全 文 ：武汉植物学研究 2007，25(4)：321—325
Journal of Wuhan Bomnwal Research
六倍 体大小麦 tritordeum花药组织特异性
启动子的鉴定与分离
涂知明，陈泠，杨广笑，何光源
(华中科技大学生命科学与技术学院中英联合实验室，武汉 430074)
摘 要 ：启动子是基因表达调控的重要顺式元件，也是基因工程表达载体的一个重要元件。一个无启动子的带有
U／dA基因的质粒 pPLGUS通过基因枪转化进 tritordeum材料中，对转基因材料的多种不同组织进行了 X-sluc显色
来检测不同组织中的GUS活性，有一个株系的花药组织特异性启动子已被证明成功捕获，并通过PCR方法将其分
离。提取叶片的总DNA作模板，上游使用水稻花药启动子分离的引物 P1，以 U／dA基因的部分序列为下游引物 P2，
PCR扩增 U／dA基因的上游旁侧序列。已经获得一条长667 bp的目的片断，含有部分 U／dA基因的序列和一段 U／dA
基因的上游旁侧序列，该序列中具有植物启动子的一些必备元件，初步断定它是一段花药组织特异性启动子序列。
关键词：组织特异性启动子；花药； 以 基因；X．she显色
中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：1000．470X(2007)04·0321·05
Tagging and Isolation of the Anther·specific Promoter in
Hexaploid Tritordeum
TU Zhi—Ming，CHEN Lin，YANG Guang-Xiao，HE Guang—Yuan‘
(China—UK Joint Lab，College Science&Technology，Huazhong University ofScience&Technology，Wuhan 430074，China)
Abstract：The promoter is an important element of gene expression，and tissue specific promoters are very
useful in gene engineering、A promoterless U／dA containing plasmid derived from pPLGUS was trans—
formed into tritordeum．Histochemical analysis of various tissues in transgenic tritordeum was carried to
examine tissue specifc expression of GUS activity．A transform ant line with anther-specifc GUS expres—
sion was successfully labeled and isolated．PCR method was used to isolate this anther—specifc promoter
with DNA extracted from leave as template，using primer pair of rice anther specific promoter，primer P1
as forward primer，U／dA gene specifc sequence as reverse primer．By sequencing and analyzing the ampli—
fled DNA fragment from PCR reaction．a part of gene and a flanking sequence were obtained．Some
essential promoter elements were found in this sequence．Therefore the fragm ent obtained was believed to
be a part of anther specific promoter．
Key words：Tissue—specifc promoter；Anther；U／dA gene；X—glue test
启动子是一段位于基因上游的 DNA序列。一
旦RNA聚合酶结合在启动子上即可启动转录过程，
因此启动子是基因表达调控的重要顺式元件，它与
RNA聚合酶以及其他蛋白辅助因子等元件的相互
作用是启动子调控模式的实质。原核生物和真核生
