全 文 ：武汉植物学研究 2002, 20 (1) : 38～ 42
J ourna l of W uhan B otan ica l Resea rch
藻红蓝蛋白 Α2亚基脱辅基蛋白与藻蓝胆素的重组Ξ
王　鲁1　周　明2 ΞΞ　邓明刚1　赵开弘1　STO R F M ax3　SCH EER H ugo 3
(1. 武汉大学生命科学学院, 武汉　430072; 2. 华中科技大学环境科学与工程学院, 武汉　430074;
3. B otan ic Institu te, U niversity M un ich , M enzinger Str. 67, D 280638 M uenchen, Germ any)
摘　要: 利用在大肠杆菌中表达的藻红蓝蛋白 Α2亚基脱辅基蛋白与藻蓝胆素 PCB 重组, 吸收光谱、荧光光谱和高
效可逆光化学性质分析表明, 藻红蓝蛋白 Α2亚基脱辅基蛋白与藻蓝胆素直接重组, 生成的胆素蛋白中辅基色素仍
为藻蓝胆素; 而藻红蓝蛋白 Α2亚基脱辅基蛋白与藻蓝胆素在藻红蓝蛋白 Α2亚基重组酶 (pecE 和pecF 基因的表达产
物)催化下重组, 生成的胆素蛋白中辅基色素转变为藻紫胆素, 并具有高效可逆光化学特性。
关键词: 藻红蓝蛋白 Α2亚基; 重组; 高效可逆光化学特性
　　中图分类号: Q 586　　　　　文献标识码: A 　　　　　文章编号: 10002470X (2002) 0120038205
Recon stitution of Phycocyanobil in w ith the Overexpreesed
Apo-Α-phycoerythrocyan in
W AN G L u1, ZHOU M ing23 3 , D EN G M ing2Gang1, ZHAO Kai2Hong1, STOR F M ax3, SCH EER H ugo 3
(1. Colleg e of L if e S ciences, W uhan U niversity , W uhan　430072, Ch ina;
2. Colleg e of E nv ironm en ta l S cience and E ng ineering , H uaz hong U n iversity of S cience and T echnology , W uhan　430074, Ch ina;
3. B otan ic Institu te, U niversity M un ich , M enzinger Str. 67, D 280638 M uenchen, Germ any)
Abstract: U sing the exp ressed and renatu red apo2Α2phycoeryth rocyan in to be recon st itu ted w ith
phycocyanob ilin , the p ro sthet ic group in the recon st itued phycob ilip ro tein s w ere analyzed w ith
ab so rp t ion spectra. W hen apo2Α2phycoeryth rocyan in w as recon st itu ted w ith phycocyanob ilin
d irect ly, the p ro sthet ic group in the p roduced phycob ilip ro tein is st ill phycocyanob ilin. How ever,
w hen apo2Α2phycoeryth rocyan in w as recon st itu ted w ith phycocyanob ilin under cata lysis of Α2
phycoeryth rocyan in lyase, the p ro sthet ic group in the p roduced phycob ilip ro tein is
phycovio lob ilin , w h ich po ssessed the h igh ly reversib le pho tochem istry p roperty.
Key words: Α2phycoeryth rocyan in; R econ st itu t ion; H igh ly reversib le pho tochem istry
　　藻胆蛋白 (phycob ilip ro tein s) 存在于蓝藻、红藻
和隐藻中, 是组成光合作用捕光复合物的功能色素
蛋白。藻胆色素 (phycob ilin s, 线性四吡咯)通过硫醚
键与藻胆蛋白Cys 残基共价结合, 其种类以及与脱
辅基蛋白的相互作用决定藻胆蛋白特异的光谱性
质。根据光谱性质及在光合作用能量传递中的作用,
