全 文 ：武汉植物学研究 2001, 19 (3) : 248～ 254
J ourna l of W uhan B otan ica l Resea rch
基因组原位杂交的新进展及其在植物中的应用
余舜武1　张端品1　宋运淳2
(1. 华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室Ξ , 武汉 430070;
2. 武汉大学植物发育生物学教育部重点实验室, 武汉 430072)
关键词: 基因组原位杂交; 染色体; 物种
中图分类号: Q 943　文献标识码: A 　文章编号: 10002470X (2001) 0320248207
The Uptodate Advance and Use of Genom ic in s itu
Hybr id iza tion (GISH) in Plan t
YU Shun2W u1, ZHAN G D uan2P in1, SON G Yun2Chun2
(1. N ationa l K ey L abora tory of C rop Genetic Imp rovem en t, H uaz hong A g ricu ltu ra l
U n iversity , W uhan　430070, Ch ina;
2. T he K ey L abora tory of M O E f or D evelopm en ta l B iology , W uhan U niversity , W uhan　430072, Ch ina)
Abstract: T he up todate advances of genom ic in situ hyb rid iza t ion (G ISH ) fo r
last ten years are review ed in the art icle. T hese m ethods in it ia lly deriving from
an im al research have been developed in p lan t study, such as M u lt ico lo r F luo2
rescence in situ H yb rid iza t ion (M cF ISH ) , T h ird2st rand in situ H yb rid iza t ion
(T ISH ) , Comparat ive Genom ic H yb rid iza t ion (CGH ) and Sim u ltaneou s in situ
H yb rid iza t ion. G ISH app lied w idely in p lan t can reveal the species o rig in and
evo lu t ion and determ ine the tru th of d istan t hyb rid con ta in ing fo reign ch ro2
m atin. A lso it can research the ch romo som e behaviou r including B 2ch romo2
som e and exp lo re the genom ic m app ing and gen ic funct ion. F inally the app lica2
b ility and reso lving pow er of G ISH abou t taxonom ic distance, genom ic size and
the length of ch romo som e fragm en t are d iscu ssed, as w ell as the fu tu re and the
sta tu s of G ISH in p lan t.
Key words: Genom ic in situ hyb rid iza t ion; Ch romo som e; Species
基因组原位杂交 (Genom ic in situ hyb rid iza t ion G ISH )是 20 世纪 80 年代末发展起来Ξ 收稿日期: 2000209224, 修回日期: 2000212221。基金项目:“九五”国家科技攻关农业项目 (96200220220222)资助。作者简介: 余舜武 (1971- ) , 男, 博士生, 从事作物遗传育种研究。T el: (027) 87282104, E2m ail: crop lab@public. w h. hb. cn
