全 文 ：whiob．ac．cn
武汉植物学研究 2004，22(2)：175～178
Journal o| Wuhan Botanical Research
猕猴桃野生居群的 SSR分析初报
栗琪，李作洲，黄宏文
(中国科学院武汉植物园，武汉 430074)
摘 要 ：采用 SSR分子标记技术对我国猕猴桃的 2个商业栽培物种—— 中华猕猴桃和美味猕猴桃的 9个天然居
群(共 221个样)的遗传多样性进行了初步分析。通过对 14对猕猴桃引物的筛选，8对重现性好的引物扩增结果表
现出良好的多态性。在 8个多态性位点上共获得 222个等位基因。居群等位基因平均数 A=17．3，多态位点百分率
P一100，多态信息指数 PIC为 0．87～O．96，显示出我国的猕猴桃野生居群具有极高的遗传多样性。中华猕猴桃和
美味猕猴桃野生居群拥有高比例的共同等位基因，反映出二者的亲缘关系极近。
关键词：中华猕猴桃；美味猕猴桃；SSR；遗传结构；多态信息指数
中图分类号：Q347；$663．4 文献标识码：A 文章编号；lOOO一470X(2004)02—0175—04
Preliminary Study on R Analysis in Natural Populations of Actin
LI Qi。LI Zuo—Zhou。HUANG Hong—Wen。
(IVuhanBotanicalGarden，TheChineseAcademy Sciences，W uhan 430074，Chins)
Abstract：Genetic diversity was preliminarily investigated for nine natural populations of two
commercially important species of Actinidia chinensis and A．deliciosa using SSR genetic markers．
Fourteen SSR loci were initially screened，and the res ult showed that high polymorphism existed
in eight of the fourteen SSR primers，which were good reproducible primers．A total of 222 alle—
les were revealed from 8 polymorphism loci．A high level of genetic diversity was detected in A．
chinensis and A．deliciosa，with mean number of alleles per lOCUS A一 17．3(range：12．13—
2O．75)，percentage of polymorphic loci P— 100，and polymorphism information content(PIC)
values range from 0．87 to 0．96 with fin average of 0．936．Moreover，fl large number of common
alleles were found both in A．chinensis and A．deliciosa，suggesting fl very close relationship of
these two taxa．This study provided molecular evidence for explaining the genetic structure of
natural populations of Actinidia and for further uses in making conservation strategy．In addition，
it supplemented population reference for evaluate the system and evolutionary relationship be～
tween A．chinensis and A．deliciosa．
Key words：Actinidia chinensis；Actinidia deliciosa；SSR；Genetic structure；Polymorphism in．
formation content(PIC)
猕猴桃隶属于猕猴桃科(Actinidiaceae)猕猴桃
属(Actinidia)，该属现有 66种、约 118个种下分类
单位(变种、变型)[¨，自然分布非常广泛，其中绝大
多数物种分布于中国。猕猴桃是 2O世纪果树史上驯
