全 文 ：武汉植物学研究 2006，24(2)：100～105
Journa／D， Wuhan Botanical Research
番茄 calnexin基因的克隆及胁迫表达分析
李明辉，孙 颖，赵春梅，孙爱清，胡小然，刘 箭
(山东师范大学生命科学学院，济南 250014)
摘 要：Calnexin是内质网中重要的类凝集素分子伴侣，其主要作用是辅助糖基化蛋白的折叠和装配，调节内质网
中的ca2 稳态平衡和 ca2 信号传导过程。从番茄(Lycopersicon esculentum)的 eDNA文库中克隆到 calnexin eDNA
全序列，将其命名为Lecnx61．0，并以其 3’端 DNA片段为探针对番茄基因组进行 Southern分析 ，结果表明Lecnx61．0
在该基因组中仅有一个拷贝；Northern和Western分析表明，Lecnx61．0的表达还受热激、冷害、盐害和内质网应激诱
导剂衣霉素的诱导，但对干旱胁迫没有明显的反应。LeCNX61．0蛋白对 ca2 亏缺胁迫的响应呈现组织特异性 ，但
高浓度 ca 并不影响各组织中LeCNX 61．0蛋白的含量，实验结果表明 LeCNX 61．O蛋 白可能在植物抵抗特定的环
境胁迫中发挥作用。
关键词：Calnexin；分子伴侣；Ca“胁迫 ；环境胁迫
中图分类号 ：Q74 文献标识码：A 文章编号：1000-470X(2006)02-0100-06
Cloning and Stress Expression Analysis of Calnexin in Tomato
U Ming—Hui，SUN Ying，ZHAO Chun-Mei，SUN Ai-Qing，HU Xiao—Ran，LIU Jian
(Colege ofufe Science，Shandong Normal University，Ji’nail 250014，China)
Abstract：Calnexin，an important lectin-like chaperone in endoplasm reticulum ，can assist in protein fol—
ding an d modulate Ca“ homeostasis in cel1．A cDNA of 1 964 bp encod ing a full—length calnexin was
cloned from Lycopersicon esculentum，an d designated as Lecrtx61．0．A single copy of Lecrtx61．0 was found
in tomato genomic DNA by Southern—blot analysis．The levels of mRNA and protein of Lectx61．0 were in—
creased when plan ts were treated by heat shock，chiling shoc k，salinity stress an d endoplasm reticulum
stress，but Lecrtx61．0 had no obvious response to drought stress．The protein of I~CNX61．0 only in speci-
tic tissues made respo nse to Ca¨ depletion． Howerver，the expression of I_eCNX61．0 Was not induced by
high concentration of Ca“．These results suggested that I~CNX6 1．0 might play an important role in
stress toleran ce．
Key words：Calnexin；Molecular chaperone；Ca“ stress；Abiotie stress
内质网是真核生物膜蛋白和分泌蛋白合成的主
要部位，进入内质网中的蛋白一般需要经过化学修
饰，其中糖基化修饰最为常见，而糖基化蛋白的折叠
通常需要内质网中的类凝集素分子伴侣的协助，类
凝集素分子伴侣能专一地识别以 N一糖苷键连接的
新生糖蛋白，辅助它们进行折叠和装配。内质网中
类凝集素分子伴侣家族主要包括跨膜蛋 白calnexin
和可溶性蛋白 calreticulin。Calnexin、calreticulin和
辅助分子伴侣 ERp57共同组成内质网中专一的糖
蛋白成熟系统，即 ealnexin循环体 系。Elgaard和
Frickel⋯通过对基因敲除后的显性小鼠的研究，发
现 calnexin循环系统几乎介人了所有的动物糖基蛋
白的合成、折叠和成熟过程。Calnexin是一种 I型
跨膜蛋白，其位于内质网腔内的部分与 calreticulin
在序列和空间结构上十分相似 ，具有保守的寡糖链
