全 文 ：武汉植物学研究 2007，25(5)：531～534
Journal D，Wuhan Botanical Research
新疆沙冬青叶片氨基酸和蛋白质的测试与分离
以及抗冻蛋白的鉴定结果分析
鲁春芳 “，尹林克h，牟书勇 ，赵峰侠 ，尉姗姗 ，
(1．中国科学院新疆生态与地理研究所，乌鲁木齐 830011；2．中国科学院研究生院，北京 100039)
摘 要：提取并纯化了新疆沙冬青(Ammopiptanthus nclnl~)叶片总蛋白，得到了适合新疆沙冬青叶片总蛋白提取的
最佳缓冲体系；用 DEA．E C分离了各蛋白质组分，并用SDS．PAG测定了纯度和分子量(14～90 kD之间)；氨基酸
组成分析显示了新疆沙冬青属内种遗传的一致性。对抗冻活性分析讨论证实了与蒙古沙冬青同属的新疆沙冬青
中也含有抗冻蛋白(AFPs)。
关键词：新疆沙冬青(Ammopiptanthus lKtnl~)；叶片总蛋白；氨基酸组成分析；抗冻活性
中图分类号：Q946．1 文献标识码：A 文章编号：1000．470x(2007)05．0531．04
Extraction and M easurement of Total Protein and Amino Acids，Analysis
the Identifcation Reset of Antifreeze Protein in Ammop~,tanthus nanus
LU Chun—Fang ’“
，
YIN Lin—Ke¨
， MU Shu．Yong ，ZHAO Feng．Xia ，YU Shan—Shan ’
(1．Xinfiang Institute ofEcology and Geography，The Chinese Academy ofsc s，Urumqi 830011，China；
2．Graduate Universityofthe ChineseAcademyof5c ，Beijing 100039，China)
Abstract：Total protein of the leaves of Ammopiptanthus nanu~was extracted，the bufer solution system
was established which can．obtain max leaves proteins from A．nanlKq．Al protein groups were isolated by
DEAE52-C，whose molecular weights(14—90 kD)and purities were measured by SDS—PAG．The results
of relative percentage of amino acids revealed the genetic consistency of the diferent species．Four protein
groups were identified as antifreeze proteins whose thermal hysteresis activities(THA)were 0．4~C，
0．33~C，0．48~C and 0．15℃ ，respectively．，Ihis was evidences of discovery of antifreeze proteins in
A．nanlKq．
Key words：Ammopiptanthus IIA2nlI~；Total protein；Amino acids；Antifreeze proteins
抗寒性是植物在系统进化过程中，为适应生态
环境获得的一种对策，抗寒性植物体内的多种耐低
温物质，如糖类、多元醇、脯氨酸、不饱和脂肪酸等，
对植物的抗冻适应起着巨大的作用，尤其当气温降
低或人工驯化与脱水还可以诱导形成大量的冷诱导
蛋白 0]。在进化过程中，冷诱导蛋 白的产生显得
尤为重要，因此，人们也将关注的焦点集中在对抗冻
蛋白的研究方面 J。已从极区鱼类、陆地昆虫、植
物 ．5]、细菌和真菌等各类生物中分离到多种抗冻
蛋白 ．7]，并测得了它们的基因序列及一些晶体结
构 ]，近些年主要集中开展该类蛋白质抗冻机制的
研究 。蒙古沙冬青[Ammopiptanthus mongolicus
