全 文 ：武汉植物学研究 2000, 18( 6) : 531～535
Journal of Wuhan Botanical Research
优化培养基增加层理鞭枝藻藻胆蛋白产量
李 月 邓迎峰 周 明 赵开弘
(华中科技大学环境科学与工程学院 武汉 430074)
INCREASING PHYCOBILIPROTEIN PRODUCTION
IN MASTIGOCLADUS LAMINOSUS WITH
THE IMPROVED CULTURE
Li Yue Deng Yingfeng Zhou M ing Zhao Kaihong
( Dep artment of Env ir onmental Sc ience and E ng inee ring , H uaz hong
Unive rsity of S cienc e and T echnology Wuhan 430074)
关键词 层理鞭枝藻, 藻红蓝蛋白,藻蓝蛋白, 别藻蓝蛋白
Key words Mas tigocladus laminosus , Phycoer ythr ocyanin ( PEC ) , Phycocyanin ( PC ) ,
A llophycocyanin( APC)
中图分类号: Q935 文献标识码: A 文章编号: 1000-470X ( 2000) 06-0531-05
藻胆蛋白( phycobilipr ot ein)是蓝藻和红藻藻胆体的组成部分, 是光合作用集光复合体的组成部分,
一般由 和 亚基构成,每个亚基含 1～4 个辅基色素,从而使藻胆蛋白具有特定的光谱吸收性质。根据
这些吸收光谱性质,可以将藻胆蛋白分为: 别藻蓝蛋白( APC)、藻蓝蛋白( PC)和藻红蛋白( PE)等, 在某
些缺乏 PE 而有异形胞的蓝藻中存在充当 PE 天线捕光功能的藻红蓝蛋白( PEC) 〔1〕。藻胆蛋白可用于天
然食用色素、化妆品色素和制药行业, 还可作为免疫检测、荧光显微技术和流式细胞荧光测定法技术方
面的荧光探针。特别是本工作研究的层理鞭枝藻(简称 M . laminosus)含有 PEC,从中提取的 PEC 亚基
具有高效可逆光致变色性质, 具有重要的应用开发前景。提高藻胆蛋白的含量及藻的生长速率不仅可获
得高价值的蛋白资源, 还可以提高蛋白质分离纯化的效率。藻胆蛋白的含量与藻培养时的营养条件、光
强、CO 2 水平、温度等因素有关。如 Bruns 等〔2〕采用电脉冲诱变获得 Fremyella dip losip hon 的 3 种突变
株, 在红光、绿光选择压力下获得较多某种的藻胆蛋白。Chen 等〔3〕发现在光强为 4 000 lx ,葡萄糖浓度为
2. 5 g / L时, 藻蓝蛋白含量最大。笔者研究了不同浓度的镁、铁、氮等对层理鞭枝藻藻胆蛋白含量的影响,
同时也尝试用葡萄糖、蔗糖代替原培养基中的土壤浸出液并检测其影响。
1 材料与方法
1. 1 藻种和培养条件
层理鞭枝藻藻种购自中国科学院水生生物研究所。采用如下培养基培养: 每升中含 NaNO 3 250 mg、
通讯联系人。
收稿日: 1999-07-26,修回日: 1999-11-16。第一作者:女, 1974年 11月生,武汉大学硕士研究生,从事光生物化
学研究。
国家自然科学基金( No. 39580002)和武汉市晨光计划资助项目(No. 965001037-21)。
CaCl2 25 mg、MgSO 4 37. 5 mg、K 2HPO 4·3H2O 75 mg、KH2PO4 175 mg、NaCl 25 mg , 土壤浸出液 10 mL、
EDTA-FeCl3 1 mL、A5 1 mL、1% FeCl3 0. 05 mL。EDTA-FeCl3 组成为 FeCl3 1. 11 mmo l/ L、EDTA
0. 5 mmo l/ L。对照实验即按此培养基培养层理鞭枝藻, 优化培养基时则改变相应组分的浓度。镁浓度通
过改变 MgSO 4浓度, 铁通过改变 EDTA-FeCl3 的浓度,氮通过改变 NaNO 3的浓度实现。
还进行了用葡萄糖或蔗糖代替土壤浸出液的实验。藻培养的其它条件: pH 8. 0、光照强度 1 000 lx、
温度 37℃、搅拌、通空气。
1. 2 藻胆蛋白含量的测定
收集培养 5周的藻, 用双蒸水洗 2 次, 5 500×g 离心 10 min, 称藻重。取 0. 2～0. 3 g (干重)藻,用
5 mL无水甲醇抽提 2 次, 除去叶绿素〔4〕, 双蒸水洗 3 次。每克藻加 0. 5 mL 20 mmo l/ L 磷酸钾缓冲液