的一种原位杂交技术。它最初应用于动物方面的研究[1 ] , 但很快被植物方面所借用, 并且
使用频率高于动物方面的研究。它采用来自一个物种的总基因组DNA 作为标记探针, 用
另一物种的总基因组DNA 以适当的浓度进行封阻, 在靶染色体上进行原位杂交。在封阻
DNA 和标记DNA 探针之间, 封阻DNA 优先与一般序列杂交, 剩下的特异性序列主要被
标记探针所杂交。在此基础上, 人们先后发展了荧光基因组原位杂交、多色基因组原位杂
交和比较基因组原位杂交等技术, 应用于物种的起源和进化、远缘杂种的鉴定、外源染色
质的检测、染色体行为、基因的功能与定位以及B 2染色体的起源等研究, 并且日益显示出
其在分子细胞遗传学中的重要地位。
1　基因组原位杂交技术的发展
在 1989 年,L e 等[2 ]报道了利用黑麦总基因组DNA 鉴别一个具有小麦—黑麦互换的
面包小麦品种中的黑麦染色体片段。但是该方法不能应用于两者亲缘关系比小麦与黑麦
更近的物种之间的鉴定。后来,M ukai 和 Gill 对该技术进行改良, 用 1÷2 的标记大麦总基
因组DNA 和未标记小麦封阻DNA 的比例, G ISH 优先检测出小麦背景下的大麦染色
体[3 ]。该方法增加了高浓度的封阻DNA , 大大提高了G ISH 的鉴别能力。虽然进一步的研
究显示添加封阻DNA 对区别远缘物种的基因组 (如 S eca le 和H ord eum ) 不是必需的, 但
对亲缘关系很近的物种却是必需的。原位杂交的检测手段不断地改进, 采用荧光素检测系
统, 大大改善了原位杂交的检出率和分辨率, 甚至可定位小片段的单拷贝基因[4 ] , 使与
G ISH 相结合的荧光原位杂交 (F luo rescence in situ hyb rid iza t ion F ISH ) 技术在植物分子
细胞生物学方面显示了强大的生命力。随着 F ISH 技术朝着多色方向发展, G ISH 技术也
迅速借用该技术应用于多倍体物种基因组的同时鉴定。M ukai 等用生物素标记二倍体
AA 基因组祖先种 T rotoci u ra rtu 总基因组DNA , 地高辛标记二倍体DD 基因组祖先种
A eg ilop s squa rrosa 总基因组DNA , 未标记的总基因组DNA 为可能的BB 基因组祖先种
A eg ilop s sp eltoid es, 对六倍体普通小麦 (T riticum aestivum ) 中期染色体进行原位杂交, 仅
用两种荧光素就将A、B 和D 基因组同时显示为黄、棕和橙色[5 ]。此后 Sanchez2M o ran 等
利用该技术用不同颜色同时显示小麦- 黑麦衍生种中的A、B、D 和R 基因组[6 ]。植物中
多倍体现象普遍存在, 关于它们的起源与进化路径、距离, 许多植物还处于未知状态, 随着
研究不断地拓展和加宽, 该技术的不断发展, 还可能在木本植物中得到广泛的应用。动物
中多倍体现象极少, 多色 G ISH 难以发挥作用, 但将染色体分成几个片段, 用染色体亚区
作探针进行多色 F ISH , 研究物种进化与染色体重排、易位的关系却是可行的, 该方法已用
来研究人类的第 3 和第 21 染色体与其它食肉动物染色体线性保守性, 并且研究各物种之
间染色体的起源与进化, 构建了系统发生重建的精密的比较图谱[7 ]。
人们根据寡聚脱氧核苷酸链的特点, 设计了一种不需对染色体或染色质进行变性处
理的第 3 链原位杂交 (T h ird2st rand in situ hyb rid iza t ion, T ISH )。John son 等[8 ]利用基因
组中重复序列区域或基因表达调控区域存在的富嘌呤2富嘧啶的核苷酸双链DNA 螺旋
的大沟中, 在偏酸性条件下容易与第 3 条链结合的特性, 首次在pH 6. 0 条件下, 用补骨脂
素和生物素修饰的 162核苷酸同型嘧啶的 3 条链与人类第 17 染色体上Α2卫星的单一多拷
贝序列原位杂交。该技术不需要RNA 酶和蛋白质酶处理, 在 45℃杂交, 就能达到很强的
942　第 3 期　　　　　　　　　　余舜武等: 基因组原位杂交的新进展及其在植物中的应用
序列特异性。杂交后用长波紫外线 (UVA , 320～ 400 nm )激发进行光固定, 以后检测方法
基本同荧光原位杂交, 并且不需要进行级联免疫放大就可在光学显微镜下分辨出杂交信
号。随着人们对植物的三链DNA 的深入研究以及探针的设计方法的完善, 该技术也可应
用于植物研究, 采用基因组作探针, 还可以解决 G ISH 不能辨别特异性染色体的缺点。
为了研究自身染色体的结构和变异, 人们采用两种标记的总基因组DNA , 一种来自
