基上两周后 , 愈伤组织从小花原基和穗轴切 口处长出 (图
版 I , l ) , 诱导频率为 80 % , 在继代培养过程中 , 愈伤组织出现不同类型 。 第三代 (M S :
培养基上 ) 出现第一类和第二类愈伤组织 。 到第五代 ( M S : 培养基上 ) 出现了第三类愈伤
组织。 三类愈伤组织的特点分 别见表 2 及图版 一 I , 2 、 3 、 4 。
表 2 三类愈伤组织的比较
T a b le 2 T h
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r e n t e h a r a e t e r is t ie s o f thr
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类 型
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再生体细胞胚的能力
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含相应类型细胞数
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c e l l t yP
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白 色、 V h it e
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淡 黄 色
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光滑 , 颖粒状
s m o o t h
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K no bby
7 0一 8 0
6 0一7 0嗯糙跳ó粗
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0一 10 6 0一8 0
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Jr且 1冬ù引JO卜aL
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. 体细胞胚发生能力以愈伤组织被转移到 M S ` 培养基上后当代计数为准 。
T h e nu m b
e r o f s o m a t i e e m b r y o s w as e o u n t e d in t h e if srt p
吕 , 曰
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M S
一 m e d iu m
.
. 相应类型细胞分别指三种不同类型的细胞 , 详见表 3 。
oO m
s P0 n id n g e e ll s : 欢 T ab le 3 .
4期 从棒头草 (oP妙 og o n 沂烤a x N e s o st e u d )幼穗培养获得体细胞胚和再生植株 335
第一类是典型的胚性愈伤组织 , 第二类是典型的非胚性愈伤组织 。 而第三类是中间
型 , 它在组织形态上和非胚性愈伤组织相似 , 但比之增殖快 , 在细胞形态上却和胚性愈
伤组织相似 , 并具有体细胞胚发生能力 。
对愈伤组织的压片观察表明 , 组成愈伤组织 的细胞也可以分为三类 。 各类 细胞的特
点归纳如表 3 。
表 3 三类细胞的特点
T ab l
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3 T h
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类 型
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C e , , w a l l
细胞形状
C e l l s h a P e
细胞排列
C e l l a们冠 n ge血 n t
液 泡
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淀粉粒
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核染色
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紧密、 规则 l 不 明 显
16一 20
薄
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4 0一 2 8 5
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T h i n
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疏松 、 不规则 ! 大助 o s e 愁n d l’