结合域和ca“结合域。关于 calnexin的最初报道是
发现它参与 MHC1分子的折叠和装配，从而暗示了
calnexin在细胞内的功能L2 J。进一步研究表明，Cal—
nexin参与 MHCII、红血球凝激素、泡状口腔炎病毒
糖基蛋白、P-糖蛋白、T细胞表面受体和乙酰胆碱受
体等新合成的多种糖蛋 白的折叠和装配过程 】，并
且发现 calnexin参与内质网中的质量控制过程 ，确
保只有正确折叠的糖蛋白才能转运出内质网。
Calnexin除了辅助糖蛋白的折叠和装配外，还参
与调节细胞内的ca 稳态平衡和ca 信号传导过
程。Roderick等发现在非洲爪蟾卵母细胞中calnexin
收稿日期：2005-09-27，修回日期：2005—12-22。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30270132)。
作者简介：李明辉(1980一)，女，在读硕士研究生，研究方向为植物基因工程。
· 通讯作者(E-mail：ljlsd@beelink．corn)。
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第2期 李明辉等：番茄calnexin基因的克隆及胁迫表达分析 101
能与 SERCA2b结合并调 节 Can 的吸收过程 。
Calnexin也可以辅助 IP。受体的折叠，可能在 Ca“
的释放 过 程 中具 有一 定 的作 用 。Can 载体
A23187使裂殖酵母的内质网中产生 Ca“亏缺时，
可诱导 calnexinl基因的表达 J。植物细胞中也存
在类凝集素分子伴侣 ealnexin，目前还不清楚植物
ealnexin的表达是否受 Can亏缺的影响。
Calnexin基因的表达还受环境胁迫影响，热胁
迫可诱导裂殖酵母中calnexinl基因的表达 ；衣霉
素可以抑制糖蛋白的糖基化过程，从而使内质网中
聚集大量的未折叠蛋白使细胞产生内质网胁迫反
应，有资料表明内质网胁迫条件下裂殖酵母 calne．
xinl基因和拟南芥中 cnxl基因的表达上升 ；但是
关于植物类凝集素分子伴侣 calnexin基因对其它逆
境胁迫的反应还未见报道。
笔者对番茄 calnexin cDNA(Lecnx61．0)的分子
克隆以及 Lecnx61．0对 Ca2 胁迫、环境胁迫和内质
网应激的响应情 况进行 了研究，以期 了解 C—
NX61．0蛋白在植物逆境胁迫过程中的变化情况。
1 材料与方法
1．1 植物材料及处理方法
1．1．1 植物材料
番茄(Lycopersicon esculentum)(中蔬 4号，中国
农业科学院提供)植株在温室中培养，生长条件为：
昼夜温度28oC：20oC、光周期 14 h：10 h(光照 ：黑
暗)、相对湿度约为40％：60％(白天 ：黑天)。
1．1．2 胁迫处理方法
生长40 d的番茄植株分别进行高温、低温、盐
和渗透胁迫处理。高温处理是将番茄植株置于 34、
36、38、40、42℃和44℃的光照培养箱中处理 3 h，对
照为28~C处理3 h；低温处理是将番茄植株置于4℃
的光照培养箱中冷处理 6、12、24、48 h和 72h，对照
为28oC；盐胁迫处理是用含 NaCI的 Hoagland营养
液浇灌番茄植株，浓度每天递增 50 mmol／L达终浓
度(0、50、100、200 nunol／L和300 retool／L)持续处
理 3 d；渗透胁迫处理是用含 PEG的 Hoagland营养
液浇灌番茄植株，浓度每隔一天递增 10％达终浓度
(0、10％、20％、30％和40％)，分别持续处理2 d。
番茄种子在液体 MS培养基中振荡培养 10 d，
至番茄幼苗刚刚产生第一片真叶时进行如下处理：
CaCh处理和 EGTA处理是将番茄幼苗分别浸泡在
0、10、50 mmol／L和 100 mmol／L的 CaC12溶液中和
0、5、25 mmol／L和50 nunol／L的 EGTA溶液中，振
荡 12 h，取子叶或幼根提取蛋白；衣霉素处理是将番
茄幼苗浸泡在 5 t~JmL衣霉素溶液中，振荡 1、2、
6、12 h，取整株幼苗提取蛋白。
1．2 番茄分子伴侣 calnexin基因的分子克隆
利用番茄 cDNA噬菌粒 文库 转染 SOLR细
胞，挑取单克隆测序，对 1000个 EST数据进行分析
后获得一个类似 calnerin cDNA的片断，以此片断为
探针，经随机引物法用 -弛P-dCTP标记探针，筛选
cDNA文库，获得阳性克隆，方法参照文献[9]进行，
提取阳性克隆的质粒送交上海生工生物工程有限公
司进行测序，获得全长的番茄 coJn~in cDNA。
1．3 Southern和 Northern分析
以番茄成熟叶片为实验材料，用 CTAB法提取
基因组 DNA¨ ，然后 分别 用 EcoR I，EcoRV和
胁 Ⅲ完全酶切。选取Lecnx61．0基因3’端502 bp
(1 106—1 608 bp，是 Lecnx61．0基因的高变区)的
