全 文 ：武汉植物学研究 2006，24(3)：191～195
oarnal of Wuhan Botanical Research
藻蓝蛋白裂合酶 CpeS色氨酸定点诱变及体内重组功能研究
张晓刚，周 明 ，胡 勋，赵开弘
(华中科技大学环境科学与工程学院，武汉 430074)
摘 要：为了研究藻蓝蛋白13亚基Cys-84裂合酶cpeS结构与功能的关系以及色氨酸残基对于该酶功能的影响，
构建了藻蓝蛋白13亚基Cys-84裂合酶cpeS的两个色氨酸突变体，分别为cpeS(W14I)和cpes(W75S)。通过体内
重组检测酶活性的变化，研究色氨酸残基的突变对裂合酶催化活性的影响。重组结果显示：突变体 CpeS(W14I)的
催化活性几乎完全丧失，为野生型的8％；突变体CpeS(W75S)的催化活性为野生型的76％。由此推测，第 14位色
氨酸可能是 CpeS酶活性的必需氨基酸，其所处的位置可能是裂合酶cpeS的活性位点。
关键词：CpeS；定点诱变 ；体内重组；活性位点
中图分类号：Q503；Q949．2 文献标识码：A 文章编号：1000-47ox(2006)03-0191-05
Site-directed Mutagenesis of the CpeS of Phycocyanin and
Study on the Function with Reconstitution in vivo
ZHANG Xiao-Gang，ZHOU Ming’，HU Xun，ZHAO Kai-Hong
(Colege ofEnvironment Science and Engineering，Huazhong University ofScience and Technology，Wuhan 430074，China)
Abstract：To study the structure-function relationships and the efect of the tryptophan residues to the
CpeS of phycocyanin，two mutants，CpeS(W14I)and CpeS(W75 S)，were constructed．The lyase activity
of these mutants were tested by reconstitution v／vo．to study the efects of tryptophans to CpeS．The re-
suits shows that：CpeS(W14I)has hardly lyase activity．Comparing with the wild CpeS，the lyase activity
of CpeS(W14I)and CpeS(W75S)is respectively 8％ and 76％．From this，it’S deduced that：the 14th
tryptophan residue in CpeS may be essential amino acid to CpeS，an d it may locate in the active site of
CpeS．
Key words：CpeS；Site—directed mutagenesis；Reconstitution in vivo；Active site
藻胆蛋白(phycobiliprotein)是存在于蓝藻、红藻
和隐藻中的光合作用捕光色素蛋白质，根据其吸收
光谱特征，藻胆蛋 白可分为 4类：藻红蛋白(简称
PE)，藻红蓝蛋白(简称 PEC)，藻蓝蛋白(简称 PC)，
别藻蓝蛋白(简称 APC)⋯。它们由藻胆色素与相
应脱辅基蛋白半胱氨酸的巯基以硫醚键共价结合而
形成，在蓝藻体内，这种连接反应大部分由相应的裂
合酶催化。
本实验室的研究结果发现，一种编号为altO617
的基因的编码蛋白是 B-CPC和 B-PEC中第 84位
Cys， ．APC和 B．APC中第82位 Cys与 PCB连接的