( pH8. 0) ,反复冻融几次, 然后用超声波细胞粉碎机 JY92-Ⅱ(宁波新芝科仪研究所 )破碎细胞 , 7 000×g
离心 20 min,取上清并测其体积。上清液适当稀释后, 避光下用 723 型可见分光光度计(上海第三分析仪
器厂)测 330～800 nm 的光谱图,然后根据下列公式计算藻胆蛋白的含量〔5〕。
PEC( mol/ L ) = 14. 5×10- 7A575- 9. 09×10- 7A 618,
PC( mol/ L ) = 14. 4×10- 7A 618- 6. 02×10- 7A 652- 3. 47×10- 7A 575,
APC( m ol/ L ) = 0. 640×10- 7A 575+ 12. 2×10- 7A 652- 2. 65×10- 7A 618。
1. 3 藻干重的测定
藻的平均生长速率为藻的总重量(干重)除以藻的生长天数。测藻的干重时将藻在 105℃烘 3～4 h,
30 min 后, 冷至常温,称重,重复进行至恒重。
2 结果与讨论
2. 1 氮源对藻胆蛋白含量的影响
培养基中 NaNO 3 的浓度从 2. 9 mmo l/ L 变化到 58. 8 mmo l/ L , 对照实验中 NaNO 3 浓度为
2. 9 mmo l/ L (见图 1)。实验表明, NO 3 浓度为 11. 8 mmol/ L 时 , PEC、PC、APC 的产量最大,每克干藻中
( 以下都为干重 ) PEC、PC、APC 的含量分别为 74. 7、100. 9、31. 9 m g, 比对照增加了 498%、616%、
423% 。按藻胆蛋白占藻干重的 10%计算〔6〕, 三者的比例为 3. 6%、4. 9%、1. 5% , 对照为 3. 8%、4. 3%、
1. 9% ,差别不大, 而生长速率则大大提高了。当氮浓度为 8. 8 mmo l/ L 时藻胆蛋白产量也较高 ,但从蛋
白质产量和生长速率综合来考虑的话, 氮浓度为 11. 8 mmo l/ L 仍然是最佳的。
在测定 NaCl浓度的影响时, 发现当 NaCl的浓度为 0. 9 mmol/ L 时, PEC、APC 的含量均达到最大
值, 比对照 0. 4 mmol/ L 分别增加 5%、1% ; PC 的相对含量增加 5% , PEC、APC 的相对含量减少。当
NaCl的浓度为 2. 2 mmol/ L 时, PC 含量达到最高, 比对照增加了 88% , 相对含量增加 2% ;当NaCl的浓
度再增大至 50 倍时,藻胆蛋白的含量几无变化, 与对照相比,对照改变的量均小于 34%。在图 1 中, 3种
藻胆蛋白的含量均达到最大时, N aNO3 的浓度为 11. 8 mmol/ L , 是原培养基中 NaNO 3 浓度的 4 倍,
N aCl浓度的 27 倍。此时 Na +对藻胆蛋白产量的影响趋于稳定且影响不大,由此可见, 图1 中藻胆蛋白产
量的变化主要是由 NO 3 引起, N a+ 的影响可忽略。
2. 2 镁离子浓度对藻胆蛋白含量的影响
培养基中 M g2+ 的浓度从 0. 3变化到 6. 8 mmo l/ L ,而对照中 Mg 2+ 浓度为 0. 3 mmo l/ L。从图 2可以
看出, 当镁离子浓度为 3. 6 mmo l/ L 时, PEC、PC、APC 的含量得到较大提高,每克干藻中 PEC、PC、APC
的含量分别为 50. 2、106. 0、11. 9 mg , 比对照分别增加了 302%、652%、95%。PEC、PC、APC 分别占
3. 0% 、6. 3%、0. 7% , 与对照 3. 8%、4. 3%、1. 9%相比, PC 的含量有所提高, 而生长速率则差别不大。
PEC、PC、APC 的含量都增加,所以一定浓度的镁离子可以引起藻胆蛋白的累积。
当我们改变Na2SO 4的浓度时,随着SO 2-4 的浓度增加至6. 8 mmo l/ L (对照为0. 3 mmo l/ L ) , 藻胆蛋白
的含量反而降低。由2. 1可知,此时( Na+ 浓度为13. 6 mmo l/ L ) Na+ 浓度对藻胆蛋白含量的影响不大,说
明原培养基中的 SO 2-4 浓度是适合的,也进一步证明藻胆蛋白的含量变化是由 Mg2+ 浓度变化引起的。
532 武汉 植 物学 研究 第 18卷
图 1 层理鞭枝藻在不同硝酸根浓度
下的藻胆蛋白含量
Fig. 1 Ph ycobilip rotein conten t of M . laminosus
at diff erent NO 3 concen trat ions
