全 文 ：文章编号: 1007-0435( 2001) 01-0021-04
苜蓿褐斑病的离体叶接种研究
袁庆华,　张文淑,　李　敏
(中国农业科学院畜牧研究所, 北京 100094)
摘要: 研究和鉴定苜蓿褐斑病抗病性的离体叶接种技术。结果表明,离体叶接种鉴定比传统的整株鉴定效率高,结
果可靠。在0. 3%水琼脂培养基中加入 50 Lm/mL 苯骈咪唑,即可达到最佳保绿效果。接种所需的适宜条件是,相对
湿度接近100% ,温度 20℃,接种时间 20h,无光照。培养所需的适宜条件是,生长箱内光照(光强度 9000lux )和黑暗
每 12h 交替一次, 有光时 22℃, 无光时 18℃。
关键词: 苜蓿褐斑病; 离体叶组织; 接种
中图分类号: S 541; S812. 6　　　文献标识码: A　
Study on Excised Leaf Tissue Inoculation of Common Leaf Spot in Alfalfa
YUAN Qing-hua, 　ZHANG Wen-shu,　LI M in
( Instit ut e of Animal Science, CAAS, Beijing 100094, China)
Abstract: T he excised leaf tissue inoculat ion ( ELT I) method is studied in this paper for ident if icat ion of
alfalfa resistance to common leaf spot . The results show ed that ELTI is mor e eff icient and dependable in
resistance ident ification than the t radit ional w hole plant inoculat ion method. Greenness of ex cised leaf
t issues w as the best maintained by adding benzim idazole into media of 0. 3% water agar at 50Lm/ mL. T he
condit ions requir ed for a good inoculat ion o f ex cised leaf t issue includes relative humidity about 100% ,
temperature of 20℃, durat ion of 20 hours, and complete dark. The condit ion required for g ood cultur e are
a 12 hour s interval alternation of light ( 9000lux ) with temper ature at 22℃ and dark w ith temperature at
18℃.
Key words : Alfal fa common leaf spot ; Excised leaf t issue; Inoculat ion
　　褐斑病是我国苜蓿的重要病害,严重影响苜蓿
的产草量和品质[ 1, 2]。鉴定和评价苜蓿对褐斑病的抗
病性, 是培育和利用抗病品种防治苜蓿褐斑病的基
础。抗病性鉴定中最难解决的一个问题是如何提高
大批量筛选的效率。以往采用的碎菌丝体或孢子喷
洒全株、茎尖接种以及田间自然传染等都不能令人
满意。利用离体叶片接种技术进行抗病性鉴定[ 3] ,具
有与其它整株接种等方法无法比喻的优越性,在时
间、规模及效率上均突破了以往筛选方法的局限性,
为抗性种质资源的批量筛选提供了有效方法。该方
法已成功地用于寄主抗病性和感病性的快速诊
断[ 3, 4] ,以及致病力测定和杀菌剂效果的评定 [ 5]。然
而,该技术在苜蓿褐斑病研究中的应用尚未见报导。
本文旨在研究离体叶片的接种效果、技术、方法以及
保绿剂浓度和光照时间, 以便找到一套最佳的离体
叶片接种鉴定方法,用于苜蓿褐斑病的抗病性鉴定
及评价,并与整株接种方法进行比较。
1　材料和方法
1. 1　供试材料
1 . 1. 1　供试苜蓿材料　加拿大引进的普罗亥
　　收稿日期: 2000-06-29; 修回日期: 2000-09-21
　　基金项目:国家自然科学基金(编号: 39870559)资助项目
　　作者简介:袁庆华,女, 1959年生,副教授, 1982年毕业于甘肃农业大学草原系,已发表论文 32篇,主要从事草地保护及品种资源研究