裂合酶，被命名为藻蓝蛋白裂合酶 CpeS【2 J。通过与
其它同源蛋白序列的比较和分析，找到了2个同源
性较高的保守性色氨酸位点，它们分别位于CpeS氨
基酸序列的第14和75位，估计它们可能处于该裂
合酶的活性位点。
在生物体内，PCB的生成源于亚铁血红素，在亚
铁血红素氧化酶 HO(编码基因为ho1)的催化下，亚
铁血红素转变为胆绿素Ⅸ J，胆绿素Ⅸ 在 PCB氧
化还原酶 PcyA(编码基因为／wyA)的催化下，失去4
个电子，生成藻蓝胆素 PCB 。将两种基因 hol和
／wyA在大肠杆菌中共表达，可以实现 PCB的生物合
成 。
本实验通过定点诱变技术构建了2个色氨酸突
变体的 pET表达质粒，并分别转化大肠杆菌，与脱
辅基蛋白表达质粒 pETDuet．cpcB(C155I)和色素氧
化还原酶表达质粒 pACYCDuet-hol-pcyA一起在生
物体内共表达而进行相应的体内重组。由于有些
CpeS的突变体蛋白在超声后处于沉淀中，难于进行
体外重组，所以采用体内重组的方法进行检测和酶
收稿日期：2006—03-27。修回日期：20O6—05—17。
基金项目：国家自然科学基金资助项 目(30540070)；教育部新世纪优秀人才支持计划项目(NCET一04—0717)。
作者简介：张晓刚(1981一)，男，汉族，硕士研究生，从事蓝藻生物化学与生物技术的研究。
· 通讯联系人(E—mal：ganggewo2002@163．tom)。
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武 汉 植 物 学 研 究 第 24卷
活性的比较。大肠杆菌体内生成的 PCB在 CpcS及
其突变体蛋白的催化下，可以连接到 CpcB(C155I)
第 84位半胱氨酸的巯基上，生成色素蛋白 PCB—
CpeB(C155I)。通过生成产物的量与裂合酶的表达
量来比较这两个色氨酸残基对酶催化活性的影响，
确定色氨酸是否在 CpeS酶催化活性中起到关键性
作用，从而为 CpeS结构和功能的研究提供相关信
息。
1 材料与方法
1．1 材料与试剂
大肠杆菌菌株 TG1、BL21为本实验室保存；克
隆载体 pBluescript SK(+)为 Stratagene公司产品；
表达载体 pET 30a(+)、pACYCDuet一1、pETDuet一1
购自Novagen公司。重组质粒 pBlu—cpeS、pET—cpeS、
pETDuet—cpcB(C155I)、pACYCDuet—ho1-peyA为本实
验室构建。DNA回收试剂盒、T4 DNA连接酶和限
制性内切酶 SmaI、XhoI、EcoRV、XbaI为 MBI公司产
品；Taq DNA聚合酶为 Biostar公司产品；IPTG为
SABC公司产品；亲和层析介质购自Amersham Phar—
macia公司。引物合成以及测序由北京奥科生物技
术有限责任公司完成。
1．2 引物设计与合成
为构建突变体 CpeS(W14I)和 CpeS(W75S)，
根据 cpeS已知的序列，设计了 4条引物，以 pBlu—
cpeS为模板进行 PCR扩增。
引物 P1：5’．GCGCCCGGGATGA TCGAAGA．
肼 -3’；引物P2：5’一CGCCCCGGGATGA T．
TGAAGAGTIr几[’ITGAATrGAGTGCAGGTAAGATCT．
TTrCTC-3’；引物 P3：5’．TCTYCATCTGATrCCATA．
GTGCCGTYCCA-3’；引物 P4：5’．GGGCTCGAGGTT．
TrAACTrGACGCAGAATY-3’。
其 中引物 P2和 P4用于构 建突变体 CpeS
(W14I)。由于在 P2中直接引入了第 14位突变，将
色氨酸(密码子为 TGG)突变为异亮氨酸(密码子为
ATC)，所以只需要进行一次 PCR。P1、P3、P4用于
构建突变体 CpeS(W75S)。由于通过中间引物引入
突变位点，将 CpeS氨基酸序列中的第 75位的色氨
酸(密码子为TGG)突变为丝氨酸(密码子为TCA)，