收穑日期：2003—06—12，惨回日期：2003—07—24。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30070082)；中国科学院知识创新工程方向性项目(KSCX2一SW一104)，中国科学院武汉植物
团创新工程所长基金(05035117)。
作者简介：栗琪(1978一)，女，硕士研究生，从事分子生物学与植物保育遗传研究(E—mail：liqi1910@aina．corn)。
通讯作者(Author for correspondence．E—mail：hongwen@public．wh．hb．cn)。
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武 汉 植 物 学 研 究 第 22卷
化栽培最成功的果树之一。我国是猕猴桃的原产地，
有着得天独厚的丰富猕猴桃遗传资源，并于 20世纪
70年代开始进行资源的系统研究和利用。中华猕猴
桃(A．chinensis)和美味猕猴桃(A deliciosa)是 目前
用于经济栽培的主要资源[1]。但一直以来，我国乃至
世界上的主要栽培品种比较单一，狭小的遗传基础
势必带来整个产业的脆弱性[2]，因此，培育新的栽培
品种具有重要意义。此外，由于猕猴桃属中普遍存在
自发的种间杂交和种内多倍化现象，因此不同学者
对该属植物种的界定及亲缘关 系存在不同的看
法 引。长期以来，围绕中华猕猴桃和美味猕猴桃分
类地位、亲缘关系的争论十分激烈[61]，品种资源的
混杂现象也十分突出，十分不利于品种改 良和新品
种的选育。随着猕猴桃产业的发展，依托有效可靠的
分子标记技术对中华猕猴桃和美味猕猴桃遗传特性
及系统进化关系进行深入研究是有效地利用这些重
要资源的基础，对我国猕猴桃种质资源的保育利用
有着十分重要的意义。
在 日益发展的众多分子标记技术中，微卫星
(microsatellite)DNA，即简单重复序列(simple se—
quence repeat，SSR)以其广泛分布于基因组、共显
性、重现性好、多态性丰富等特点，广泛应用到植物
分子生态、系统发育与进化、种质资源鉴定和评价等
领域[91u。SSR分子标记技术被认为是居群遗传结
构分析强有力的工具，能为基因流和亲缘关系的精
确测定提供重要参数[9]。目前，RAPD及同工酶标记
仅涉及猕猴桃物种及部分品种，且存在各自的缺
陷[5 引。猕猴桃 SSR位点的大量分离为研究猕猴桃
野生居群的遗传特性提供了基础~13,14]。在目前尚未
见分子标记用于我国野生猕猴桃居群研究的情况
下，笔者运用 SSR标记对我国猕猴桃的两个主要商
业栽培种——中华猕猴桃和美味猕猴桃的自然居群
进行初步研究，拟探讨它们的遗传多样性及亲缘关
系，为我国猕猴桃遗传资源的保护及可持续利用提
供重要的遗传学证据。
1 材料与方法
I．I 材料
供试材料采集于 2002年 4～5月，在猕猴桃原
产地赣鄂边界的幕阜山地区(湖北通山和江西武宁)
采集了4个中华猕猴桃的野生居群，在鄂西的宜昌、
利川及重庆的丰都采集了 5个美味猕猴桃 自然居
群。按照随机取样原则，每个居群取样数约为 20-．
30株，其中仅江西武宁的居群取样数较少。取样试
材为猕猴桃幼嫩叶片。
1．2 方法
1．2．1 DNA提取 选取猕猴桃幼叶或少量保存的
干燥叶片按 Weising等[1‘]改进的植物总 DNA提取
法进行，并用紫外分光光度计与 1 的琼脂糖凝胶
电泳检测DNA的浓度和质量。
1．2．2 PCR扩增及产物检测 按 Huang等[1。 报
道的微卫星位点，选取其中多态性好的 14对引物
(由上海博亚生物技术公司合成)进行筛选预实验，
挑选出 8对稳定性好的 SSR引物用于正式实验，
PCR程序按 Huang等[1。 报道的反应条件及步骤进
行。扩增产物采用 6 的变性聚丙烯酰胺凝胶(6
acrylamide／bisacrylamide 1 9：1。7 mol／L urea in
TBE，pH 8．3)电泳分离和银染检测。在PCR产物
中 加 入 等 体 积 的 loading buffer(98 甲酰 氨，
10 mmol／L EDTA，0．25 9，5溴酚 蓝，0．25 二 甲苯
腈)，在 95℃下变性 3 min。在 Sequei—Gen GT Sys—
tem(BIORAD)电泳仪上进行预电泳和正式电泳。参
照 Echt等[15 报道的方法稍加改进进行银染染色，
凝胶在室温下自然干燥。
1．2．3 数据 判读 与 分 析 参 照 标 准 Ladder
(pBR322 DNA／Msp )判读每个位点的等位基因片
断 大小，使用 Microsat ver．1．5e(http：／／hpg1．
stanford．edu／projects／microsat)初步计 算出各等
位基因在不同居群中的频率分布、每位点等位基因
平均数(A)、多态位点 比率 (P)、居群间分化系数
(Gst)等。采用多态信息指数[16,173PIC(PIC=1一
∑向 。，向 为 位点第 -『个等位基因的观察频率 )