可将藻胆蛋白分为 3 类: 别藻蓝蛋白 (简称A PC)、
藻蓝蛋白 (PC)、藻红蛋白 (PE) , 在某些缺乏 PE 而
具有异形胞的蓝藻中存在与 PE 功能类似的藻红蓝
蛋白 (PEC) [1 ]。层理鞭枝藻中的藻红蓝蛋白 (PEC)
由 Α2亚基 (简称 Α2PEC ) 和 Β2亚基 (简称 Β2PEC ) 组
成, Α2PEC 的辅基色素为藻紫胆素 (简称 PVB ) ; Β2
PEC 的辅基色素与 PC 和A PC 的辅基色素相同, 都
是藻蓝胆素 (简称 PCB )。PVB 与 PCB 在结构上存ΞΞΞ 通讯联系人, 现工作单位为华中科技大学环境科学与工程学院。收稿日期: 2001205218, 修回日期: 2001210229。基金项目: 国家自然科学基金 (编号: 39770175)和武汉市晨光计划 (编号: 965001037221)资助项目。　　　作者简介: 王鲁 (1976- ) , 男, 博士研究生, 从事植物生殖学研究。
在双键位置异构, 天然条件下不能相互转变。藻红蓝
蛋白基因操纵子含顺序连锁的B、A、C、E、F 5 个基
因, 其 中 pecA 编 码 Α2PEC 亚 基 脱 辅 基 蛋 白
(PECA ) , pecE 与 pecF 编码的蛋白可能是脱辅基蛋
白与辅基色素共价连接反应所需的重组酶 (PECE
和 PECF, 简称 PECEF) [2 ]。分离提纯的 Α2PEC 具有
高效可逆光致变色性质, 为了利用该高效可逆光致
变色性质开发高效可逆光致变色蛋白质材料, 我们
正在人工诱变 Α2PEC [3 ]以改良其光学性质。本工作
报道其部分结果。
根据 Glazer [1 ]、B ryan t 及 Zhao 近年的工作[3 ] ,
试图用各种复杂的生物物理方法 (比如核磁共振
NM R、IR 等) 来确定藻胆色素的种类其实并不理
想, 因为这些分析方法需高纯度的色素短肽; 但辅基
色素 (尤其是本文中的 PCB、PVB 色素肽) 在多步提
纯过程中极易发生化学反应, 特别是异构化、氧化。
Zhao 的工作[3 ]指出: Α2PEC 具备高效可逆光致变色
特性, 其原理是, Α2PEC 中 PVB 在光能激发下第 15
位双键发生可逆的顺反异构, 从而使 Α2PEC 的最大
吸收峰在 507 nm 和 566 nm 两处间发生互变, 定量
分析其活性高达 90% 以上。已证明藻胆蛋白中仅Α2PEC具有该高效可逆光致变色性质, 因此该性质
可以判断 Α2PEC 脱辅基蛋白与色素的重组是否成
功。藻胆蛋白 (包括本文研究的 Α2PEC)在蓝藻内的
作用是吸收光、传递能量至光合作用反应中心, 所以
检验重组是否成功主要检验吸收光谱和荧光光谱是
否与天然藻胆蛋白一致。
1　材料和方法
1. 1　藻红蓝蛋白脱辅基 Α-亚基 PECA 的制备
PECA 脱辅基蛋白由 pGEM D 2pecA 质粒在大
肠杆菌BL 21 中表达而制备, 该质粒由我们实验室
构建[4 ]。
1. 2　PECA 的溶解
PECA 表达后形成包涵体, 超声波破碎菌体后
PECA 不能有效溶于缓冲液中, 分别用以下 3 种方
法溶解 PECA :
A. 诱导后的 pGEM D 2pecA 大肠杆菌细胞经
T ris·HC l 缓冲液 (50 mmo löL , pH 615) 洗净重悬,
超声破细胞 30 m in, 悬液 8 000×g 离心 15 m in, 取
上清, 其中含溶解状态的 PECA 蛋白, 可用于重组,
该状态的 PECA 叫原始 PECA。随每次实验的差
异, 其总蛋白浓度在 20～ 30 m gömL 的范围内变动。
B. 上述方法所得沉淀中含 PECA 表达蛋白形
成的包涵体, 沉淀用8 mo löL 尿素、50 mmo löL T risõ
HC l缓冲液 (pH 615)溶解, 然后对 50 mmo löL T risõ
HC l、011% (vöv) T riton X2100 缓冲液 (pH 615) 透
析 2 次。透析后, 8 000×g 离心 15 m in, 取上清, 其中
含的 PECA 称为 T riton 增溶的 PECA (总蛋白浓度
约 20～ 30 m gömL )。
C. 上述含 PECA 包涵体的沉淀溶于 8 mo löL
尿 素、1% ( vöv ) 甘 油、1% ( vöv ) T riton X2100、
50 mmo löL T risõHC l 缓冲液 (pH 615) , 然后对
50 mmo löL T risõHC l、1% (vöv) 甘油、011% (vöv)
T riton X2100缓冲液 (pH 615)透析2次。然后8 000×
g 离心15 m in, 取上清, 其中含的PECA 称为T riton与
甘油增溶的PECA (总蛋白浓度约20～ 30 m gömL )。
1. 3　藻蓝胆素 PCB 的制备
PCB 色素由甲醇热回流法制备[5 ] , 方法如下: 取