得到突变体的基因cpeS(W75S)，所以需要进行2次
PCR。
1．3 突变体的克隆与序列测定
利 用常 规 PCR (见表 1)和 mega primer
PCR (见表 2)，以重组质粒 pBlu．cpeS为模板扩增
出两个突变体的基因片段。
表 1 突变体基因 (Wl4I)的 PCR条件
Table 1 PCR reaction condition of cpeS(W14I)
表 2 突变体基因 (W75S)的 PCR条件
Table 1 PCR reaction condition ofcpeS(W755)
这些基因片段经过 SmaI与 XhoI酶切后，与经
过同样双酶切的克隆载体 pBluescript SK(+)连接，
然后转化大肠杆菌 TG1，用含有氨苄青霉素的 LB
培养基平板进行筛选。根据质粒酶切图谱初步鉴定
阳性重组子。重组质粒经 SmaI与XhoI酶切后回收
的外源片段，与经过 EcoRV与 XhoI酶切后回收的
表达载体 pET 30a(+)进行连接反应，再转化大肠
杆菌 BL21，用含有卡那霉素的LB培养基进行筛选。
根据 DNA电泳、蛋白质电泳进行检测，进一步鉴定
阳性重组子。将初步鉴定正确的菌种进行测序。
1．4 多个质粒的转化与体内重组菌种的筛选
将 质 粒 pACYCDuet—ho1-pcyA、pETDuet—cpcB
(C155I)以及一种突变体基因的 pET重组质粒转入
大肠杆菌 BL21，得到 2种突变体的体内重组菌种；
同时增加了一个对照组：将 pACYCDuet．ho1-pcyA、
pETDuet．cpcB(C155I)以及野生型 pET—cpeS转入大
肠杆菌 BL21，得到一种野生型的体内重组菌种。
以上菌种均以含有卡那霉素、氯霉素和氨苄青
霉素的 LB培养基平板进行筛选。
1．5 蛋白的表达与纯化
表达载体 pET 30a(+)和 pETDuet一1的 rI7启
动子下游均含有6个组氨酸的密码子 ，由此构建的
重组质粒在大肠杆菌中诱导表达得到的外源融合蛋
白N端都带有组氨酸标签，故可采用亲和层析法进
行提纯。
将3种过饱和的体内重组菌液分别加入200 mL
含20 i~g／mL卡那霉素、100 Ixg／mL氨苄青霉素和
30 mL氯霉素的LB培养基中，37℃培养至OD鲫=
0．5—0．7，加入终浓度为1 mmol／L的IPTG，诱导表
达 12 h后，离心(8000 r／min×3 min)收集细胞 ，双
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第 3期 张晓剐等：藻蓝蛋白裂合酶 Cpe5色氨酸定点诱变及体内重组功能研究
蒸水洗 1次，用 8 mL stal~bufer(0．5 mol／L NaCl，
20 mmol／L磷酸钾缓 冲液，pH7．2)进行重悬，超声
150次，离心(8 0oo r／min×15 rain)得到上清。上清
液采用镍离子螯合层析柱进行纯化。最后用2倍层
析柱体积的500 mmol／L嘧唑进行洗脱收集。过柱提
纯的产物用透析液(O 5 mol／L NaCI 50 mmol／L磷
酸钾缓冲液，pH7．2)透析过夜，以除去小分子杂质。
1．6 光谱测定与尿素变性
经过层析柱提纯的产物 ．取部分稀释至619 nm
处的吸收值小于 0．I，测定吸收光谱和荧光光谱。
取部分透析后的产物用酸性尿素(8 mol／L，pH 2)变
性，测定变性后色素蛋白的吸收光谱。
吸收光谱用 Perkin Elmer Immbda 25型紫外可
见光谱仪进行钡j定，紫外可见光谱扫描范围为300～
800 nm，扫描速 度 为 960 nm／min，狭缝 宽度 为
1．0 nm；荧光光谱用 Perkin Elmer LS45型荧光光谱
仪进行测定 ，荧光光谱扫描速度 l 200 nm／mm，狭缝
宽度5．0lqm
1．7 SDs·PAGE与色素蛋白锌电泳
取等量的过柱提纯产物，加人终浓度为 1O％的
三氯乙酸，于 一20℃放置 l5 rain，使提纯的蛋白沉
淀。沉淀用丙酮洗三次，晾干后加入上样缓冲液和