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类似分生组织
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小
h住既 i s t e m a t ie 一 l i ke ! Sm a l l
经检查 , 在愈伤组织还未表现出类型差异时 , 一块愈伤组织中同时含有三类细胞。
随着愈伤组织在含有不同浓度 2 , 4。 的培养基中交替继代 , 各类细胞在适合自己增殖
的条件下生长 , 形成三类愈伤组织一各含有大部分相应类型的细胞 (表 2 ) 。 所以 , 三类愈伤组织的出现是三类细胞在适合各自生长条件下增殖的结果 。
二 、 在不同激案条件下三类愈伤组织的相互转变
各类愈伤组织的形成 、 增殖以及相互转变和 M S 培养基中所含 2 , 4一D 浓度 有 关。
表 4 列出了在第八代和第十八代继代培养中 , 三类愈伤组织分别在含 2 , 40 0 . 1 、 1 . 0 、
.2 0 m g l/ (均含有 6%椰乳 )的 M S 培养基中的转变情况 。 在第八代 , 各类愈伤组织在继 :
代培养中随培养基中所含 2 , 4 一D 浓度的不同 , 容易定向转变为其他类型的愈伤组织 。 在
2 , 4一D 浓度为 0 . 1 m g / l 的条件下 , 三类愈伤组织都大量地转变为第一类愈伤组 织 ; 而
在 2 , 4一 浓度提高到 2 . 0 m g / 1 时 , 三类愈伤组织都大量转变为第二类 愈 伤 组 织 , 在
2 , 4一 浓度为 1 . 0 m g / 1的条件下 , 除第二类愈伤组织有一部分保持其特点外 , 其余 两
类则较多转变为第三类愈伤组织 。
在第十八代 , 虽然仍有部分愈伤组织因培养基中激素条件不同而转变为其他类型的
愈伤组织 , 但是却不如第八代那样很容易受培养基中 2 , 4一D 浓度的影响 , 而是趋 于 保
持其本身的特点 , 这可能与外源激素在细胞中的积累有关 。 因此要大量获得一定类型愈
伤组织 , 只有采用在一定激素条件下多代诱导的方法 。 诱导时所用 的激素条件和第八代 :
的相似 。
三 、 体细胞胚发生
第一类愈伤组织在 M S 。 培养基上或移到 M S 。 培养基上后 , 可以看到体细胞胚发 生
(图版 I , 7 ) 。 对体细胞胚发育的各个时期进行观察表明 : 它的发育过程和禾本科植物的
植 物 生 理 一 学 报 1 2卷
裹 4各类愈仿组织在各种 2, 4一D 浓度条件下相互转变的颇率 ( % *)
介 6万e 4 仆。 扮e q u o e v or 面 e e 灯, 。 or e a l一1c h a n g in g ae 比 。 山 er 0 m e d i。 iw 出
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代 数 p a s a g e 嘛 .愈伤组织类型 `
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愈伤组织类型 b
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.2634
。
7
.a 姿入的愈伤组织类型 Icno ul at e d ca il b
. 形成的愈伤组织类型 T h e ca m for m de多于60 块愈伤组织计算多 . 拓 w as co u n t e d ” n切陀 t h a n 60 。 al i.l
合子胚发育过程类似 , 是从单个原胚细胞开始的。 此原胚细胞首先分裂为二 (图版 I , l ) ,
再继续纵向分裂形成一长列细胞 (图版 亚 , 助 , 然后顶部细胞开始横向分裂 , 继而不规则
一分裂 , 形成一细胞团 (图版 l , 3) 扩进而又形成球形胚的初期结构 (图版 l , 4) , 而 “ 基
:细胞 ” (b as al 6C 11)停止分裂或只有少数儿次分裂 , 这样便形成了带有胚柄的球形胚 (图版
I
,
6 )
。
球形胚发育有两个方向。 一是先在球形表面出现凹沟状和凸起状的皱折结构 , 然后
形成具有盾片 、 胚芽鞘和胚根的完整体细胞胚 (图版 l , 6) 。然而 , 在大多数培养条件下 ,
特别是在培养基中含有较高浓度的 2 , 4` D ( 1 . 0~ 2 . 0 m g l/ )时 , 球形胚停止发育 , 转向
一细胞增殖 。 细胞进行快速而不规则分裂 , 结果形成` 较大的颗粒状胚性愈伤组织 。 这种
愈伤组织表面的几层细胞又开始有规则地纵向分裂 , 一 重复体细胞胚的发育过程 , 形成次
级体细胞胚 (图版 l , 1 1 ) 。 次级体细胞胚发育至球形胚时 , 在不同的激素条件下又重复
上述过程 , 周而复始 , 体细胞胚在继代培养中就得到了增殖 。
在第三到第十代的继代培养过程中 , 常可看到很典型的体细胞胚形成 , 但在以后 ,
观察到不正常的体细胞胚出现 , 其数目随继代培养次数的增加而增加 。 不正常体细胞胚
:的类型有 : 盾片膨大 , 形成叶状体 , 在一个盾片上有两个以上的胚芽鞘 (图版 l , 1幻 , ’