制作染色体制片的物种DNA ; 另一种来自于其它具有一定亲和力的物种如变异种、近缘
种等的DNA , 对研究材料的中期染色体进行原位杂交, 这是一种原位基因组共杂交 (si2
m u ltaneou s in situ hyb rid iza t ion)。Belyayev 和R ask ina [9 ]利用该技术分别用不同的近缘
种和斯佩耳特山羊草 (A eg ilop s sp eltoid es) 的总基因组DNA 作探针研究斯佩耳特山羊草
的有丝分裂中期染色体, 观察斯佩耳特山羊草不同的 G ISH 带型。建立在该技术基础之
上, 人们发明了一种比较基因组原位杂交 (Comparat ive Genom ic H yb rid iza t ion CGH ) 方
法[10 ] , 但该方法目前主要应用于人类遗传疾病尤其是肿瘤的研究方面, 对待检测样品的
DNA 标记为红色, 相应的正常样品DNA 标记为绿色, 在一定的抑制条件下对正常细胞
的中期染色体进行杂交。如果测试DNA 中出现扩增或缺失, 就会在变异位点上出现红绿
荧光密度比的变化, 然后借助一定的图象分析系统, 就可以绘出相应的CGH 核型图[11 ] ,
但该技术因其分辨率的原因, 尚未被广泛地应用于其它研究。1992 年在哺乳动物物理作
图中, H eng 等[12 ]在铺展有DNA 纤维的玻片上成功地进行了荧光原位杂交, 随后 1996
年在植物上用伸展的DNA 纤维上荧光原位杂交 (F ib re2F ISH ) 也获得成功, 使建立高分
辨率的植物物理图谱得以实现[13 ]; 同时随着显微镜、图象分析系统技术的改进、DNA 芯
片和分子梳理 (mo lecu lar com b ing) 技术的相互结合, 可大大提高其分辨率, 并有可能在
不久的将来将DNA 纤维上的CGH 应用于植物研究。
2　基因组原位杂交在植物中的应用
2. 1　物种的起源与进化研究
传统的核型分析方法曾在物种的起源与进化研究中发挥巨大的作用, 但是许多近缘
物种尤其是多倍体种不同基因组之间染色体形态相似, 分类亲和力紧密, 而且有些种由于
地理隔离或本身遗传物质的影响, 干扰染色体在减数分裂过程中的同源配对, 从而易造成
亲缘关系的错误估计。虽然人们曾采用非整倍体的染色体配对分析, 但此方法复杂而费
时。自从采用 G ISH 方法, 可准确评价各基因组的亲缘关系, 快速而可靠地研究各基因组
的起源与进化。利用该技术, 不仅清楚地显示出异源四倍体栽培烟草 (N icotiana tabacum )
S 和 T 基因组, 而且发现了 2 个基因组之间存在的易位片段[14 ]; 在小麦的ABD 基因组起
源的研究中, 不仅解决了最有争议的B 基因组的祖先起源种 (A eg ilop s sp eltoid es)的问题,
而且鉴定出中国春 4A 染色体上有一部分来自B 基因组染色体[5 ]。玉米的祖先二倍体种
一直是个谜, T akahash i 等对不同的近缘野生种与玉米染色体杂交, 发现玉米的起源复
杂, 但仍可了解玉米与各个野生种之间的亲缘关系[15 ]。同时Belyayev 等应用 G ISH ( si2
m u ltaneou s G ISH )对斯佩耳特山羊草 (A eg ilop s sp eltoid es)与不同的近缘种的进化距离作
了初步估计, 检测了斯佩耳特山羊草在自然进化中引入的异源染色质[9 ]。在小麦2黑麦杂
种 (基因组构型ABDR ) 的研究中, 将探针和封阻的基因组DNA 作适当的变换, 发现
052 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　　第 19 卷　　
G ISH 带型有区别, 用AD 基因组作探针, S 基因组作封阻和用 S 基因组作探针, A 或D
基因组作封阻的结果不同, 前者能将AD 基因组重复序列的杂交信号完全封阻住, 但后者
不能, 表明 S 基因组物种拥有一个或更多的在AD 基因组中以低拷贝形式的随机重复序
列。这种模式的出现将有助于鉴定特异性的染色体 [6 ]。从以上研究来看, G ISH 在物种的起
源和进化、分类研究中是一个强有力的工具, 目前在草本植物中得到了广泛的应用。
2. 2　远缘杂种的鉴定及外源染色质的检测
远缘野生种中存在着许多对栽培种有利的基因, 育种学家们为了能够利用这部分基
因, 通常采用杂交或体细胞融合的方法创造远缘杂种并不断地用栽培种回交, 以期能将野
生种的遗传物质转入栽培种中。而运用G ISH 方法, 跟踪检查杂种的真实性以及后代外源