巯基乙醇(9：1)，100℃煮沸 5 mln，离心后，各样品
取等量上清进行SDS—PAGE电泳 电泳完毕后，于
室温下将电泳凝胶用 1．5 moL／[ 醋酸锌溶液浸泡
15 min，在280 ilm紫外灯下检测并照相 之后用
考马斯亮蓝 1250染色液进行染色，脱色后进行扫
描。扫描后 的图片用 Photoshop 6．0(Adobe)对
CpeS、CpeS(W14I)和 CpeS(W75S)蛋白条带的光
强进行半定量测定，从而估计体 内重组过程中起催
化作用的可溶性蛋白的相对表达量。
2 实验结果
2．1 突变体的克隆、表达和鉴定
2，1．1 突变体克隆的 DNA检刮
引物P2和 P4采用常规的PCR方法．经过一次
PCR扩增出大小为588 bp，含有 cpeS(W14I)目的基
因的片段。采用 Mega primer PCR方法，引物 P1和
P3经过第 1次 PCR，得到大小为 242 bp的基因片
段，将第 1次 PCR的回收产物作为上游引物与引物
P4进行第 2状 PCR，扩增 出大小为588 bp，含有
cpeS(W75S)目的基因的片段．
以上的扩增片段经过双酶切后与 pBlu双酶切
载体进行连接，转人大肠杆菌 TGI，其重组的pBlu
质粒通过SrulI与 XhoI的双酶切进行检测，其 目标
片段长度为 578 bp 目标片段与 pET双酶切载体
的重组质粒可以通过 Xhol与 XbaI双酶切进行检
测，其目标片断的长度为756 bp DNA琼脂糖凝胶
电泳结果与预期相一致(见图1)。
譬叠
1．pET~Te．q(W14I)酶切产物 2 pBlu~Tm,S(W141)酶切产物；3．
cpe5(W14I)PCI1产物；4 DNA分子量标搬；5 DNA丹于量标
准；6 gpeS(W75S)一班 PCR产物 ；7．cTeS(W75S)二趺 PCR产
物；8 pBlu唧J (w75S)酶切产物；9 pF．l叫 (W75S)酶坷产物
1 pET~peS (W141 J dlgCsted by XhoI und I；2．pBlu-cpe8
(W14I)digested by hol and Sma1；3．PCR of rpeS(WI41)：4
DNAladder；5 DNA lsdder；6．ti~t PCR of cpeS(W75S)；7．See—
ond PI：R of cpeS(W75S)；8 p1]lu~Te,SfⅣ75S)dige,~ed by Xhol
d Smal：9 pET~~S(W75S dige；qed by Xhol d I
圈 1 cpeS cwI4I)和印 (W75S)的琼脂糖凝胺电泳
Fig l Agaro~e gel eleetrophoresis of cpeS(W14I)
and coeS(W75S)
测序结果表明，cpeS(W141)和 cpeS(W75S)均
与预期相吻台 G)rIv分析表明，这些突变对蛋白二
级结构的影响很小。
2．1．2 突变体蛋白的SDS-PAGE检测
突变体基因cpeS(W14I)和cpeS(W75S)以大肠
杆菌 BIll为宿主菌进行表达，目的蛋白的分子量
应该是 25．8 kD左右。表达产物通过 SDS—PAGE电
泳，目的蛋白的大小与预期丰H吻合(见图2)
由蛋白质电泳图谱可 看到，突变体蛋白CpeS
(W141)和 CpeS(W75S)在细胞中都有大量的表达。
但是 CpeS(WI4I)在超声上清中的含量很少，而
CpeS(W75S)在超声上清中的含量相对较大。这两
种蛋白在超声后的沉淀中部有较大量的存在 而根
据本实验室的经验，野生型CpeS几乎全部存在于超
声后的上清中．沉淀中含量很少。这说明在发生突
变后，裂台酶的水溶性发生丁降低，这可能会对裂合
酶的催化活性产生影响。
2．2 CpcS及其突变体体 内重组产物的光谱检测
将多个质粒转化的菌株用方法 1．5得到表达上
清，然后采用镍离子螫合层析柱纯化．测定提纯产物
的吸收光谱和荧光光谱。结果显示，产物的最大吸