DNA片断，用( 32p—dCTP标记探针，在高度严谨的
条件下(65℃杂交过夜 ，0．1×SSC／O．1×SDS，68oC
洗膜)进行 Sou~em杂交 J。用异硫氰酸胍法提取
番茄成熟叶片的总RNA【to 3，参照Sou~em探针制备
方法和高度严谨杂交条件，进行 Northern杂交。
1．4 番茄 LeCN61．0抗体的制备和 Western分析
以Lecnx61．0 eDNA为模板，利用 PCR扩增 c-
nx61．0的 C端特 异区 (编码 LeCNX61．0蛋 白的
Ile∞ 至A 弛区间的肽链，为 I．~CNX61．0蛋白的特
异区，以此保证抗体的特异性)。PCR用的正向引
物为 5’TCGGATCCATrGGCATrGAGATC 3’(下划
线部分为 BamH I位点)，反向引物为 5’AGGAAT-
T
— CGACGAGGAGCAGCAC 3’(下划线部分为EcoR I
位点)。扩增后获得 502 bp DNA片断．该片断经
BamH I和 EcoR I双酶切后，与 pGEX-6P-3载体连
接，重组表达载体转入 DE3菌株，利用0．1 mmol／L
IPTG诱导蛋白质表达 ，表达的 GST-I．~CNX61．0融
合蛋白经过谷光甘肽 S-转移酶(GST)亲和纯化后用
作抗原，免疫新西兰兔，直至获得抗血清。
低 温 下，用 缓 冲 液 (10 mmo~L Tris．HC1，
pH 8．0；1 mmol／L PMSF)研磨植物样品，提取蛋白，
蛋白样品用Bradford法定量ll¨，取等量的样品用于
Western 分析o
2 实验结果
2．1 LeCNX61．0的分子结构特征
利用简并引物进行PCR扩增获得一个约6OO bp
的cDNA片断，利用此 eDNA片断作为探针，筛选
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武 议 植 物 学 研 究 第24卷
cDNA文库 ．从 阳性克 隆中被 得 l964 bp的 CU~．rtx．％bt
cDNA全序(图 I)．该cDNA含有 l6l7 bp开放读码
— — — — — — — —
框，由此读码框推导出的多肽含538个氨基酸残基，
计算分 子量为61 0 kD．命名为 c∞61．O(Genbank
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固 1 Lecn~1．0基因的桉酸序列和氨基酸序 到
Fig 1 Nucleotide aI1d deduced ami r岫 acid seqt~ences of Leera61．0 germ
号：AB218598)。Sou~em分析表明D_,eax61．0基因在
番茄基因组中仅有一个拷贝(图2)。通过在线P—sort
软件预测LeCNX61．0的N端含有27个氨基酸组成的
信号肽序列(图I单下划线部分)；C端有大约50个亲
水陛氮基酸，靠近c端的460～48l多肮区为疏水区，
推测为LeCNX61．0的跨聪区(图 1职下划线部分)；
[~CNX61．0的c末端序列为RR FRIDN，该序列与大
豆CMne~n的c末端RRPRRET序列 、拟南芥Calncxin
的c末端RQPRRDN序列 ．以及人Calnexin的c末端
RKPRRE序列(人的Calnexin蛋白滞留在内质网中所
H：H／ridⅢ ；刚：EcoR I；Ev：EcoRV
探钎所对成的Leow51 0序列中具有
一 十 E RV限制性 内坊 酶境点
Fhem is u si re( tGoRV restriction ciIz —
file in Lecnx61 0 according Io the probe
圉 2 c 1．0的 th m 分析
Fig 2 Southern blol analysis
0r cn：~61．0
需的序列)类似，推测是番茄 LeCNX61．0蛋白的内
质网滞 留唐号。BLASTX同源性分析表明，LeC．
。 ． 毪
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第 2期 挛明埠等 ：番茄 calnexin基因的 克隆 及胁迫 表述 分析
NX61．0与已报道的大豆calnexin序列同源性最高．
蛋白水平上的同源性达73％．与拟南芥的CNXI同
源性 为 66％ ，与人 的 ca1．nexin同 源性 为 41％。 对
人、裂殖酵母、番茄和拟南芥的 calnexin氪基酸序列
进行保守性分析，发现 LeCNX61 0的 N端部分相当
保守(图 3) 包含 3个 Ca 结合基序(I-DPD／EA—
KPEDWDD／E)(圈3中前 3个方框)，和4个寡糖结
台 链区(GXWXX_PXIXNP序列)(图3中后4个方
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曲3个力框袋示孤侧的 cn卜站台位点，后 3个 框 测f丹攫凝集衷结台位点 ·表示终止子