图 2 层理鞭枝藻在不同镁离子浓度
下的藻胆蛋白含量
Fig. 2 Phycobil iprotein content of M . laminosu s
at d iff erent Mg2+ con cent rat ions
2. 3 钾离子浓度对藻胆蛋白含量的影响
当 K + 浓度为对照的 5 倍时, PEC、PC、APC 的含量达到最大, 每克干藻中 PEC、PC、APC 含量分别
为 21. 1、38. 5、24. 9 mg (见图 3) , 分别比对照增加了 69%、173%、308% , 相对含量为 2. 5%、4. 6%、
2. 9% ,与对照 3. 8%、4. 3%、1. 9%相比, PC、APC 比例增加。但当K + 浓度继续增大(达到 26倍)时,藻胆
蛋白的含量反而下降, 当浓度增大到 55倍时藻已死亡。藻胆蛋白的量达到最大时(即当 K + 浓度为对照
的 5 倍时) , Cl- 浓度是原培养基中 NaCl的 25倍。由 2. 1的分析可知, 此时 NaCl浓度影响不大,所以对
藻胆蛋白含量的影响主要是由 K + 浓度的变化引起的。
2. 4 铁离子浓度对藻胆蛋白含量的影响
铁离子浓度为 5. 5 和 6. 6 mmol/ L 时都可得到较高产量的藻胆蛋白(见图 4)。前者每克藻含 PEC、
PC、APC 分别为 32. 2、58. 0、14. 8 mg, 比对照增加了 158%、311%、143% , 它们的比例为 3. 0%、5. 6%、
1. 4% , 对照为 3. 8%、4. 3%、1. 9% , PC 的比例有所提高。
图 3 层理鞭枝藻在不同钾离子浓度
下的藻胆蛋白含量
Fig. 3 Ph ycobilip rotein conten t of M . laminosus
at d iff er ent K+ con cen tr at ions
图 4 层理鞭枝藻在不同铁离子浓度
下的藻胆蛋白含量
Fig. 4 Phycobil iprotein content of M . laminosu s
at dif f erent Fe3+ concent rat ion s
2. 5 葡萄糖浓度对藻胆蛋白含量的影响
葡萄糖的浓度从 0 变化到 2. 0 mmo l/ L ,当浓度为 0. 7 mmo l/ L 时, PEC、PC、APC 的含量得到较大
提高(见图 5) ,每克干藻中 PEC、PC、APC 含量分别为 75. 8、70. 7、20. 9 mg ,比不加葡萄糖的藻分别增加
533 第 6期 李 月等:优化培养基增加层理鞭枝藻藻胆蛋白产量
了 103%、66%、14%。这说明葡萄糖在低光强度下能刺激藻的生长〔6〕, 合成大量的藻胆蛋白。此时PEC、
PC、APC 占藻干重的 4. 5%、4. 2%、1. 3% ,对照为 3. 8%、4. 4%、1. 8% , PEC 含量增加, 成为含量最多的
藻胆蛋白。生长量少的藻所含的藻胆蛋白含量反而高。这是因为一方面较高浓度的碳源有利于藻的生
长, 另一方面每个细胞可以获得更多的光能而合成更多的捕光蛋白。
2. 6 蔗糖浓度对藻胆蛋白含量的影响
在图 6 中, 第 1 号样品为对照 (含土壤浸出液, 蔗糖浓度为 0) , 2 号中含最适的葡萄糖浓度
0. 7 mmo l/ L。蔗糖的作用与葡萄糖类似,可以提高藻胆蛋白的产量,但在适合的浓度范围内, 藻胆蛋白
的量差别不明显(见图 5)。此时蔗糖浓度最大的 6 号中明显已有细菌生长,不利于实际运用。虽然加葡
萄糖效果更明显, 但蔗糖比葡萄糖更经济,所以在实际生产中可以采用低浓度的蔗糖培养基(如 3 号或 4
号)。
图 5 层理鞭枝藻在不同葡萄糖浓度
下的藻胆蛋白含量
Fig. 5 Ph ycobilip rotein conten t of M . laminosus
at d iff erent glucose con cen tr at ions
图 6 层理鞭枝藻在不同蔗糖浓度下的藻胆蛋白含量
Fig. 6 Phycobil iprotein content of M . laminosu s
at d iff erent sucrose con cent rat ions
2. 7 不同浓度的 5 种元素对藻胆蛋白含量的影响
6 瓶培养基中( 1～6) 5 种元素的浓度见表 1( 1 号为对照)。
表 1 6种培养基中的各离子浓度
T able 1 Differ ent ion concentrat ions in the six cultur es
编号
No.