40 g 藻蓝蛋白 (PC) 粉末 (经硫酸铵沉淀法得) , 悬浮
于 500 mL 甲醇中, 65℃水浴搅拌, 离心去上清, 再
用 500 mL 甲醇重悬。离心后沉淀重悬于 400 mL 含
4 g抗坏血酸钠的甲醇溶液中, 置回流装置中用电加
热包热回流过夜。滤取上清, 加400 mL 011 mo löL
盐酸, 用 100 mL 乙醚萃取数次, 水相用氯仿分次萃
取, 合并后用N aC l 吸取氯仿中的水, 旋转蒸发仪抽
干氯仿相, 用极性有机溶剂二甲基亚砜 (DM SO ) 洗
涤管壁即得藻蓝胆素 PCB , 终浓度约 1 mmo löL。
1. 4　PECA 与 PCB 的直接重组
建立 3 个不同的反应体系, 分别用 112 法所得
的 3 种不同 PECA 各 1 mL 与 10 ΛL PCB 的DM SO
溶液混合 (DM SO 终浓度不超过 1% )。该混合体系
放置于室温避光处, 适当时间后检测反应体系的可
见吸收光谱。一般 12 h 后重组反应达到终点。
1. 5　PECA与PCB在PECE和PECF催化下的重组
PECE 和 PECF 按文献 [ 6 ]和文献 [ 7 ]制备, 随
每 次 表 达 的 差 异, PECE 总 蛋 白 浓 度 约 5～
10 m gömL ; PECF 总蛋白浓度约 10～ 20 m gömL。
将 PECE 和 PECF 溶液按体积比 1÷ 1 混合, 该混合
溶液简称 PECEF, 其总蛋白浓度约 8～ 15 m gömL。
建立 3 个不同的反应体系, 分别加入 112 法所得的
3 种不同 PECA 各 015 mL、上述 PECEF 015 mL、
1% (体积比) 的 PCB 的DM SO 母液, 混合均匀。该
混合体系放置于室温避光处, 适当时间后检测反应
体系可见吸收光谱。一般 12 h 后重组达到终点。
1. 6　直接重组得到的蛋白2色素复合物经蛋白酶降
解所得短肽的分离提纯
按 114 方法重组得到的反应混合物用 T PCK
处理的胰蛋白酶 (T PCK treated tryp sin)水解。反应
93　第 1 期　　　　　　　　　　王 鲁等: 藻红蓝蛋白 Α2亚基脱辅基蛋白与藻蓝胆素的重组
后加浓盐酸调节混合物的pH 值至 2, 然后将该混合
物加样于用pH 2 的盐酸溶液平衡的B io2gel P60 层
析柱。该 pH 条件下B io2gel 吸附色素肽, 而无色素
结合的肽段被pH = 2 的盐酸溶液洗脱下来。最后用
30% 醋酸洗脱纯的色素肽, 该色素肽可冰冻干燥后
保存。
1. 7　催化重组所得产物的分离提纯
按 115 方法制备的反应混合物经硫酸铵沉淀浓
缩后溶解, 加入甲酸至终浓度63 mmo löL , 1 0000×g
离心 30 m in, 取上清液 (紫红色) 加样于63 mmo löL
甲酸平衡的B io2gel P60 层析柱, 用63 mmo löL 甲酸
洗脱, 收集紫红色组分即得纯蛋白2色素复合物, 也
可冰冻干燥后保存。
1. 8　胆素蛋白可逆光化学性质的测定
胆素蛋白可逆光化学性质的测定和计算按文
献[ 3 ]介绍的方法操作, 使用仪器为 Perk in E lm er
model L am bda2 紫外2可见分光光度仪。
1. 9　蛋白含量的测定
蛋白含量测定按B io2R ad (B radfo rd)法测定, 以
考马斯亮蓝 G250 染色, 牛血清白蛋白 (BSA ) 为标
准对照, 与标准曲线对照计算蛋白质含量 (测定
O 1D. 595nm )。
2　结果与讨论
2. 1　PECA 与 PCB 重组
原始 PECA 或 T riton 增溶的 PECA 与 PCB 能
顺利重组, 混合后反应自发起始, 生成的产物最大吸
收波长为 640 nm (图 1 中的实线) , 与反应前相比吸
收峰从 620 nm 移至 640 nm , 吸光度有改变 (对比图
1 中的虚线)。少量巯基乙醇 (1～ 5 mmo löL )的存在
干扰重组反应。T riton 与甘油增溶的 PECA 与 PCB
不能重组成功, 没有存在光谱差异的产物生成。这表
明原始 PECA 和 T riton 增溶的 PECA 折叠状态相
似; 但两者跟 T riton 与甘油增溶的 PECA 折叠状态
不一样, 后者的结构差别较大。不过 T riton 与甘油
增溶的 PECA 在 PECEF 的存在下能与 PCB 重组
生成吸收峰在 640 nm 的产物 (与原始 PECA 和
T riton 增溶的 PECA 重组结果相同 ) , 这表明
PECEF 一定程度上能帮助 T riton 和甘油增溶的
PECA 重折叠到正常状态。8 mo löL 尿素溶液溶解
的 PECA 用于与 PCB 在 PECEF 催化下的重组, 也
有吸收峰在 640nm 的产物生成, 这进一步表明
PECEF 可协助变性 PECA 的复性。