第 9卷　第 1期
　Vol. 9　　No. 1
草　地　学　报
ACTA AGREST IA SINICA
　2001 年　3 月
March 　2001
(M edicago sat iva L. cv. Pr ohi)、美国引进的伊鲁瑰斯
(M edicaga sativa L. cv. Iv oguois)以及国内的沙河苜
蓿 ( Medicago sativa L. cv . Shahe )、克 山苜蓿
( M edicago sativa L. cv. Keshan ) 及 宝鸡苜蓿
(M edicago sativa L. cv . Baoji) 5个品种, 种子均由本
所提供。
1. 1. 2　供试苜蓿假盘菌( P seudop ez iz a medicaginis)
菌种是从本所苜蓿实验田的病叶, 通过在 V-8 琼脂
培养基分离培养而获得。
1. 2　幼苗培育
供试材料的种子经过 0. 1%升汞表面消毒处理
后,放入水琼脂培养基上萌发 2d, 再将萌发的幼苗
移栽到装有草碳和蛭石(比例为 2∶1)的塑料盆(盆
口直径 5cm ,高 7cm ) ,同时接种根瘤菌。每个品种共
200株,每盆一株,在温室培育, 40d后进行离体叶及
整株接种。
1. 3　离体叶接种及鉴定
1. 3. 1　使用苯骈咪唑做保绿剂,接种前分别将保绿
剂配成 25Lm/ mL、50Lm/ mL、75Lm/ mL 和 100Lm/
mL 水溶液, 然后加入一定量的琼脂,制成 0. 3%水
琼脂培养基, 倒入 90cm 的培养皿。每品种选 150
株,每株自下而上取 3张叶片(取每个复叶的中间小
叶) ,每个培养皿放 10片叶,每片叶均来自同一品种
不同植株的同一位置。叶片经 0. 5%吐温 20( T w een
20)处理后接种。具体方法有:
1. 3. 1. 1　孢子弹射法　接种时培养皿盖内只放入
一个成熟的菌落(菌落直径约 3mm) ,倒扣在接种叶
片的正上方,接种物与被接种物相距 10cm ,放入培
养箱, 接种时相对湿度 100%, 温度 20℃, 接种时间
20h。接种期间每 5h 移动一次菌落,以达到均匀一
致。接种后移出菌落,将原培养皿的盖子盖上接种后
的培养基。
1. 3. 1. 2　孢子悬浮液接种法　将子囊孢子稀释成
1. 9×105～1. 0×106子囊孢子/ mL 的悬浮液,然后
将离体叶完全浸入悬浮液, 5秒钟后取出。
1. 3. 2　接种后的叶片叶面朝上放在配好的培养基
上,置入生长箱培养。
1. 3. 2. 1　进行苯骈咪唑保绿剂浓度实验, 只设一个
光照处理,即每日光、暗时间各为 12h 交替变化,光
照强度 9000Lux ,有光时 22℃,无光时 18℃。通过上
述实验选定最佳保绿剂。
1. 3. 2. 2　再设 5个光照处理实验,即每日光照时间
分别为0、4、8、12、16h,温度同上。培养 10d后,记载
离体叶片病情及变色情况。
1. 3. 3　病情分级标准为: 0 级: 无病斑, 为免疫
(Ⅰ) ; 1级:有 1～3个病斑,为高抗( HR) ; 2级: 有 4
～6个病斑, 为中抗( MR) ; 3 级: 有 7～10个病斑,
为中感( M S) ; 4级:有11个以上病斑( HS) ,为高感。
1. 3. 4　叶片变色划分标准: 1 级为绿色; 2 级为微
黄; 3级为黄。
1. 4　活体整株接种及鉴定
每品种各取 30 株, 距离接种苜蓿苗 60cm 高,
用接种物倒扣其上,放入生长箱,接种温度 20℃, 相
对湿度接近 100% , 24h 后保湿 48h, 再放入温室。
10d后观测记载病情。
2　结果与分析
2. 1　苯骈咪唑浓度的影响
　　在离体叶接种采取的两种方法中, 只有孢子弹
射法获得成功, 而孢子悬浮液接种法,直到叶片变黄
仍未出现感病症状。孢子弹射接种法的结果表明:
2. 1. 1　5个苜蓿品种在不加保绿剂时叶片完全变
成黄色, 加 25Lm/ mL 苯骈咪唑后, 叶片大多数呈微
黄,而在 50Lm/ mL 及其以上浓度时,叶片几乎全部
保绿(表 1)。
2. 1. 2　从病情来看,不加保绿剂时,叶片变黄,组织
坏死,苜蓿假盘菌无法在叶片上存活。当苯骈咪唑浓
度为 25Lm/ mL 时, 除宝鸡苜蓿外, 其它 4个品种均
出现不同程度的病情,当浓度为 50Lm/ mL 时,病情
较为稳定,而在该浓度以上病情则不太稳定。因此以
离体叶接种鉴定,最佳保绿剂浓度为 50Lm/ mL, 即
能达到良好的接种效果, 又使叶片保持绿色。
2. 2　不同光照时间的影响
2. 2. 1　选择结果, 以保绿剂最好, 即 50Lm/ mL 苯