The fi~s,t thr,~ 哪19 indicated c 一一tmtding lI and 1he follo~hng lr h⋯ p I佃【 i for[~tin-hinding sl_ ．⋯is ’ g c1) n
圉 3 LecNxl；l_0氨基 醴序 列的保守性分析
Fig 3 Alignmenl of amino acid sequen∞5 of ealnexins from L ￡^u~eruunt(LE AB218598)．A．t~lhTma
(AT，NM—L25573)， sapien~(H ．NM
一
1301746j pomJ~e(SP，NM
一
001019043)
框)，LeCNX61 0具有 calne~in蛋白的典型分子特
征。
2．2 环境胁迫对Lecnx61．0转录水平的影响
40 d龄的番茄植株经4℃处理 24 h、38℃处理
3 h、300 mmol／L NaC1处理 3 cI以 及 40％ PEG处
理2 d，提取番茄叶片总 RNA进行 Nortlaern分析，结
果表明热和盐胁迫诱导 Leuo．x61 0 mRNA的累税．
但 Lecnx61．0对干早胁迫反应不 明娃(图 4)
2．3 环境胁 迫~ cn．v61．0基 因蛋白水平的影响
Lec．v61．0基 因在 蛋 白水 平上 对环境 胁迫 的反
应与 mRNA水平上的反应一致，但是 如转录水平
CK 对 ：C．1d．4‘L持 处耻 24 h；NaCI．300 m am~l／L NaCI处 理
3 I；I 砌 40’ PE( 处 理 2 d； BL．38 热 处理 3 h
L：k Conln J1；C,>lit Lor “plant tre．al at 4 ：for 24 h：NaC] arIt
tleal~t wlIh 31 Flin一1 】 NaC1 n r 3 d：D=ml4ht PL nt treated with
4(1|；刍 PFt：h 2 d：Heal Plantt~ led at 38℃ for 3 h
图 4 冷胁迫 、盐胁迫 、干旱 胁迫和热胁迫条 件
下 Lecnx61．0的转录分析
Fig 4 。。1】le 1tm3_~eripl【evels c 】．0 under var~olm
圳 e co／l,J Jtions．20 “g oftotal RNA were loaded i／l
each l且ne for Northern artalysis
塾
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武 汲 植 物 学 研 究 第 24卷
上的变化明显。经 w 【em分析表明，热激处理时
36。c足LeCNX61．0热激反应的阈值，处理温度达到
42 时 I~CNX61 0的蛋白表达最高，当温度继续升
高达到 44℃时，LeCNX61 0的累积量有所下降【图
5：A)。LeCNX61．0不但被高温诱导，也被低温诱
导，4℃冷处理导致 LeCNX61 0的蛋白含量逐步 J=
升．经 24 h低温处理，LeCNX61．()累积量达到高峰
(图5：l ) ，LeCNX61．【)的表达也被盐胁迫诱导，当
处理盐浓度升高到 1o0 13tool／L时，I．eCNX61．0蛋
白含量明显上升，盐处理浓度达到 200 mmo~l 时．
~CNX61．0含量塌高．但盐浓度升高到 300 mmobL
时，LeCNX6I．O含量开蛤下降，但卡}I对含量仍然高
于对照(圈 5：C) 为查清盐诱导 LeCNX6I．0是由
于离子毒害还是渗透胁迫．作者分析了 PEG处理后
LeCNX6l 0的表达，结果表明 LecNX61 0不受渗透
胁迫羼导(图 5：1))，盐羼导 I~-CNX6】．0表达 的起因
可能是离子胁迫
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圈 5 各种环境胁迫条件下 LeCNX61．0
蛋 白的 Western分析
Fig 5 W s ¨l bl0t⋯ lv 1 of l~tNX61 0 il rlt~e r
ahiotle stress cll1iditlfill
2．4 LeCNX61．0嚣 白对衣 霉素 、CaCI，和 EGTA
处理的响应
取 Ms液体培养 】0 d的番茄幼苗浸泡在5 p-g／
n L．衣霉素溶液中，振荡培养不同刮 ．提取幼苗总
蛋白进行 ~,zesterl blot分析，坫果表明 LeCN2~61．0
受衣霉索诱导，而且随~lqIN的延长LeCNX61．0的蛋
白含量不断增加(圈6：A)
取 MS液体培养 l0 d的番茄幼苗浸泡在不同浓
度的CaCI 和 EGTA溶液巾 振荡培养 I2 h，提圾蛋
(k I h I 2
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搬苗培养册 1幼 I 2 h．取2 lnrl妊的般尖挺取蛋13 C：币l；i浓