虚线: 重组前反应物的吸收光谱;
实线: 重组后产物的吸收光谱
B roken line: A bso rp tion spectra of the compound befo re
the reconstitu t ion reaction;
So lid line: A bso rp tion spectra of the compound after the
reaction
图 1　PECA 与 PCB 直接重组的吸收光谱检测
F ig11　A bso rp tion spectra of the PECA and
PCB direct reconstitu t ion
2. 2　直接重组后生成的 PECA -PCB 辅基色素的种
类
辅基色素与蛋白间的相互作用会造成吸收峰位
置的变化, 所以在非变性条件下单纯通过最大吸收
波长不能直接判断藻胆色素的种类。例如 PC 和
A PC 的辅基都是藻蓝胆素, 但正常条件下 PC 最大
吸收波长为 620 nm , 而A PC 为 650 nm。为使吸收
光谱更真实地反映色素的种类, 必须用 pH 115 的
8 mo löL 尿素溶液处理使胆素蛋白彻底变性; 或用
蛋白水解酶水解胆素蛋白至色素短肽, 然后初步提
纯色素短肽用于光谱分析, 以消除辅基和脱辅基蛋
白间的相互作用。与天然 Α2PEC 亚基不同, PECA 2
PCB 在酸性条件下极易沉淀, 因而不能象提纯
PECA 2PVB 那样 (见 213) , 直接在甲酸中用B io2gel
P 60 层析的方法来分离提纯。
直接重组产物在 pH 115 的 8 mo löL 尿素中最
大吸收波长为 665 nm (见图 2 实线) ; 按 116 方法经
水解而得的色素短肽最大吸收波长为 665 nm (图 2
虚线) ; 提纯后的最大吸收波长为 662 nm (图 2 中没
有显示)。它们与藻蓝蛋白中 PCB 在同样条件下的
最大吸收波长非常相近, 都在 662～ 665 nm 之间。
因此, 该重组产物中结合的辅基色素仍是 PCB , 没
有变化。
2. 3　催化重组生成的 PECA -辅基色素的色素种类
PECA 在 PECEF 催化下与 PCB 重组后, 在
PECEF 催化下 PCB 转变为 PVB。PCB 转变为 PVB
可从三方面证明: 一是重组生成的 PECA 2色素复合
物经蛋白酶降解后, 所得到的短肽最大吸收波长为
595 nm , 可逆光化学为 13% , 与天然 Α2PEC 按同样
04 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　　第 20 卷　　
方法得到的 PVB 短肽吸收峰的位置和可逆光化学
吻合[3 ] (见图 3) ; 二是重组生成的产物具有与天然Α2PEC 相同的高效可逆光化学性质 (图 4) , 与天然Α2PEC 一样也具有类型É 和类型Ê 可逆光化学反应
(图 5) ; 三是重组生成的产物具有与天然 Α2PEC 相
同的荧光性质。
2. 4　重组得到的胆素蛋白的可逆光化学
直接重组得到的 PECA 2PCB 的可逆光化学很
实线: PECA 2PCB 在 pH = 115 的 8 mo löL 尿素中的吸收
光谱;
虚线: PECA 2PCB 经蛋白酶彻底降解后的吸收光谱;
PECA 2PCB 经蛋白酶降解、提纯后所得的辅基色素短肽
的吸收光谱非常相近, 没有显示
So lid line: A bso rp tion spectra of the reconstitu ted PECA 2
PCB so lu ted in 8 mo löL U rea (pH 115) ;
B roken line: A bso rp tion spectra of the reconstitu ted
PECA 2PCB digested by pep sin, the abso rp tion spectra of
the ch romopho re2linked pep tide ob tained by purifying the
reconstitu ted PECA 2PCB digested by T PCK treated
tryp sin is very sim ilar (no t disp layed)
图 2　PECA -PCB 的辅基色素的吸收光谱
F ig12　A bso rp tion spectra of the
ch romopho re of reconstitu ted PECA 2PCB
上部实线: 500 nm 光辐射 3 m in 后所测吸收光谱;
上部虚线: 570 nm 光辐射 3 m in 后所测吸收光谱;
下部虚线: 上部实线减上部虚线所得差示光谱, 表征 PVB
短肽可逆光化学
U pper so lid line: A bso rp tion spectra after 3 m in