(Maxim．)Cheng f．]叶片中已发现抗冻蛋白(anti-
freeze proteins，AFPs) J，但涉及其同属另一种新疆
沙冬青(Ammopiptanthus nanu~(M．Pop．)Cheng f．)
的报道不多，有关新疆沙冬青的抗寒性研究更少。
新疆沙冬青是新疆特有常绿的高抗寒阔叶木本植物
类群，已有的研究成果不能从属和类群的角度上说
明沙冬青抗低温胁迫的空间范围以及种间差异，针
对高抗寒植物沙冬青属的抗性机理还未进人系统性
的研究阶段。有研究证明在进化方面，植物 AFPs
暂无规律可遵循，即使是种源相近在 AFPs表达上
也不尽相同 ¨。因此，对新疆沙冬青中是否存在
AFPs这一问题的研究具有重要意义。另外，冷诱导
收稿 日期：2007．03．13，修回日期：2007·06·27。
基金项 目：国家科技部重大基础研究前期研究专项(2004CCA03400)；新疆维吾尔自治区自然科学基金资助项 目(200421106)；新疆生
物资源基因工程重点实验室开放课题(XJDX0201-2005-09)。
作者简介：鲁春芳(1980一)，女，在读博士生，主要从事新疆沙冬青抗冻生理生化方面的研究(E·mail：lef0330@yahoo．om．ca)；尹林克，
男。研究员(E·mail：y~nlk@ms．xjb．aa．ca)o
· 通讯作者(Author for correspondence)。
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532 武 汉 植 物 学 研 究 第25卷
和干旱胁迫会使植物AFPs活性提高口引。一些植物
抗冻蛋白与致病相关蛋白有序列同源性H引，为此，
我们以多年高温、大气干旱胁迫与低温胁迫兼而有
之的中科院吐鲁番沙漠植物园环境下引种的新疆沙
冬青为材料，分离纯化出了叶片总蛋白，对其氨基酸
组成进行了分析，通过对新疆沙冬青低温应激蛋白
的热滞活性(thermal hysteresis activity，THA)进行分
析讨论 ，证实了抗冻蛋白在新疆沙冬青叶片中也有
分布，为抗逆反应机制的进一步研究提供了基础。
l材料与方法
1．1 材料
新疆沙冬青 (Ammoplptanthus 17,anu,$)采 自中国
科学院吐鲁番沙漠植物园，该植物园地处42。5l N，
89。11 E。海拔一95一一76 m，终年干旱，夏季高温，
冬季寒冷，年平 均降水量 l6．4 mm，蒸发量
3000 mm，年平均气温 l4℃，平均湿度 40％；极端最
高温49．6℃，地面最高温度8O℃以上，极端最低温
度 一28℃。采集人工栽培 10 a以上的植株叶片，采集
时间为2005年 1月下旬(吐鲁番最低温所在时间)。
1．2 叶片总蛋白的提取及含量测定
称取5O g沙冬青样品，抽提缓冲液[25 mmol／L
Tris-HC1(pH 8．6)，0．1 moL／L NaC1，0．1 mmol／L
EDTA，1 mmol／L蛋白酶抑制剂(苯甲基磺酰氟，
PMSF)]中捣碎成糊状，三倍抽提缓冲液进行定容，
在离心管中充分摇匀，4~C静置数小时后，20000×g
反复离心数次，每次离心 30 min，漂去上层脂质，得
到澄清滤液。
使用核酸蛋白分析仪DU800(美国 Beckman公
司)，采用考马斯亮蓝染色法，在595 nln绘制标准
曲线，并测定A 值。
1．3 蛋白质的分离纯化
上清液用双流速中高压层析系统(美国 BIO-
RAD公司)进行梯度层析 引¨。分离上柱前用
25 mmol／L Tris．HC1(pH 8．6)，0．1 moL／L NaC1，
0．1 mmol／L EDTA平衡柱，然后用 25 mmol／L Tris-
HCl(pH 8．6)，0．1 mmol／L EDTA及梯度 NaC1洗
脱。步骤为先以0．1—0．3 mol／，L NaC1平衡液梯度
洗脱，用 0．3 mol／，L NaC1平衡液洗至 A瑚、A 吸收
值为基础水平，接着用 0．3—0．6 moL／L NaC1平衡液
梯度洗脱，再用0．6、1．0 mol／L NaC1平衡液洗脱，柱
体积为 60 mL，按每管5 mL收集样品。收集各洗脱
峰，由该仪器测得的A 帅和 A 印的比值估算各峰核