匿CaCI：(nmmL／L)中振 处理需 幼ff I 2 h．取子I¨ L)和
2 ’k 土后的幼舣(R)提取噩向 D：不同艰艟 EGTA(mmnl／
1)巾振蔼处堙番茄动 I2 h，戢于叶1】)和2 nlm【乇撒土后的劬
报(It)挺取蛋 白
A：Se~lling treated with 5 m1．tunit~myeil1 for dife~nt h{岍
1he pn*~eln~ ples⋯ xtT ted from the whole lcm3~to ~csling·
l3·SetMling Inmletl with 50Ⅲ l¨L，I CtCI or diferenI coneentnti⋯
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t~eted fo⋯ “t L} nf 2 n】m long；(：：Seedling treattM th difie n【
o：,ncentrali．ns‘ CaC]，for l2 h： D：Sculing tre~led with dife~nt
c,ncentrali,⋯ f EG IA(m ／I，)for l2 h rhe prt~tein㈣ [es for
C and I)⋯ eximcled h ~~y Lcd,ms【】 nI the n ，b ~cludin
HxlI tips o r"2 mm king／[i】
图 6 衣 霉素 、CaCI：和 EGTA 对 LeCNX61．0
表达的影 响
Fig 6 Tile ef~?ks tut6eamyei~l
，Cat：l and EG rA 0¨ the
expression of DeCNX61 0
白进行 Westem blot分析，结果表明 EGTA处理时，
诱导2 rtlqfl长的根尖组织中 I．CNX61．O表达上升
(图6：B)，但自根尖 2 m rl i乇后的根中和子叶中
LeCNX6I．0的含量几乎没有变化(图6：C．D)
3 讨论
Ca1．nexin位于内质网腔内的部分具有保守的凝
集索结合域和多肽结合域；井具有寓含脯氨酸的保
守区，此保守区是重要的 ca 结合域．而且是结合
二硫键 异构 酶 ERp57所必须 的 一。所 以 I c．
NX61．0内质网的腔内部分在物种之间相当保守是
与它的功能区位于此部分有关(图3)
逆境胁迫时．内质嘲内出现大 未折叠的蛋白．
出现内质网胁迫现象．诱发内质刚中的一系列反应．
其中包括来折叠蛋白反应(u~bld protein response．
UPR)，UPR会诱导 内质网中的 Calnexin、Cal~ticu—
tin、BiP和 PDI等大量分子伴偶和辅助折叠因子的
表达上调 帮助内质 网中聚集的蛋白进行正确折
叠 ” 衣霉素可以阻止糖蛋白的糖基化，是典型的
UPR诱导剂，我们用衣霉素处理番茄幼苗后，LeC—
NX61．0的蛋白含量逐渐上升(图6：A)，这与拟南
芥中c—l基因受衣霉素诱导的报道一致 环境
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第 2期 李明辉等：番茄 calnexin基因的克隆及胁迫表达分析 105
胁迫也可诱导内质网内积累大量的未折叠蛋白，环
境胁迫时诱导 Lcenx61．0基因的表达可能与胁迫诱
导了未折叠蛋白反应有关。盐胁迫对 CNx61．0
蛋白的诱导十分明显(图5：C)，但 I_~CNX61．0蛋白
对 PEG导致的水分胁迫没有明显的反应(图5：D)，
猜测 I_~CNX61．0被盐胁迫诱导可能起源于离子毒
害。
内质网中的 Ca 亏缺会导致错误折叠蛋白的
积累，使内质网产生 UPR反应，即导致 内质网中分
子伴侣的表达水平上升 ¨。作者用 EGTA处理番
茄幼苗时，在 2 nln长的根尖组织中，I_eCNX61．0蛋
白的表达强度随 EGTA浓度升高而上升(图6：B)，
这与动物及微生物细胞中 Can损耗可诱导内质网
中分子伴侣表达上升的结果相一致，但对番茄子叶
和白根尖 2 nln长后的幼根而言，I_eCNX61．0蛋 白
含量不受 EGTA处理的影响(图6：C，D)，此现象可
能是在 2 nln长的根尖组织中，细胞中没有液泡或
液泡较小，此时的细胞 中内质网是主要 的 Can库
(类似与不含液泡的动物细胞)，随着细胞的成熟，
液泡逐渐成为植物细胞重要的Ca 库，中央大液泡
可能会阻止细胞中产生 Can的吸收和释放而形成
的Ca2 波动 ¨，维持细胞内ca 的稳态平衡。
综上所述，Lecnx61．0基因胁迫诱导模式的多样
性，推测 I-eCNX61．0蛋白可能在植物抵抗特定的环
境胁迫过程中发挥作用，但 I_~CNX61．0在逆境胁迫
中的具体功能还不清楚，这有待于通过过量表达、反
义表达或突变等的方式进行进一步研究。
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