irradia t ion at 500 nm ;
U pper broken line: A bso rp tion spectra after 3 m in
irradia t ion at 570 nm ;
L ow er do t2dashed line: the difference abso rp tion spectra
(T he reversib le pho tochem istry of the sho rt pep tide)
图 3　纯化的重组 PECA -PVB 经蛋白酶彻底
降解后的可逆光化学
F ig13　T he reversib le pho tochem istry of reconstitu ted
PECA 2PVB tho rough ly digested by pep sin
小, 而催化重组得到的 PECA 2色素复合物 (经层析
柱纯化) 具有高效可逆光化学, 与天然 Α2PEC (即
PECA 2PVB ) 完全一样 (图 4 )。 PECA 2PCB 与Α2PEC的差别仅在于辅基色素, PCB 和 PVB 是同分
异构体, 只是 PVB 的共轭程度小于 PCB , 这表明
PVB 在 Α2PEC 类胆素蛋白高效可逆光化学反应中
的重要性。
用对氯汞苯磺酸 (简称 PCM S)修饰催化重组的
PECA 2色素复合物, 与 PCM S 修饰天然 Α2PEC 的结
果相同, 产物也具有类型Ê 可逆光化学[3 ] (图 5)。
实线: 500 nm 光辐射 3 m in 后所测吸收光谱;
虚线: 570nm 光辐射 3 m in 后所测吸收光谱
So lid line: A bso rp tion spectra after 3 m in irradia t ion at
500 nm ;
B roken line: A bso rp tion spectra after 3 m in irradia t ion at
570 nm
图 4　重组得到的 PECA -PVB 的高效可逆光化学
F ig14　T he h igh ly reversib le pho tochem istry
of reconstitu ted PECA 2PVB
实线: PCM S 修饰的重组 PECA 2PVB 的类型Ê 可逆光化学;
虚线: 重组 PECA 2PVB 的类型É 可逆光化学, 它们与天然Α2PEC
的完全相同
So lid line: the reversib le pho tochem istry of PCM S2modified
reconstitu ted PECA 2PVB (Type Ê ) ;
Do t2dashed line: the reversib le pho tochem istry of reconstitu ted
PECA 2PVB (Type É ). Bo th of them are iden tical to these of
native Α2PEC
图 5　重组 PECA -PVB 的类型É、Ê 可逆光化学与
天然 Α-PEC 的一致
F ig15　T he reversib le pho tochem istry of
reconstitu ted PVB2PECA (T ypeÉ and T ypeÊ ) are
iden tical to these of native Α2PEC
14　第 1 期　　　　　　　　　　王 鲁等: 藻红蓝蛋白 Α2亚基脱辅基蛋白与藻蓝胆素的重组
根据 zhao 的工作[3 ] , 当天然 Α2PEC 的 98、99 两个
Cys 侧链巯基受到修饰, 其可逆光化学的谱线形式
有相当的变化, 称类型Ê 可逆光致变色, 对氯汞苯磺
酸 (简称 PCM S) 能修饰 Cys 侧链巯基, 从而诱导纯
化的催化重组的 PECA 2色素复合物展现类型Ê 可
逆光致变色 (图 5) , 这也说明催化重组的产物具天
然 Α2PEC 独特的性质。
纯化的催化重组的 PECA 2色素复合物其最大
吸收峰在约 560 nm 处, 荧光发射峰在约 590 nm 处
(激发波长 565 nm ) , 均与提纯的天然 Α2PEC 相同
(图谱未显示)。藻胆蛋白最重要的生理功能是吸收
传递光能, 因而吸收和荧光发射光谱是其独特的性
质, 这一性质证明催化重组中生成的辅色素以至蛋
白结构均与天然 Α2PEC 的相同。
通过这一工作, 我们的合作项目研究了天然Α2PEC的生物合成中色素与蛋白连接这一重要环
节, 证实了藻红蓝蛋白操纵子 E、F 基因产物其生理
功能是催化脱辅基蛋白与藻胆色素的连接, 在此过
程中发生了色素的异构。
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24 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　　第 20 卷