离子浓度 Ion concen trat ions ( mmol / L)
M g2+ Kg+ Fe3+ NO 3 Sucros e
1 0. 3 2. 2 1. 1 2. 9 0
2 0. 9 3. 3 2. 2 4. 0 0. 02
3 2. 1 4. 4 3. 3 5. 0 0. 05
4 3. 6 6. 6 4. 4 5. 8 0. 10
5 5. 2 10. 7 5. 5 8. 7 0. 20
6 6. 8 21. 4 6. 6 11. 6 0. 30
从图 7 可见, 4 号培养基中的藻
胆蛋白 含量最大, 分别为 111. 6、
163. 5、36. 1 mg / g , 分别是对照的 9
倍、11. 5 倍、5. 9 倍; 相对 含 量 为
3. 6% 、5. 2%、1. 2% , 与对照 3. 8%、
4. 3% 、1. 9%相比, PC 增加较多,平均
生长速率也增加了, 所以 4 号培养基
中的各离子浓度是较适合的。
2. 8 5 种元素对层理鞭枝藻生长速
率的影响
从图 8 中可以看出, 镁、铁、钾的
浓度对藻的生长速率影响不大。在低浓度下葡萄糖可以刺激藻的生长, 浓度为 0. 7 mmo l/ L 时生长速率
最大(图中未显示) 。当蔗糖的浓度为葡萄糖最适浓度的一半时(即两者含碳的摩尔数相等) , 藻的生长
速率最大。丰富的氮源可以提高藻的生长速率, 从单位重量的藻胆蛋白含量及生长速率综合来考虑,
NO3 浓度为 11. 8 mmo l/ L 时可以大大提高藻胆蛋白的产量。
534 武汉 植 物学 研究 第 18卷
横坐标中 1～6分别表示表 1中相应的 6种培养基 1～6 on the absciss a repres ent the six cultures of t ab le 1.
图 7 层理鞭枝藻在 6 种不同浓度离子培养基中
的藻胆蛋白含量
Fig. 7 Ph ycobilip rotein conten t of M . laminosus
at six dif feren t ion concent rat ions
横坐标中 1～6分别表示文中 2. 1～2. 7改变Mg2+ 、K+ 、
NO 3、Fe3+、蔗糖浓度及 5种元素浓度的实验
1 ～ 6 on the abscis sa repr esent the experiments of
chan ging Mg 2+ , K+ , NO 3 , Fe3+ , s ucros e concent rations
and th e f ive subs tances concent rat ions in 2. 1～2. 7
图 8 6种培养基中层理鞭枝藻的平均生长速率
Fig. 8 The aver age gr ow th rate of M . Laminosus
in s ix diff erent cul ture
2. 9 其它元素对藻胆蛋白产量的影响
对照中 A5的浓度为 250 L / L ,当浓度从 250 L / L 增至 8 250 L/ L 时, 藻胆蛋白的含量降低,对
照中藻胆蛋白的含量是最高的。所以原培养基中 A5的浓度是适合的。
本实验也测定了培养基中 CaCl2的浓度对藻胆蛋白产量的影响,藻胆蛋白产量没有发现明显变化。
参 考 文 献
1 曹茂林.藻胆蛋白.植物生理学通讯, 1990( 5) : 72～78
2 Bruns B U, Briggs W R, Gros sman A R. Molecular characterizat ion of ph ycobilis ome reg ulatory mutants of
Fr emyel la dip losip hon. J B act, 1989, 171( 2) : 901～908
3 ChenF, Zh ang Y M , Guo S Y. Gr ow th an d ph ycocyanin for mat ion of Sp ir ulina p latensis in photoheterotroph ic
cul ture. B iotech L et , 1996, 18( 5) : 603～608
4 Benn et t A, Bogorad L .C om plementary chromat ic adaptat ion in a f il amentous blue-green alga. J Cel l B io, 1973, 58:
419～435
5 Sieg fried S iebz ehn rueb l. Chromph orzuordnun g und revesib le Photochemie von C-Phycocyaninen und
Ph ycoer yth rocyaninen . Muenchen: Universitaet Muench en, 1990.
6 黄有馨,刘志礼.固氮蓝藻.北京:农业出版社, 1984. 121～124
535 第 6期 李 月等:优化培养基增加层理鞭枝藻藻胆蛋白产量