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武 汉植 物 学 研 究 第 24卷
2 3 4 5 kD 6 # 9 _II kD
一 ● ． n 2 一 66 2
黼 il}
蓁
1．CwS(WI41)表达沉淀制样；2．cp (w】41)表进上清涮样；
3．c (W141)表述划胞黼样；4蛋白质分子量标准；5．表达载
体pET诱导表过产物；6 cpes( 5S)表达沉淀制样；7．c
(W75s】表达上清制样：8袅造载蚌p／~l"诱导表达产物；9蛋白
质分子量标准；10．c (W75S，丧逃细jf0l制样
1．Pintein 帅 the pI l叫 e 0r CF s(wl4I)；2 Proteln 3mthe
舶p m日 t CpeS(w1411；3 pn~teln f∞m cp cw14I)既一
p陀蚪 {n E “ BI卫l：4．P ~lein mo】eeular weight standard；5
r indueed wi山 rG ：6 Protein from the p~ ipiLate nf eves
(哪 S)；7 Pn：tein the pc 岫 t of cI Cw 5S】；8．pET
{nduv~ed with IG：9．Pmtein molecular weight an ：10．P
lein from GoeS(W75S expressed in E B12l
围 2 突变体 CpeS{W14I)、cpes(W75S)的
SDS-PAGE图谱
Fig．2 SDS—PAGE of cp (W141)and CV~S(W75S)
收波长均为 619 1"I3左右，最大荧光发射峰均为
645113"1左右 (600 ilnl激发)，证 明均有色素蛋白
PCB．CpcB(C155I)生成 (见图3，图4) 这表明在
I．Wild cI砖 ；2 q sfwI4Ij；3 c s(W75S，
图3 体内重组产物透析后的吸收光谱
Fig 3 Absorpfion spectrum of reconstituted pred uets
in t,it~after dialysis
w ild
大肠杆菌体内，CpeS及其突变体能够催化 PCB与
脱辅基蛋白CpeB(C1551)的连接反应
2．3 体内重组蛋白的SDS-PAGE电泳和锌电泳鉴定
按照方法 1．7．取等量过柱提纯的体内重组产
物进行 SDS—PAGE电泳。色素可与 zn“形成螯合
物，该螯合物在一定波长紫外光激发下发射荧光。
锌电泳结果显示．CpeS和Cp~S(w75s)的体内重组
产物在紫外光的照射下发射橙黄色荧光，而 CpeS
(W141)的产物几乎看不 到荧光 这说明 CpeS
(W14I)催化 PCB—CpcB(C155I)生成的能力很低；而
CpeS和CpeS(W75S)的催化能力相对要高
与锌 电泳相对应的 SDS—PAGE电泳的结果显
示，每一种样品中均含有有两种目标蛋白，这表明体
内重组的菌种均有分子量为20 kD的CpcB(CI551)
和分子量为25．7 kD的CpeS及其突变体蛋白豹表
达，证明3种质粒转化的实验都很成功(见图5)
I，I’：野生型 CpeS；2．2’：CpeS(WI4I)：3．3。： 臼质丹于量标
准 4．4’：CpeS( 5S)
1，l’：Wild C1wS；2．2’：c‘ s(w14I)；3，3’：Protein m0je I＆r
wet曲1 standard；4．4’：cI s( 订5s)
围s 体内重组提纯产翱 SDS-PAGE电泳的考马斯亮
蓝染色检测【左图)和 Znh诱导的荧光检测c右图)
Fig．5 SDS—PAGE of purified reromstltutti pn Hducts in D
detected bv Cc~masaie staining(1eft’and Zn ’一induced
~]uoaescertce(right)
2．4 体内重组产物尿素变性的光谱检测
体内重组的产物经酸性尿素变性后．其最大吸