缺少胚芽鞘或胚根鞘等 。
四 、 体细胞胚萌发及植株再生
体细胞胚形成之后 , 可以在原培养基或 M S 。 、 M lS l : 培养基上萌发形成小植株 (图版
l
,
8)
。 体细胞胚萌发时 , 观察到两种不正常萌发现象。 一种是不完全萌发 , 包括只有
穿而无根 , 或只有根而无芽 。 另一种是早熟萌发 (rP ce o io us g er m in at ion ) , 即体细胞肚
4期 从棒头草( P o妙 n g o oj沁 a xN es e xs tu e) d幼穗培养获得体细胞胚和再生植株 37 3
还未表现出完整的胚结构之前就萌发了 。 萌发时盾片膨大形成一叶状体 , 在叶状体基部
长出芽 。
植株再生也可以在愈伤组织形成后 , 通过不定芽分化来完成 (图版 I , 10) 。 但这种
现象随愈伤组织继代次数的增加很快消失了 , 而大部分再生植株都是通过体细胞胚萌发
的途径完成的 。 在体细胞胚萌发再生小植株时 , 还观察到有 白化苗 , 其数目随继代次数
的增加而有所增加 。 由于可以不断地诱导胚性愈伤组织产生 、 不断地得到体细胞胚 , 因
此 , 试验材料在继代培养 3 4个月后 , 仍保持再生小植株的能力 。
取有完好根系的再生小植株 , 直接移栽到土壤中 , 可 以看到再生植株能正常生长 、
分孽 , 并开花结实 (图版 亚 , 9) 。
讨 论
近年来 , 许多研究者都发现 , 禾本科植物经离体培养 , 可以产生胚性愈伤组织和非
胚性愈伤组织 ( D a l e 等 1 9 5 3 、 N ab o r 等 1 9 8 3 , W e nr i e k e等 10 5 2 , V a s i l 等 1 9 5 1 ) 。 我们
在证实和比较这两类愈伤组织的同时 , 还发现有中间型愈伤组织 。 这 三类愈伤组织是以
三类相应类型细胞 的存在为基础的 , 在不同的外源激素条件下 (主要是 2 , 4一D 浓度的变
化 ) , 三类细胞增殖便形成三类愈伤组织 , 而且还可以相互转变 。 这就可以在愈伤组织的
继代培养中 , 通过调节外源激素浓度来达到控制某特定类型愈伤组织的形成 , 特别是胚
性愈伤组织和中间型愈伤组织 。
V as il ( 19 8 2 ) 认为 , 禾本科植物在离体培养过程中产生体细胞胚是一个 普 遍 的现
象 , H a n il n g 等 ( 1 9 8幻从鸭茅草 的叶片培养中直接产生体细胞胚 。 那么 , 体细胞胚是怎
样发生的? 特别是在离体培养条件下它是怎样发育的 ? 我们在离体培养条件下 , 观察到
棒头草体细胞胚是从原胚细胞直接发育而来 的 , 其过程同禾本科植物的合子胚的发育过
程类似 。 但是 , 次级体细胞胚的产生情况较为复杂 。 在离体培养条件下 , 随继代次数的
增加 , 不正常体细胞胚的数目也不断增加 。 s h ar P 等 ( 19 8 0) 认为这是一个较为普遍的现
象。 对此 尚待深入研究 。
在离体培养中 , 禾本科植物再生植株 的途径是一个有争议的问题 , 有 的强调 是器官
发生途径 ( E v a n s 等 一9 5 1 , W e r n i e k e 1 9 8 2 ) , 有 的则认为是体细胞胚发生途径 ( V a s i l
19 82 )
。 本试验 中则证明这两个途径是同时存在的 , 器官发生途径在培养的前几代出现 ,
但它不易受外源激素控制 , 继代培养几次后便消失了 。 体细胞胚 的出现虽然是在第三代
以后 , 但这一途径容易为外源激素所控制 , 而且植株再生能力保持的时间长 。 目前棒头
草材料已继代 3 4次 , 仍具有植株再生能力 。 尽管通过体细胞胚途径能较好地保持 再生能
力 , 但随着离体培养时间的延 长 , 白化苗和不正常植株的比例也不断增加 , 这仍是一个
值得研究的问题 。
致谢 : 我所陈乃先 、 王六发同志协助拍摄照片。

图 版 说 明
P l
a 切 E XP la na t i on
I
1 : 幼穗切段在 M s: 培养基上 , 15 天后从切 ’口处及小花原基处长出愈伤组织 ( x 巧 ) 。
T比 cal il 认 it ia t e d ft o m t he cu t a n d fl or al rP imor d i
a
0 M S
: 血d iu m a ft e r 15 d娜乙
o f i n i t i a l e u lt uer ( 欠 15 )
.
2 : M S
。 培养基上的第一类愈伤组织 ( x 25) 。
T l l e t yP
e 2 e a l lu s on M S
: m e d iu m ( x 2 5 )
-
3 : M S
: 培养基上的第三类愈伤组织 ( x 25) 。
T l l e t yP
e 3 e a l lu s o n M S
: m e d iu m ( x 2 5 )
.
4 : M S
: 培养基上的第二类愈伤组织 ( x 2 5) .
T he
一
t y eP 2
e a l l u
s o n M S
: m e id u m ( x 25 )
.