估测中华猕猴桃和美味猕猴桃居群的遗传多样性。
2 结果与讨论
通过对 14对猕猴桃 SSR引物的筛选预实验，
获得了多态性好、扩增带型清晰、稳定性好的 8对引
物L¨ (UDK96—001， UDK96—015， UDK96—016，
UDK96—034，UDK96—040，UDK97—409，UDK97—
413，UDK96—414)，对 4个中华猕猴桃居群、5个美
味猕猴桃居群共计 221个样本进行了扩增，共测得
222个等位基因和少量哑等位基因。等位基因最多
的位点为 UDK96—001(40个)，最少的为 UDK96—
015(18个)。各位点均显示出很高的遗传多态性(见
图 1、图 2)，各个居群均显示出丰富的微卫星多态
性 。
实验结果表明，我国的猕猴桃野生居群具有比
其物种和品种更丰富的遗传多样性。中华猕猴桃居
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第 2期 粟 琪等 ：猕虢桃野生居群的 SSR分析初报
群和美味猕猴桃居群的遗传多态性指数分别高达
0．926和 0．935，美味猕猴桃居群略高于中华猕猴桃
居群 ，但尚未见显著差异。中华猕猴桃居群和美味猕
猴桃居群检测到 的特有等位基因数分别为 1 4和
29．共有等位基因数为 179，有力地支持了两分类群
有着极近的亲缘关系的观点口 。本实验中，供试的
中华猕猴桃经 SSR分析发现几乎都为四倍体样本．
因此研究中缺乏二倍体中华猕猴桃样本，在今后的
研究中将进行更全面的居群取样以获得二倍体中华
猕猴桃样本，深入探讨二倍体、四倍体中华猕猴桃及
美味猕猴桃三者的关系，为确定四倍体中华猕猴桃
和美昧猕猴桃的起源问题提供确凿证据。
。
圉 1 部分美味豫豢佛样本在 UDK97—409位点上扩
增的SSR谱带(其中M为pBR322DNA／Msp I Ladder—
Marker．1～2O依欢为宜昌雾渡河居群的 1～20号样本)
Fig．1 SSR patterns of some A，deliciosa in UDK97—
409 Iocus(M is pBR322DNA／Msp，Ladder·I一20 are
the sample of population in W uduhe of Y[chang )
围 2 部分中华猕箍槐样本在 UDK96—015位点上扩增
的 SSR谱带(其中 M 为 Marker，l～l2依次为
通 山县九宫山居群的第 1～l2号样本)
Fig-2 SSR patterns of some A．chinen~s in UDK96—
01 5 locus(M Ls pBR322DNA／Msp f Ladder，l一12 are
the sample of population in Jiugongshan of
Tongshan County．Hubei)
中华 猕猴 桃 居群 问平 均分 化 系数 (Gst)为
0．029。美味猕猴桃居群问平均分化 系数 (Gst)为
0．031，中华／美味复台居群间平均分化系数(Ost)为
0．006，说明仅极少数遗传变异存在于居群间．绝大
部分存在于居群内部。由此可见，中华猕猴桃和美昧
猕猴桃的种间差异并不显著，这与两分类群有着极
近的亲缘关系相吻合 。
比较供试的 9个居群的位点平均等位基固数、
遗传多态性指数及多态位点百分率可看出猕鼗桃野
生居群的SSR遗传多样性甚为丰富。居群位点平均
等位基因数(A)为 12．13～20．75．PIC值为 0．87～
0．96，多态位点百分率(P)为 i00．均高于同工酶和
RAPD在猕猴桃物种及品种上的检测值 ’”]。而猕
猴桃微卫星的种问高多态性、复等位性及杂合性显
示出其在猕猴桃系统发育研究中具有巨大的潜力，
可成为一种有效工具，用来研究种与种亲缘关系、进
化并为其分类提供分子水平上的依据。本研究显示
的猕猴桃野生居群的丰富SSR遗传多样性为今后
的猕猴桃产业大发展，优 良品种的选育，珍稀濒危猕
猴桃资源的保护，野生资源的可持续利用，提供了坚
实的科学依据和明确的方向
在本研究中，有数个位点出现哑等位基因，哑等
位基固如果不被识别出来，则会导致估测的群体中
纯台子过多。在今后的实验中，应进一步完善扩增条
件，重新调整引物的设计 ，以便成功地扩增出所有的
等位基因，获取准确的数据信息 同时．还应该增加
采样的野生居群数．广布于猕猴桃自然分布的各个
区域，探寻其群体遗传与生态格局的协同关系 此
外，除核微卫星标记外，单亲遗传微卫星标记可以提
供更多关于群体历史的信息，线粒体、叶绿体 SSR
标记有其自身的优点 。’ ，对单亲和双亲遗传的微
卫星进行综合分析可以对群体结构和基因流等群体
遗传学参数提供更详尽的资料，深层次的探索猕猴
桃种质资源的遗传多样性及系统进化等诸多问题
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