骈咪唑。接种后 10d,没有光照的叶片均变成黄色,每
天光照时间低于 12h, 叶片变为微黄状态, 每天12h及
其以上者叶片基本保持绿色(宝鸡苜蓿除外)。
2. 2. 2　光照时间对病情也有明显影响(表 2)。无光
照时,与不加保绿剂的情况相似, 叶片失绿、逐渐变
22 草　地　学　报 第 9卷
黄腐烂、病菌不能在叶片上生存。光照时间达 4h/ d
以上时,叶片上出现明显的病斑, 8h 以上时, 病情进
一步稳定,症状更加明显。
表 1　苯骈咪唑浓度对离体叶病情和保绿的影响*
Table 1　Effect of medium Benzim ida zo le concentr ation on disease
rat ing and gr eenness of ex cised leaves in alfalfa
苜蓿品种
Alfalfa variety
苯骈咪唑浓度( Lm/ mL)
Benzimidazole concent ration ( Lm/ mL)
0 25 50 75 100
病级
Disease
rat ing
叶色
L eaf
color
病级
Diseas e
ratin g
叶色
Leaf
color
病级
Disease
r at ing
叶色
Leaf
color
病级
Disease
rat ing
叶色
Leaf
color
病级
Diseas e
rat ing
叶色
Leaf
color
普罗亥苜蓿
Med icag o sat iv a L. cv. Prohi
-
黄
Yel low
2
微黄
Light green
2
绿
Green
1～3 绿
Gr een
1～2 绿
Green
伊鲁瑰斯苜蓿
Med icag o sati v a L . cv.
Iroquois
-
黄
Yel low
2～3 微黄
Light green
3
绿
Green
2～3 绿
Gr een
1～3 绿
沙河苜蓿
Med icag o sat iv a L. cv. Sh ah e
-
黄
Yel low
3～4 微黄
Light green
3～4 绿
Green
2～3 绿
Gr een
2～4 绿
Green克山苜蓿
Med icag o sati v a L . cv.
Keshan
-
黄
Yel low
4
微黄
Light green
4
绿
Green
4
绿
Gr een
2～4 绿
Green
宝鸡苜蓿
Med icag o sat iv a L. cv. Baoj i
-
黄
Yel low
-
黄
Yellow
4
微黄
Light green
3～4 微黄
Ligh t green
2～4 绿
Green
　　* 光、暗时间各 12h交替变化,光强为 9000lux。T he interval altern at ion of ligh t and dark is 12 hours . Lig ht density is 9000lux .
表 2　光照时间对离体叶病情和保绿的影响*
T able 2　Effect o f pho toper iod on disease rat ing and gr eenness of ex cised leaves a lfalfa var iet ies
　苜蓿品种
Alfalfa variety
光照时间( h)
Ph otoperiod( hour)
0 25 50 75 100
病级
Disease
rat ing
叶色
L eaf
color
病级
Diseas e
ratin g
叶色
Leaf
color
病级
Disease
r at ing
叶色
Leaf
color
病级
Disease
rat ing
叶色
Leaf
color
病级
Diseas e
rat ing
叶色
Leaf
color
普罗亥苜蓿
Med icag o sat iv a L. cv. Prohi
-
黄
Yel low
-
黄
Yellow
1～2 微黄
Light green
2
绿
Gr een
2
绿
Green
伊鲁瑰斯苜蓿
Med icag o sati v a L . cv.
Iroquois
-
黄
Yel low
2～3 微黄
Light green
3
微黄
Light green
3
绿
Gr een
3
绿
Green
沙河苜蓿
Med icag o sat iv a L. cv. Sh ah e
-
黄
Yel low
-
黄
Yellow
2～3 微黄
Light green
3～4 绿
Gr een
3～4 绿
Green克山苜蓿
Med icag o sati v a L . cv.