物的启动子都具有一定的基本结构特征⋯。启动
子可以分为组成型(广谱型)和诱导型(组织特异
性)。前者在所有组织中都启动基因表达，后者仅
在特定的组织中和一定的发育时期启动基因表达。
高等植物的花粉发育和形成是一种非常独特的
过程，涉及到细胞有序分化、形态和生化等方面的复
杂变化，这些变化通过许多基因在花粉不同发育时
期有序表达，使整个发育过程得以完成。而控制基
因表达的时空性，启动子是一个必备的要素。获得
花药组织特异性启动子不仅对基因的调控研究有很
大的意义，而且可应用于雄性不育系的培育-2 J。
收稿日期：2007一O1-11。修回日期 ：2007—05—24。
基金项目：国家高技术研究发展计划项目(2002AA224031)；国家 自然科学基金资助项 目(30370807)；华中科技大学博士论文基金资助
项目。
作者简介：涂知明(1965一)，男，汉族，湖北人，博士，副教授，研究方向为分子遗传学。何光源(1958一)，男，汉族，湖北人，教授，博导，
研究方向为分子遗传学。
十 通讯作者(E—mail：hegy@mail．hust．edu．cn)o
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322 武 汉 植 物 学 研 究 第 25卷
1 材料与方法
1．1 无启动子转化策略捕获内源组织特异性启动
子原理
启动子捕获技术是近年来基因标记技术的新发
展，现已成功地应用于分离某些植物的特异性调控
序列。由于启动子序列提供了其调节性和特异性方
面的信息，所以用启动子捕获的方法分离新型的启
动子序列用于谷类的基因操作是目前较热门的研究
内容 J。应用这种技术分离内源组织特异性启动
子的方法是构建含有 基因序列的质粒，但所构
建的质粒不包含有 基因的启动子序列，然后采
用基因枪法，把构建的缺失启动子的质粒转入 tritor-
deum幼胚中，通过 UidA基因的表达产物筛选得到
含有内源花药组织特异性启动子转基因植株 ，原
理见图 l。
Plas
)子
-
一
Dter
—
Chromos0me _
表达 Expresion 不表达 Non-expressiotx
蚩 臼质 Protein
图 1 无启动子转化策略捕获内源
组织特异性启动子原理
Fig．1 The principle of labeling tissue specifc promoter
by non·promoter plasmid
1．2 实验材料
实验中所使用的花药组织特异性启动子的材
料是一种硬粒小麦(Triticum durum)和大麦(Hot-
deum chilense)的杂交6倍体的后代(tritordeum)，并
且已被上述无启动子转化策略标记了内源组织特
异 性 启 动 子 的 材 料 ，一 共 有5个 株 系 ，依 次
为 B369R4P1TG、B369R4P166、B369R4P166．14、
B369R4P166．14．27、B369R4P166．14．29，均由本实
验室保存。
1．3 主要试剂
CTAB缓冲液、X．gluc缓冲液、PCR Master Mix-
ture购 自 ABgene公 司；PCR 胶 回收 试 剂 盒、
Giassmilk recovering kit为Canada Biostar Co出品；低
熔点琼脂糖、T4DNA连接酶、DMSO二甲亚砜、oligo
(dT)、Taq酶、pGEM-T-easy vector购自Promega公
司；IPTG、X-gal购自上海生工生物工程技术服务有
限公司。
1．4 实验方法
用 X-gluc检测 UidA基因在 tritordeum植株的
各个器官的表达情况，包括根、茎、叶和花的各个部
分(包括外稃、内稃、心皮、花药原基、花药等)。收
集以下转基因植物组织：①四叶期的植株的根和叶
(叶鞘和叶基，叶片的尖端和中部)；②有分蘖的植
株的根和叶(叶片材料取一个分支上的第二片新
叶)，叶鞘和叶基，叶片的尖端 和中部都要检测。
③未成熟的花穗 (6—15 mln长)和周生 的萼片；
④该花序着生的节点及紧挨其下的节点；⑤第一、二
节点间的节间部分；⑥花期的花(颖苞、外稃、内稃、
芒、心皮、雄蕊和花粉)；⑦花期 16 d后的种子和未
成熟的胚芽和胚乳。
CTAB法提取 tritordeum叶片的 DNA，于4℃保
存于TE缓冲液中。
在tritordeum的近源种中搜索相关的启动子序
列，利用已有的启动子分离的引物作为上游引物，下
游采用 GUS引物。上游引物有如下 3种：①P1：
5’TGTAAGCTTGTATCGTCGGAGATGTGGTAG3’[引 ：