染色体或片段的品系, 是一个快速、灵敏、准确、信息丰富的手段。它能对外源染色体或片
段计数, 显示它们的大小、位点和形态以及与寄主基因组染色体的重组。一般以标记的野
生种基因组总DNA 为探针, 以栽培种亲本总DNA 为封阻DNA , 在杂种及其后代中期染
色体进行杂交, 通过信号的有无来判断是否有野生种染色质渗入。它清晰地显示普通小麦
与东方旱麦草异附加系和异代换系[16 ]、小麦与大赖草的染色体易位系[17 ] , 而易位对于转
入有利性状具有重大意义。该技术还在认为难以成功的水稻上进行, 成功地鉴定了栽培水
稻 (O ry z a sa tiva)—紧穗野生稻 (O. eix h ing eri) 和栽培水稻 (O ry z a sa tiva )—药用野生稻
(O. of f icina lis)杂种 F 1 的真实性及回交后代中的异源附加系[18, 19 ]。因此, 无需经过基因
表达产物来推断基因转移是否, 就能检测整合于染色体内的和游离的外源染色质。
2. 3　染色体行为研究
早在 20 世纪 80 年代,Bennet t 就提出了自然核型学说[20 ] , 但实验所得到的有关染色
体的数据主要是染色体的相对长度和臂比, 且无法看到在基因表达的细胞分裂间期是否
也存在倾向性分布。因为亲本基因组因染色体的解凝聚而无法鉴别。G ISH 技术的应用使
有丝分裂全过程中, 对染色体行为的研究更加准确。对一些杂种细胞的研究证明, 在细胞
周期的各个阶段, 来自双亲的基因组在杂种后代中是在基因组水平进行空间组织的, 各
自占据一定的空间区域, 而不是随机组合的[21 23 ]。
细胞遗传学中, 研究减数分裂染色体的行为能够更深入地了解基因组与基因组之间
的关系, 但过去仅仅通过形态观察了解同源染色体配对, 而现在通过 G ISH , 不仅能观察
到存在配对的同源染色体的来源, 而且能观察到异源染色体易位现象。在杂种中通过
G ISH 能清晰地观察到染色体同源配对, 在中期É 形成交叉的频率高于染色体重组在后
期É 形成交换的频率, 而且发现重组多发生在染色体的末端[24, 25 ]。
2. 4　基因的功能与定位研究
小麦 5B 染色体长臂上携带着控制小麦部分同源染色体配对的Ph 基因, 对该基因功
能的研究有利于育种家对小麦进行遗传操作。为了了解不同的 Ph 的突变型控制细胞同
源配对的机制, 使用 G ISH 方法得到了比其它方法更进一步的研究结果[26 ]。但是利用
G ISH 研究基因功能, 其应用范围受到限制。利用G ISH 对小片段的DNA 序列进行定位,
还发现了一个有意义的结果。Ken ton 等[27 ]将双粒病毒的DNA 序列定位于烟草T 基因组
一个小染色体上, 这是第一次观察到病毒DNA 序列整合到植物基因组。病毒DNA 插入
序列物理作图在系统发育和植物进化研究中有特殊的应用, 对农作物基因工程和植物基
152　第 3 期　　　　　　　　　　余舜武等: 基因组原位杂交的新进展及其在植物中的应用
因组计划是有重要意义的, 这是个特例。但将G ISH 技术与其它分子技术如R FL P相结合,
能充分发挥G ISH的潜能。P ickering等[4 ]先用G ISH将来自于鳞茎大麦的渐渗染色质定位
于大麦两条染色体末端, 再用R FL P把含有性成熟基因 (H s) 的渐渗作图定位于大麦4HL
染色体末端。两种技术的结合, 能够加快基因的定位与克隆, 是一个很有前途的技术。
2. 5　B-染色体的起源研究
B 2染色体是真核生物中除正常染色体 (A 2染色体) 外, 不遵守孟德尔遗传法则的自在
遗传因子, 广泛地在动、植物中发现。为了研究B 2染色体的起源问题, 采用了不同的分子
生物学方法, 其中 G ISH 技术对B 2染色体DNA 的构成和组织的说明提供了有力的证据。
人们发现B 2染色体与A 2染色体相似, 进一步研究证明它们来自于A 2染色体, 但在基因组
转换过程中发生了快速的遗传进化[28, 29 ]。为了进一步深入研究, 微切割C rep is cap illa ris
B 2染色体, 无论是带有B s 还是不带有B s 的 G ISH , 都表明B 2染色体中有许多DNA 序列
与A 2染色体一致, 其中发现B 2染色体的 2 个端粒比A 2染色体大, 但也发现一些DNA 序
列不一致[30 ]。上述实验支持大多数B 2染色体来源于它们当前寄生物种的常染色体, 但
G ISH 目前还尚未涉及研究来自种外的染色体的研究[31 ]。
3　GISH 的适用性和分辨能力
G ISH 的一个重要问题是在植物的适用性有多广。一些实验证明 G ISH 能广泛地适