酸含量 ，收集样品脱盐后冷冻干燥，分装后于
一 7O℃冰箱备用。
1．4 蛋白质分子量测定
使用垂直电泳(美国 BIO．BAD公司)。聚丙烯
酰胺凝胶 电泳 (polyaerylamide gel eleetrophoresis。
PAGE)的Acr和 Bis总浓度 (T)为 3％，交联剂百
分 比(C)为2．67％ ，不连续体系，样品缓冲液为内
含 1％ SDS，1％ 3-巯基乙醇，20％ 甘油，0．02％ 溴
酚蓝，0．01 mol／，L pH 8．0 Tris．HC1缓冲液。电压设
定为500 V；电泳时间5 h。整个过程以循环水将环
境温度控制在 l5℃。
1．5 叶片氨基酸组成分析
将在植物园采集的成熟叶自然风干后 ，于 80~C
条件下烘干，研磨至粉状，送至新疆维吾尔自治区测
试中心测定 ¨。
2 结果与分析
2．1 标准曲线及沙冬青叶片的总蛋白质含量
BSA标准蛋白溶液浓度与吸光度值 A 关系
曲线的回归方程为：Y=1．1448x+0．0324。相关系
数 r =0．9992，式中，为浓度， 为吸光度。说明在
595 nm处 BSA溶液的浓度和吸光度之间有良好线
性关系，遵从朗伯．比尔定律，而且二者的吸收曲线
基本一致，可以用来测定蛋白含量，沙冬青总蛋白含
量测得为3．5 mg／g。
2．2 DEAEu-C分离蛋白质组分
沙冬青叶片蛋白质经 DEAE52-C离子交换层析
分离得到各个蛋白质组分。从图1和表 1中各蛋白
质峰值 A勰。／A：印值发现样品中?昆杂的核酸百分含量
较低，蛋白浓度较高，得到部分纯化的蛋白质。
No of cuvete
#i8152331394755637l7987951041154111927354351596775839199l0811981 52331 3947
00
u 00 300 uu 600 00 900 O0 l 200 00
Volume(mL1
柱体积为60 mL，平衡缓 冲澈为 5 mmol／L Tfis-HC1，pH=8．6，
NaC1梯度洗脱，按每管5 mL收集样品
T0tal volnine was 60 mL．equilibration bufer involved 5 mmol／L
Tris．HCI．pH ：8．6 and gradient elution solution of NaC1；5 mL IIrI_
pie solution weIe collected every tube
图 1 DEAEs2-C离子交换柱层析
Fig．1 DEAE ，celulose iOil exchange
chromatography(IEC)
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第5期 鲁春芳等：新疆沙冬青叶片氨基酸和蛋白质的测试与分离以及抗冻蛋白的鉴定结果分析 533
Ta
表1ble 瑚、A瑚 值
t 31 value offracions 讨论 A280，A260
Note：This datasheet is from DEAE52 celulose chromatography
2．3 SDS-PAG鉴定蛋白质分子量及纯度
SDS—PAG显示沙冬青叶片中分布着分子量约为
14～90 kD分子量的蛋白(图2)。经过 DEAE5 一C纯
化后的蛋白，仍然存在着若干不同组分，特别是5，6，7
峰收集的蛋白为 3种以上不同分子量的蛋白组分。
n
图 2 DEAE5rC分离各样品的 SDS-PAG(12．5％)
电泳考染图谱(M为标准分子量)
Fig．2 The fractions from DEAE52-C was performed
on 12．5％ SDS—PAG patem(M：Marker)
2．4 氨基酸组成百分率
氨基酸组成分析结果表明：天门冬氨酸含量最
高，占总量的 12．76％；其次是脯氨酸和谷氨酸，分
别为 10．78％和 8．32％；缬氨酸、亮氨酸和丙氨酸等
疏水性氨基酸含量总计占总量的 21．48％；芳香族
氨基酸(苯丙氨酸和酪氨酸)占9．43％；甲硫氨酸和
组氨酸分别占3．33％和2．06％；其余氨基酸各自百
分含量在0．95％～5．86％之间(表2)。
表 2 叶片中各氨基酸相对含量