( Pl：5’TATGTTAAccAcTAA．TCAAGC3’l ；③Pl：
5’CACGTAG，丌CAATrACAGTFC3’is]；下游引物 P2
为将用于扩增 UidA基因的上游引物改造为所需的
下游弓I物：5’ACACAAACGGTGATACGTACACT 3’。
扩增反应体系为25 L，以tritordeum叶片 DNA
为模板，其中含模板2O ng、5’端引物和3’端引物各
2O ng、4 dNTP各 0．2 mmol／L、MgC12 1．5 mmol／L、
1×Taq DNA聚合酶 Bufer、1 U Taq DNA聚合酶。循
环程序为94℃预变性5 min，然后进人循环，94℃变
性45 S，56℃退火 1 min，72℃延伸 40 S，35个循环，
最后72℃延伸5 min 。
2 结果与讨论
2．1 转基因材料的组织化学检测
对转基因材料各种组织器官进行了检测 ，发现
了花药特异性。实验材料经 X-gluc显色的一部分
结果见图2。
在我们前面的实验中已经发现 GUS在一些材
料的花药发育早期有表达，但是到花药发育的晚期
和花粉粒中就不表达 。¨。 由图 2可以看 出，经
X—gluc显色后的结果很明显，被染成蓝色的，在基因
组中就一定存在 U／dA基因；没有被染成蓝色的，可
能是 U／dA基因不存在或者不表达。从表 1中可以
看出，L88-6没有任何一个组织显示蓝色。B73-6．1
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324 武 汉 植 物 学 研 究 第25卷
CACG n GTTCAATTACAGTrCACTATAGGGCG
AATTGGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGGT
A rCGA n AGCTTGAATTCGACGTTACACAAACGGT
GATACGTAGGAACCACGAGCCTTCTTGAGGGAAG
CTCCGGT1rrACAAGAAGCTTACACCAAAGCTTGTC
CCAATTCGGCCAAAAAAATIACCGCAACGGCTCAA
TCT(一8O，CAATbox)GACACGTG(一72，Gbox)CA
TGATI11’CAGGCATGTYCACTATATATAG(一41．TA
TAbox GAAT1AAAAAAACCAAGTITCTCAATCTIT
AAACAATGGCT(一1)一Atgtacgtcctgtagaaaccccaacc
cgtgaaatcaaaaaactcgacggcctgtgggcattcagtctggatcgcgaaaa
gcgttacaagaaagccgggcaat
tgctgtgccaggcagttttaacgatcagttcgccgatgcagatattcgtaatatg
cgggcaac ctggtatcagcgcgaagtctttataccgaaaggttgggcaggcc
agcgtatcgtgctgcgtttcgatgcggtcactcattacggcaaagtgtgggtcaat
aatcaggaagtgatggagcatcagggcggctatacgccattgaagccgatgtc
acgccgtatgttattgccgggaaa378AGTGTACGTATCACCGTY
TGTGT(U／dA基因片断部分以小写字母表示)
2．4 讨论
现在在高等植物中已经发现了一些花药组织特
异性的启动子，总结于表2。
表 2 花药组织特异性的启动子
Table 2 Polen tissue—specific promoter
启动子种类
Promoter type
转基因植物
Transgenic
plant
植物组织特异性表达的启动子中存在着不同的
结构域，通过这些结构域的协同作用调控着启动子
不同的表达模式。如拟南芥的酰基转移蛋白Acl1．2
基因启动子区域存在 3个顺式作用元件，在根和叶
不同组织显示出差别调控活性。水稻醇溶谷蛋白基
因启动子转录起始子上游有一系列的顺式调控因子
如TATA及TATAT、CAAT基序。水稻4a基因5 端
的-618至．18包含了胚乳特异性表达的顺式作用元
件，在转基因植物中显示了组织特异性表达。组织
特异表达启动子可能存在有特异的顺式元件，如大
豆的Nod26在根瘤中特异表达就是由于基因上游
TATA盒和 CAAT盒之间的根瘤特异元件(CTCTY)
所决定。而玉米 Adhl启动子组织特异性表达是由
两个TATA盒及侧翼序列所调控。从我们得到的序