用于植物分类学的范围。但是 G ISH 能分辨多大的分类距离, 从以前的报道来看, 却难以
定论, G ISH 有时能分辨被认为具有很近的亲缘关系的种, 但有时在属水平上分辨却相当
困难, 其封阻与探针比达到 200～ 300÷1 [6 ] , 仍然不能分辨[32 ]。这需要进一步探测该方法
的限制性, 并在某些情况下, 检测 G ISH 是否能成功地应用于亚种甚至更低水平的分类单
位。寻找一个标准而严格的技术或分类学检测手段, 建立分子与分类学的亲缘性之间的相
关性是 G ISH 的一个重要目标。
G ISH 鉴定能力可能依赖非编码、广泛分布的重复DNA 序列的不同, 故在低基因组
大小和重复序列比例很小的分类群, 如果它们没有广泛分布的重复序列, G ISH 的分辨能
力可能受到影响。拟南芥被认为是基因组最小的被子植物, 重复序列只占总基因组的
40%。原位杂交已应用于拟南芥杂种的全基因组, 从理论上说, G ISH 可应用于拟南芥整
个基因组和染色体范围的研究, 但是, 这些材料多采用基因组特异性标记。目前比较小的
基因组获得成功的有水稻和番茄, 其C 值含量在 1 pg 以下, 可能由于材料或其它原因, 还
没有明确报道用已知最大或最小的基因组测试该技术, 但已有基因组与水稻相差 200 多
倍的长花百合 (L ilium long if lorum , C= 141 pgöcell)的G ISH 的报道[33 ] , 已经十分接近人
们预测的最大的基因组。但无论基因组多大, 一般认为 G ISH 在大基因组尤其含大量的
广泛分散分布的重复序列的分类单位效果好。
原位杂交已经能对 1 kb 以下的核苷酸在染色体上进行精确定位, 那么 G ISH 所能检
测的外源染色体片段最小限制是多少? 不能简单地回答这个问题, 它依赖于所涉及的
DNA 序列。上面提到的植物中双粒病毒DNA 插入植物中的片段长 20 kb, 但植物 G ISH
似乎不能检测出那么小的染色体片段, 而且对易位或渐渗片段的大小也只是通过粗略估
计而来, 认为它们在许多情况下, 能够分辨低于 100M bp 或许 50 M bp 的小片段[34 ]。但随
着 F iber2F ISH 和 G ISH 技术的结合, 其分辨率大小可能有突破性的进展。
252 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　　第 19 卷　　
4　总结与展望
为了研究基因组相互关系, 传统的基因组分析方法常需制作单体或三体, 然后再杂交
观察减数分裂同源染色体配对行为, 这需要大量的时间和精力, 成功率又不高。C2显带技
术和银染联会复合体 (A g2Sc) 的电镜观察常常难以满足人们的需要。因此需要一种快速
而可靠的技术。G ISH 正是在这样的条件下应运而生的一个有效的研究染色体行为的新
技术。首先 G ISH 可以避开减数分裂而直接用于体细胞有丝分裂; 其次不受季节限制, 可
快速进行相关研究; 再次, G ISH 重复性好, 受隐性基因的干扰少; 最后与分子生物学相
比, G ISH 能低成本地解决生物分类学问题。当然, G ISH 也有其限制, 常常不能区分各染
色体。但是它首先作为一个鉴定方法无疑是有明显优点的, 在实际操作中, 如果与其它方
法如C2显带技术、特异性重复序列探针 (如 rDNA、端粒等)、R FL P 以及其它分子生物学
技术相结合起来, 无疑, 将赋予 G ISH 最强大的生命力。
作为一种分子细胞遗传学工具, 它在最近 10 年得到了很快发展, 广泛应用在栽培和
野生植物中。随着制片技术发展, 克服细胞中单宁等物质的影响, 将 G ISH 应用于热带被
子植物树木和一些蕨类植物, 寻找祖先异源多倍体的证据, 使得系统地研究世界上的植物
资源成为可能; 随着 F ISH 技术的发展, 与 F ISH 紧密结合的 G ISH , 也能够借用 F ISH 的
最新技术, 如多色 F ISH、F iber2F ISH、光学作图、数字作图等, 可大大改善 G ISH 的容量、
功能和分辨率; 随着比较遗传学的发展, 采用染色体亚区作为探针, 研究相关植物的物种
进化与染色体易位和重排的关系, 可大大加速植物系统发生方面的研究; 随着其它相关技
术的发展, 如染色体的微切割, 第 3 链原位杂交等, 可大大拓宽 G ISH 的应用范围, 提高渐
渗的物理定位的精确性等。总之, G ISH 是一个有价值的技术, 既可单独使用, 也可以与其
它技术结合起来, 将在植物研究中逐渐扮演重要的角色[35 ]。
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