全 文 ：武汉植物学研究 2008，26(3)：235～239
Journal of Wuhan Botanical Research
野生大豆 SAMS同源基因的克隆及分析
樊金萍 ，柏锡 ，李 勇 ，纪 巍 ，王希 ，朱延明
(1．东北农业大学园艺学院，哈尔滨 150030；2．东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030)
摘 要：硫腺苷甲硫氨酸作为甲基供体在转 甲基反应 中起到重要作用。从低温(4℃)、高盐(200 mmol／L NaC1)及
干旱(30％PEG)处理的东北野生大豆幼苗叶片中提取总 RNA，经反转录合成 cDNA第一链 ，以 cDNA第一链为模
板 ，应用已知的EST序列设计一对 PCR引物扩增 SAM合成酶基因的全长序列，最后经 BLAST比较分析，确定所获
得的 SAMS基因序列完整性。所得序列长1185 bp，具有完整的开放读码框 ，编码 394个氨基酸 ，与棉豆和苜蓿的
SAM合成酶基因的核苷酸序列的同源性分别为89％、85％。构建了以pET一32b为基础的原核表达载体并进行原核
表达分析，分析 SAMS基因的表达情况。为后续的抗逆性功能验证奠定基础。
关键词：野生大豆；SAM合成酶；基因克隆；原核表达
中图分类号：Q781；$565．1 文献标识码：A 文章编号：1000—470X(2008)03—0235—05
Cloning and Analysis of Homological Genes SAMS from Glycine soja
FAN Jin—Ping ，BAI Xi。
，
LI Yong2
，
JI Wei ，WANG Xi ，ZHU Yan—Ming。
(1．Colege ofHorticulture，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China；
2．Colege of Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)
Abstract：S_aden0sylmethi0nine(SAM)plays important roles in trans—methyl reactions．Under drought
(30％PEG)，salinity(200 mmol／L NaC1)and low temperature(4℃)，total RNA was extracted
from the leaf of Glycine soja and the first strand of cDNA was synthesized with reverse transcription．S—
aden0sylmethi0nine synthetase gene(SAMS gene)was amplifed by PCR with the first strand cDNA as
template and a pair of primers which was based on constructed ESTs sequence．Full—length SAMS gene
sequence was obtained by BLAST comparison．According to the analysis，completed sequences of SAMS
gene was integrality．The sequence of the SAMS gene is 1 1 85 bp in length with an opening reading flame
(ORF)encoding 394 amino acids．The cDNA sequence shows a signifcant homology to the SAMS genes
from Phaseolus lunatus(89％)，Medicago sativa(85％)．There was a prokaryotie expression vectors
based on pET一32b had been constructed and prokaryotic expression analyzed；To lay a strong foundation
for resist adversity function analysis through situation of genic expression analysis．
Key words：Glycine soja；S—adenosylmethionine synthetase；Gene clone；Prokaryotie expresion