Table 2 Relative percentage of amino acids in leaves
氨基酸 Content 氨基酸 Content
Amino acids (％) Amino acids (％)
Lys 5．86 Ala 6．5O
Try 0．95 耵1r 5．39
Asp 12．76 Ile 5．71
Ser 4．83 His 2．o6
G1u 8．32 Val 7．29
Cys 1．51 Leu 7．69
Pro 10．78 Arg 3．41
Tvr 3．41 Phe 6．02
Met 3．33 Gly 4．20
(1)适当pH的抽提缓冲液能增加蛋白质的稳
定性和溶解度。提取植物材料中的蛋白质时，要特
别注意提取物的 pH值，因为植物细胞 中有巨大的
液泡，在细胞破碎以后，液泡里的物质能改变提取所
用的缓冲液pH值。因此，缓冲液的配方需要因材
料而异反复多次实验 1 ，我们得到了最大提取量
的缓冲体系，制定出适合于沙冬青蛋白提取的最佳
方案；同时，此方案对双向电泳样品处理提供了一定
的参考 。电泳 上样量 为 20 g、凝胶 浓度 为
12．5％时沙冬青各组分蛋白条带清晰。
(2)有资料表明，在进化方面，植物 AFPs毫无
规律可言，即使是种源相近在 AFPs表达上也不尽
相同 ∞ 。例如胡萝 卜表达 AFPs，而欧洲防风根
(与胡萝 I-亲缘很近的一个种)则不表达r1引。新疆
沙冬青叶片氨基酸组成中，天门冬氨酸和谷氨酸含
量均较高，反映了沙冬青属内遗传的一致性 (对
于测定所得的抗冻蛋白的氨基酸组成将做进一步
测定，并与已知的抗冻蛋白进行比较分析)。我们
将经DEAE 一C分离后的各蛋白质组分用差示扫描
量热法(DSC)测定 THA值 ，发现蛋白浓度为
20 mg／mL时 4组蛋白有热滞活性，THA分别为
0．4~C、0．33~C、0．48~C、0．15℃ ，表明新疆沙冬青
叶片中含有具热滞活性的抗冻蛋白。这一发现证实
了同属植物亦含有抗冻蛋白这一重要结论，为抗冻
蛋白表达规律提供了新的论据，并为“抗冻植物中
可能普遍存在抗冻蛋白”L2钊提供了论据。
(3)经电泳谱带发现，经 DEAE 一C分离得到
的蛋白为分子量不均一的多种蛋白质的复合物，仍
为部分纯化的蛋白质粗制品。有研究表明，粗制的
AFPs活性有高于或远远高于纯化的抗冻蛋白的现
象。因此，沙冬青抗冻蛋白热滞活性的出现是否为
多种蛋白或多种内源物质共同作用的结果，还是一
种独特作用的结果，还需对层析分离后的各蛋白质
进一步纯化后定论。另外，植物抗冻蛋白的表达和
积累，既受控于发育及转录因子调节，又受到低温、
短日照、脱水及乙烯等因素的影响。异源超表达抗
冻蛋白基因能赋予敏感宿主植物抗冻能力 ¨。新
疆吐鲁番沙漠植物园作为新疆沙冬青所存在的典型
生境条件，为这一高抗寒常绿植物提供了终年干旱、
夏季高温、冬季低温的天然胁迫条件，是发现抗冻蛋
白的重要线索。在这种典型的胁迫条件下是否产生
了多种应激蛋白并相互作用，有关的抗冻机制和表
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534 武 汉 植 物 学 研 究 第 25卷
达调控，以及遗传转化等方面的研究，在沙冬青属植
物中有何异同，也是值得进一步探索的。
(4)胁迫可以引起大量的蛋白质在种类和表达
量上的变化 ，而蛋白质组学研究可以使我们更
好地了解非生物胁迫的伤害机制以及植物对非生物
环境的适应机制。信号应答过程中蛋白质的变化状
况逐渐引起了人们的关注。人们对干旱诱导，盐胁
迫诱导等方面做了一些相关的蛋白质组学研究。利
用差异蛋白质组学的理论和方法，通过对低温胁迫
环境下新疆沙冬青应激蛋白质组变化的研究，比较
分析低温胁迫环境下蛋白质组发生的变化，从而认
识新疆沙冬青的抗寒生物化学响应特点，揭示应激
蛋白的类型及与其它蛋白质瞬时或稳定的相互作
用，蛋白点的类型，抗冻蛋白是否同样具有抗其它逆
境作用(包括干旱、病虫害、高温等)，是非常有意义
的。因此对新疆沙冬青胁迫条件下的蛋白质组学的
研究是很有价值的。已经通过上述一系列实验和方
法得到了成熟的提取纯化蛋白经验，在此基础上，我
们将对沙冬青的蛋白质组学内容做进一步研究。
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