Keshan
-
黄
Yel low
-
黄
Yellow
3～4 微黄
Light green
4
绿
Gr een
4
绿
Green
宝鸡苜蓿
Med icag o sat iv a L. cv. Baoj i
-
黄
Yel low
3～4 微黄
Light green
4
微黄
Light green
4
微黄
Ligh t green
4
绿
Green
　　* 保绿剂浓度均为 50 Lm/ mL。T he green nes s concent rat ion is 50 Lm/ mL
2. 3　离体叶与活体整株鉴定比较
为了验证离体叶片接种鉴定方法的可靠性,对
供试材料分别采用离体叶接种和活体整株接种两种
鉴定方法,并对结果进行比较(表 3)。
2. 3. 1　离体叶接种后,病情比活体整株接种严重,
其中普罗亥、伊鲁瑰斯及沙河 3个苜蓿品种,离体叶
接种后, 病情等级比活体整株接种者高一级, 在克
山、宝鸡两个苜蓿品种,两个接种方法引起的病情等
级相同。说明用离体叶片接种鉴定苜蓿品种的抗病
性是可靠的,在某种程度上比田间及活体整株接种
鉴定法可靠性要强, 不致于造成误选。在田间或室内
整株接种时,由于发病条件和接种均匀度的限制, 一
些本来敏感的品种由于发病症状不明显而有可能被
23第 1期 袁庆华等:苜蓿褐斑病的离体叶接种研究
误认为是抗病材料。
2. 3. 2　活体整株接种的植株不能反复多次、大批量
筛选,因而限制了筛选效率。而离体叶接种可以克服
上述缺点。
表 3　接种方法对病级和抗病性评价的影响*
T able 3　Effect of ino culation methods on disease r ating and resistance
品种
Variety
离体叶片接种
Excised leaf t iss ue inoculation
病情
Diseas e ratin g
抗病性评价
Resistance rat ing
活体整株接种
Whole plant in oculat ion
病级
Diseas e ratin g
抗病性评价
Resistance rat ing
普罗亥苜蓿
Med icag o sati va L. cv. Prohi
2 MR 0～1 HR
伊鲁瑰斯苜蓿
Med icag o sati va L. cv. Iroquois
3 MS 2 MR
沙河苜蓿
Med icag o sati va L. cv. S hahe
3～4 HS 3 MS
克山苜蓿
Med icag o sati va L. cv.Keshan
4 HS 3～4 HS
宝鸡苜蓿
Med icag o sati va L. cv.Baoji
4 HS 3～4 HS
　　注: HR为高抗, MR 为中抗, MS为中感, HS 为高感
　　Note: HR indicates high resis tance, MR in dicates meclium r esi stance. M S indicates medium su scept ibilit y, HS indcates high su scept ibilit y.
3　讨论
3. 1　用离体叶组织接种的方法鉴定抗病性,具有活
体整株鉴定法无法比拟的优点, 并已在苜蓿菌核
病[ 3]及瓜类白粉病[ 4]等病害研究中得到证实。本研
究在苜蓿褐斑病鉴定中也得出相似的结论, 只不过
所用的是孢子弹射法。据此并结合以往的研究成果
可以证明,用离体叶组织接种以鉴定苜蓿对褐斑病
的抗性,其方法可行,结果可靠。不过,该方法受接种
时间长短、接种湿度、接种物与被接种物距离远近的
影响较大。如接种时间过短,子囊孢子弹射量不够,
时间过长则接种量过大,难以得到真实可靠的结果。
3. 2　本文总结出的最好接种方法为:用生长 40d左
右的苜蓿幼苗叶片, 经过 0. 5%T ween20处理后,叶
面朝上放在加有 50Lm/ mL 苯骈咪唑的 0. 3%水琼
脂培养基, 接种物距离 10cm 左右倒扣其上, 放入相
对湿度接近 100%、无光照、20℃的生长箱, 接种
20h。接种后取出接种物, 被接种物置于生长箱培
养,光照和黑暗每 12h 交替一次,有光时 22℃, 无光
时 18℃, 光照强度 9000lux , 经过 10d 即可调查病
情。离体叶接种后培养时, 光照时间不宜太长, 如果
每天超过 12h, 则培养基容易干燥,影响结果, 而且
浪费电能。为了验证接种效果,可在鉴定材料中加入
抗病性及感病性品种做对照, 以提高离体叶组织鉴
定结果的准确性。
3. 3　离体叶接种是在最有利于病原菌感染的条件
下进行的, 所以发病情况比田间或室内整株接种严
重。在田间或室内整株接种时,由于发病条件和接种
均匀度的限制, 一些本来感病的植株由于发病症状
不明显而有可能被误认为是抗病植株, 而利用离体
叶接种可选出真正抗病的植株,极大地减少误选的
可能性。
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24 草　地　学　报 第 9卷