低温、干旱、盐碱是 目前农业生产中经常遇到的
问题，它们不仅限制了农作物的分布，而且也降低了
产量和质量。因此农业生产中培育耐低温、干旱、盐
碱作物品种就显得尤为重要。近年来，随着植物抗
渗透胁迫基因工程的发展，新基因不断涌现。转基
因植物对渗透胁迫的抵抗能力不断增强，而解决问
题的关键是找到能够直接利用的抗性基因。
s一腺苷甲硫氨酸(简称 SAM)，是生化反应中的
主要甲基供体。它在正常的磷脂、DNA、RNA和蛋
白质甲基化反应和基因表达中提供甲基基团 ， ，
而这些反应对细胞结构和功能影响都至关重要，其
含量在代谢过程中的细微变化都可能对细胞的生
长、分化、功能产生巨大的影响。如对细胞中一些基
因的表达、膜的流动性、多胺生成等都起着关键作
用 J。多胺是生物体代谢过程中产生的一类次生
物质，在调节植物生长发育、控制形态建成、提高植
物抗逆性、延缓衰老等方面具有重要作用 J。
s一腺苷甲硫氨酸合成酶催化 甲硫氨酸和 ATP
生成 s一腺苷甲硫氨酸(SAM)，SAM既是植物体内转
甲基反应 的甲基供体及 多胺 和乙烯合成 的前
体 ，同时也是植物生物碱合成过程中甲基化反
应唯一的甲基供体，因而对 SAM合成酶的研究在植
收稿 日期：2O07一O9—26，修回日期：2007—11-23。
基金项 目：国家 自然科学基金资助项目(30570990)；黑龙江省教育厅科研项 目(11521023)资助；东北农业大学科研项 目资助。
作者简介：樊金萍(1972一)，女，理学博士，东北农业大学园艺学院教师，主要从事园林植物育种及生物技术研究(E—mail：fan—xuer2000
@yahoo．corn．cn)。
{ 通讯作者(Author for corespondence)。
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武 汉 植 物 学 研 究 第 26卷
物逆境生理、衰老生理、植物生物代谢及其调控研究
上均具有重要的意义 ’⋯’“ 。
近年来，各国学者在美洲黑杨 (Populus del—
fo ds)、水稻(Oryza sativa)等多个物种上已成功克隆
SAM合成酶基因 (简称 SAMS)，并研究了该基因
对植物逆境和衰老调节中的作用 ¨，但野生大豆中
SAMS基因尚无研究报道，它在野生大豆逆境生理
和衰老生理过程中的调节作用尚不清楚。本研究以
东北野生大豆盐胁迫全长 cDNA文库和EST数据库
为基础，根据已知基因芯片的表达谱，筛选出与渗透
胁迫相关的 EST，并克隆 SAMS基因全序列。通过
进行序列分析，初步判定基因的表达情况，并应用原
核表达分析来验证该基因的表达情况。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 植物材料
野生大豆(Glycine s咖)5o1o9由吉林农科院提供。
1．1．2 实验试剂
大肠杆菌 DH5c~、BI21(DE3)由东北农业大学
植物生物工程研究室保存。质粒 pGEM T、pET一32b
由东北农业大学植物生物工程研究室保存，pGEM．T
Easy Vector购 自 Promega公 司。TaKaRa Taq、
PyrobestⅢ DNA Polymerase
、限制性 内切酶、T4 DNA
Ligase、DNA Marker DL1 5000、DNA Marker DL2000
购自大连宝(TaKaRa)生物工程公司，dNTP、Wizard@
SV Gel and PCR Clean—Up System购 自Promager公
司，High Pure gmo Sample Preparation Kit购自Roche
公司，PCR引物、基因测序和基因合成由上海生物
工程公司完成。其它抗生素类均为国产分析纯。
1．2 实验方法
利用已知的野生大豆与大豆基因表达分析芯片
杂交所得的基因表达谱 ，推断盐胁迫EST库中各
基因在渗透胁迫早期的表达情况，选取了渗透胁迫
早 期上 调表达 的硫 腺苷 甲硫 氨酸合成 酶基 因
(S—aden0sylmethi0nine synthetase，SAMS)。结 合该
EST所在的序列双向测通的结果进行下一步实验。
1．2．1 材料的种植与处理
野生大豆种子常规灭菌后接种到含 0．6％琼脂
的1／2 MS培养基上培养，待幼苗展开第一片三出复
叶时，洗去培养基，置清水中培养 1 d后，将幼苗根
浸于低温(4~C水)、高盐(200 mmol／L NaC1溶液)及
干旱(30％PEG溶液)中，在 1 h后分别提取野生大
豆根、茎、叶的RNA。