1 : 原胚细胞第一次分裂 (箭头) ( x 1 000) 。
hT
e f i o t d iv is i o n o f 少 e 一 e m b r yo e e l l 认 刀i t阳 ( a ” , w ) ( x 100 0 ) .
:2 原胚细胞纵向分裂为一细胞列 ( x 10 0 0) 。
T址 v er t i e a l d iv i s io n o f p er 一 e m b r卯 e e l ls ( x 10 0 0 ) .
3 : 原胚细胞开始横向分裂 ( x 10 00) .
T h e t
anr
s v e钧 a l d i v i s io n o f P r e一 e m b yr o e e l l s ( x 2 00 ) -
4 : 球形胚前期结构 , 箭头指胚柄 ( x 1 000) 。
1 l l e P r e 一 g of b u lar os m at ic
e
m b
r
oy
, t h e a r r o w OP i
n t s s us P
e n
so
r
( x 1 0 0 0 )
-
5 : 典型的球形胚 , 箭头指胚柄 ( x 1 60) 。
T h e t yP ica l g l
o b u l
a r so m at ie e m b r yo
, t h e a r r口 w po 认 t s s u s讲咖 r ( x 1 6 0 ) -
` : 典型的成熟体细胞胚 , 箭头指胚芽鞘 ( x 63 ) 。 ,
hT
o tyP i
e a l s o m at ie em b r洲 纽 沉打口, ht e a r r ow OP i n st co l eo tP i le ( x 6 3 ) .
7 : 第一类愈伤组织表面上形成的成熟体细胞胚 ( x 4 3) .
叭。 t即i c a l som at ic e m b r yo o n ht e s u r faC e o f t y p e 1 aC ll u s 认 。 iotr ( x 4 3 ) -
:8 体细胞胚萌发再生小植株 。
P la n t let s fo r m a t io n v ia g e r m i n at i o n o f so m at ie e m b r yo
s .
9 : 成熟的再生植株 , 箭头指花 .
M at u
r e r e g e ne
r a t e d P l a n t s
,
ar r o w P o i n t s f lo w e r
·
1 0: 不定芽分化 ( x 1 60 ) 。
叨 l e id fe r e nt i at io n o f a vd e nt it io us b u d ( x 1 6 0 ) .
1 : 次级体细胞胚形成 ( x 160 ) `
hT
e eS co n da
r丫 so m at i c e m b r扣 fo r m at fo n ( X 2 6 0 ) · 、
12 : 一个盾片、 两个胚芽鞘的畸形胚 ( x 75) 。
hT
e a
b on
r m a l so m “ t ie e m b r yo w i th on e sc ut e l l u m 姐d wt o co l eO P t i le s ( x 7 5 ) ·
34 0植 物 生 理 学 报 1 2卷
参 考 文 献
罗士韦 ( 17 8) 9植物组织与细胞培养研究工作的进展及其应用 。 植物生理学报 t1 9一1 2
夏镇澳 、 宋永根 ( 1 984 )谷子幼穗培养的体细胞胚胎发生和植株再生 。 科学通报 1 4 ( 8 92 ) 9: 8 3
周俊彦 ( 1 8 91 )植物体细胞及组织培养中产生的胚伏体 1 . 植物体细胞胚状体发生 。 植物生理学报 协 38 9一 3盯
王大元 ( 1 984 )禾谷类植物的细胞培养和体细胞胚胎发生 . 细胞生物学杂志1 94 8( ) 6, 16 一 19
、
Oo
n ge
r B V (19 8 2 ) A g
r o n o m i e e or P s
.
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n g e r B V (
e d ) C lo in
n g A gr i
e u l t u r a l P la n st v i a in iV t r o T e e hn i q u
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,
D a l t o n SJ (1 9 83 ) I mm
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, 凡对cau , P h le u 二 a n d D a e妙115 . 之助 dn ·
z e nP hys io l 1 1 1
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-刁 5
E va
n s D A
, 外a rP W R , F l ie k C E ( 19 8 1) G r o w t h a n d be h va io r o f e e ll e u l t u r es : e m b yr o g en es 七 a dn o r g a n o -
g e n e s is
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e ul t u r es
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a印 WR , S o n d a h a l M R , C a l d a s L S , M a ar fa S B (1 9 8 0 ) hT 。 灿iys o lo盯 o f 动厉otr a s ex u a l e m b yr o g e n es 妇. }
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