列来看，在起始位点前面有多个 TATA及 CAAT基
序，还发现有动物中常见的启动子元件 GC盒。植
物的启动子区域 TATA框序列的共通序列一般是
5’TCACTATATATAG3’。TATA框是 RNA聚合酶
Ⅱ识别的位点，当RNA聚合酶与之结合之后才能开
始转录。TATA框与转录起始点之间的距离是转录
精确起始的重要因素。植物启动子的TATA框的位
置常在．16到．54的区域，在本克隆序列中 TATA框
序列位于．41位，在．276位还有一个 TATA框序列，
序列的变化反映了受到不同调节因子的作用。起始
位点ATG旁侧的保守序列为TAAACAATGGCT，其
中旁侧序列及其与 TATA框的距离可能在光、不同
发育阶段或微生物引起的感染中受不同因子的诱导
和调节，在本克隆序列中旁侧序列与TATA框的距
离是 29 bp。CAAT框在植物基因中常位于．8O位
区，在本克隆序列中也正好在-80位区，另有两个
CAAT框分别在．13位区和．139位区，可能也有一定
的起始作用或组织特异性作用。在许多基因的 5’
旁侧区序列，在不同条件下表达和不同组织器官表
达时都有一种序列为5’CACGTG3’的共通序列，称
为 G盒。G盒是高度保守而且也是迄今为止研究
得最清楚的植物型转录元件。在本克隆序列中 G
盒位于-72区，它是决定组织特异性的一个重要元
件。．236位有一个完全由 12个 GC碱基组成的序
列，与动物中常见的启动子元件 GC盒相似。到目
前为止 ，已发现的与花有关的组织特异性启动子序
列有两个 ¨，一个是花粉粒盒(polen box)，核心序
列是 AAATGA；另一个是 Q元件(Q·element)核心序
列是 AGTCA。这两个序列特异性驱动基因在花粉
发育晚期表达，我们分离的序列是特异性驱动基因
在花发育早期(花药原基)表达，因而未在本序列中
发现上述两个元件。
应该是很多顺式作用元件共同作用才使一个基
因在特定的组织中表达。要进一步确定每一个元件
甚至每一个碱基的作用，还需要做缺失实验，建立一
个缺失突变体库，我们准备将这一段序列接上一个
报告基因，再来转化小麦和其它植物，以确定其是否
具有花药原基组织特异性。
一
达黼 -蕈 表或 ∞
．
～
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第4期 涂知明等：六倍体大小麦 tritordeum花药组织特异性启动子的鉴定与分离 325
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《武汉植物学研究》被美国《剑桥科学文摘》收录
从相关数据库统计机构获悉，2007年《武汉植物学研究》被美国《剑桥科学文摘：自然科
学》(CSA：NS)收录。到目前为止，本刊已相继被8种国际著名检索系统收录，分别是：
· 俄罗斯 文摘杂志(AJ)
· 美 国 生物学文摘(BA)
· 美 国 化学文摘：光盘版(CA：CD)(2006年收录74篇)
· 英 国 国际农业与生物科学研究中心文摘(CABI)
· 美 国 剑桥科学文摘：自然科学(CSA：NS，2007年首次进人)
· 波 兰 哥白尼索引(IC)
· 日本 科学技术文献速报(JST)
· 美 国 乌利希国际期刊指南(UIPD)
俄罗斯《文摘杂志》(AJ)、美国《生物学文摘》(BA)和日本《科学技术文献速报》(JST)名列世
界上最重要的六大检索系统之中。美国《化学文摘：光盘版》(CA：CD)报道速度快，索引系统完善，
已成为当今世界上最有影响的检索体系，是获取化学信息必不可少的工具。英国《国际农业与生
物科学研究中心》文摘(CABI)是由国际农业和生物科学研究中心出版的文摘型光盘数据库，为世
界最大的农业文摘数据库。美国《剑桥科学文摘》(CSA，Cambridge Scientific Abstracts)是国际上具
有重要影响力的科学技术文献检索系统之一，是近几年发展最快的重要国际检索系统，共收录中国
期刊近700种。波兰《哥白尼索引》(IC)是由Medical Science International(国际医学)创办的医药
学、生物学国际检索系统，是一个新的通向科学信息的世界性门户，有益地补充了美国《医学索引》
(MEDLINE)和美国科学信息研究所(IsI)的内容。美国《乌利希国际期刊指南》(UIPD)是著名的报刊
目录，在全世界享有广泛声誉。其网络版收录的连续出版物不仅数量多而且更新快(每周更新)。
《武汉植物学研究》编辑部
2007年 7月
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