1．2．2 基因的PCR扩增
野生大豆 RNA的提取采用 Trizol法进行。根
据已经获得的 EST序列，应用软件 Primet 5．0在
ORF区外侧设计引物，引物由上海生物工程公司
合成。
上游引物：5’一AGA TGG CAG AGA CAT TCC T
～ 3’；下游引物：5’一TGC ACC邢 CAA TAC CTA
TAA 一3’。
PCR反应体系为：灭菌ddH2O 14．3 ；10 Xbuffer
(Mg free)2．5 L；Mg“(25 mmol／L)3 IxL；dNTP
Mixtm-e(各 2．5 retool／L)2 ；P一1(10 b~mol／L)1 ；
P-2(10 ixmol／L)1 L；模板 DNA 1 IxL(<1 I．Lg)；
rTaq 酶 (5 U／txL)／Pyrobest DNA Polymerase
0．2 txL。
PCR扩增条件：94℃7 min一(94~(2 30 s一55℃
30 S 72℃ 90 S)X 30 72℃ 10 min 4℃终止
反应。
PCR产物用 0．8％ 的琼脂糖凝胶电泳检测；
用 DNA快速纯化回收试剂盒回收 PCR产物 中约
1．2 kb的DNA片段；回收片段与 pGEM—T载体的连
接。转化E．coli DH5a，菌液涂布于含有氨苄青霉素
(100 I~g／mL)的 LB平板上于 37℃培养过夜，用牙
签挑取白色菌落，提取质粒筛选阳性重组子送上海
生物工程公司测序分析。
1．2．3 基因的序列分析
将所得的序列提交到 NCBI网站进行 BLASTn
分析。通过 ORFfinder和 GENSCAN程序查找全长
序列的开放阅读框 (ORF)。并将其翻译成氨基酸
序列 ，采用 DNAMAN的 pI／MW程序计算分子量及
等电点，TMHMM-2．0程序分析跨膜区，并用 Clustal
x程序对蛋白序列进行多重比对。
1．2．4 基因的原核表达载体构建及原核表
达分析
SAMS基因原核表达引物：SAMS一1：5’ CAT
垒 (Nde I)A GAG ACA TFC CT一3’；SAMS-2：5’一
TTA垒垒 (Hind II)CTC CCA CTF GAG G一3’。
PCR扩增产物为 1191 bp。PCR反应体系同上。
PCR扩增 条件 ：94℃ 7 min一 (94~(2 30 s一
55℃ 30 s 72℃ 180 S)X 30 s 72℃ 10 min
4~C终止反应。PCR产物回收、连接、转化、酶切检
测 、测序同上。将测序正确的进行表达产物的诱
导及 SDS—PAGE电泳，分析 SAMS基因的原核表达
情况。所用载体为pET32b，菌株为大肠杆菌 BL21
(DE3)。
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第3期 樊金萍等：野生大豆 SAMS同源基因的克隆及分析 239
码区的高度同源与非编码区的不同以及表达模式的
差异表明他们虽然编码一个相似的蛋白，但表达和
功能可能相差甚远，二者虽然催化相似的反应，但在
分工上可能存在差异。这些数据说明我们所获得的
cDNA的确为野生大豆的 SAM合成酶基因。
pET系统是有史以来在E．coli中克隆表达重组
蛋白功能最强大的系统。目的基因被克隆到 pET
质粒载体上，受噬菌体 T7强转录及翻译信号控制；
表达 由宿 主细胞 提 供 的 T-／RNA 聚合酶 诱 导。
T-／RNA聚合酶机制十分有效并具选择型：充分诱导
时几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导
表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总
蛋白的50％以上。该系统另一个重要的优点是在
非诱导条件下，可以使 目的基因完全出于沉默状态
而不转录。本实验所选载体 pET一32b，它含有 T7强
启动子，SAMS基因插入到载体后，可以保证密码子
能被正确阅读、正确终止。
在融合蛋白上设有组氨酸标签 His·Tag，它是6
个组氨酸的连续排列，它的设计一方面利于所表达
融合蛋 白的分离纯化，另一方面利于融合蛋 白的
Western Blot检测。在融合基因设计时，将 His·Tag
基因序列置于 SAMS基因3’末端，由于基因转录顺
序是由5’一3’端，并且蛋 白质合成是 由 N端一C
端，当基因序列出现移码、转录或翻译提前终止等情
况时均不会融合上 His·Tag，因此可利用是否能检测
出组氨酸标签来判断融合蛋白表达的完整性。
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