收峰为660 DIl1左右，原来619 nn 处的最大吸收峰
圈4 体内重组产物透析后的荧光光谱
(激发波长为 600 r皿)
Fig 4 F1uoreseenee speetrLtm of reconstJtutod products
in vit,~after diaJysis(e~xeitstlon wavelength 600 13m)
Wild CpeS：2 CpeS(WI41)；3．CpeS(w 5s
周 6 体内重组产物尿素变性后的吸收 图谱
Fig．6 Absorption spectruB3 of reeon．,~tituted product in vivo
after denaturation by i．i~,8
．
一
I- 量
■■■■■l暑，董
▲tI-IlI▲
臼膏 兰；● 一
．I 1．．
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第3期 张晓刚等：藻蓝蛋白裂合酶cpeS色氨酸定点诱变及体内重组功能研究
2．5 体内重组酶活性的比较
体内重组产物荧光单位与色素蛋白的量成正
比，因而可以用相同条件下表达的体内重组提纯产
物的荧光单位来比较连接产物 PCB—CpcB(C155I)
的生成量。荧光单位可以通过提纯产物最大荧光发
射峰的数值与稀释倍数以及回收产物体积的乘积得
到。每一次测定荧光光谱的样品都要保证其相应的
吸收光谱的最高峰小于 0．1(见方法 1．6)。
体内重组产生 PCB—CpcB(C155I)的连接反应
中，重组色素蛋白的产量取决于 CpeS及其突变蛋白
表达量和它们的催化活性。CpeS及其突变蛋白的
表达量的比较可以通过方法 1．7，从图6中考马斯
亮蓝染色扫描的图谱而得到。
裂合酶的催化活性可以通过催化产物 PCB—
CpcB(o55i)的量与裂合酶表达量的比值(即比活
力)进行比较。以野生型cpeS为对照，计算得突变
蛋白相对于野生型 CpeS的比活力(如表 3)。由表
中的数据可以看到，突变体蛋白 CpeS(W14I)的催
化活性几乎丧失，为野生型 CtmS的 8％，这与图 5
中zn 电泳的结果相吻合。这说明第 l4位色氨酸
对于 CpeS的催化活性很重要，可能是该酶的必需氨
基酸，其所处部位可能是 CpeS的活性位点，其突变
会引起该裂合酶的失活。CpeS(W75S)的活性降低
得相对较少，说明第 75位色氨酸对于 CpeS的催化
活性不是很重要。
表 3 裂合酶催化活性比较
! ! 竺 塑!竺垡生竺!竺
裂合酶 裂合酶活性(％)
Lya8e Lya8e activity
cr,~s
Cp~S(W14I)
CpcS(V~75S：
100
8
76
3 讨论
由于推测 CpeS氨基酸序列中的第 l4和75位
的色氨酸可能在该裂合酶催化活性中发挥重要作
用，于是设计实验对这两个位点分别进行了定点诱
变，得到了突变体 CpeS(W14I)和 CpeS(W75S)。
GorlV分析显示，这两个突变体的二级结构相对于
CpeS的变化很小。异亮氨酸(I)和丝氨酸(S)均为
中性氨基酸，它们对蛋白质结构的影响很小。
由实验结果可以看到，突变体的水溶性相对于
野生型 CpeS都有所降低。水溶性的变化可能是由
于色氨酸被替换而导致蛋白空间结构的部分改变而
造成的。蛋白质空间结构的部分改变与酶的催化活
性的变化也有关系。体内重组的结果显示，突变体
的催化活性相对于野生型 CpeS都有所降低，这可能
是由于蛋白空间结构的改变影响了酶与底物之间的
结合，从而影响了裂合酶的催化效果。
结果显示，突变体 CpeS(W14I)几乎丧失了野
生型CtmS所具有的裂合酶催化功能，其催化活性为
野生型 CtmS的 8％。由此可以推断，第 l4位色氨
酸可能位于 CpeS的活性位点，是酶活性的必需氨基
酸，该位点对 PCB与脱辅基蛋白的连接起着很重要
的作用，因此该位点的突变导致了酶活性的丧失，以
至于 PCB与脱辅基蛋白很难成功偶联。
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