全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 5期
油菜叶片总蛋白质双向电泳样品制备方法的改进
孔芳 蒋金金 吴磊 葛才林 王幼平
(扬州大学生物科学与技术学院,扬州 225009 )
摘 要: 以甘蓝型油菜 扬油 6号!的叶片为试验材料, 分别采用传统的 TCA /A cetone(三氯乙酸 /丙酮沉淀法 )和改进的
PEG ( po ly ethy lene g lyco l)分步提取法提取叶片可溶性总蛋白,并利用条件一致的蛋白质双向电泳体系进行比较。TCA /Acetone
法提取的蛋白质双向电泳图谱背景中由于高丰度 housekeep ing!结构蛋白的存在, 特别是叶片中参与光合作用的 Rub isco蛋
白的干扰, 图谱中低丰度调控蛋白受到了高度覆盖和遮蔽现象, 影响双向电泳图谱的质量。而 PEG分步提取法提取的蛋白质
样品, 可以剔除 Rub isco蛋白,使获得的双向电泳图谱清晰 ,无斑点间的遮蔽现象, 为油菜叶片蛋白质组定量和定性分析提供
了丰富的信息。
关键词: 油菜 叶片总蛋白 双向电泳 图谱
Improvement of PreparationM ethods of TwoD imensional E leteophoretic
Samples of Proteom e from Brassica Leaves
Kong Fang J iang Jinjin W u Le i Ge Cailin W ang Youping
(College of B ioscience and Biotechnology, Yangzhou University, Yangzhou 225009)
Abstrac:t W ith leaves o fB rass ica napus L. cv. Y angYou 6! used as experim enta l ma teria ls, the pro te ins w ere ex tracted from
leaves by TCA /Acetone precipitation and differential PEG ( Po lyethy lene g lyco l) prec ip itation m ethod and com pa red by twod im ensiona l
electropho resis system w ith un ifo rm cond itions o f prote in. The background no ise o f twod im ensiona l e le teophoresism ap o f pro te in extrac
ted by TCA /Acetonem ethod w as great, and c larity w as poor. This w as partia lly attr ibuted to the ex istence o f h ighabundan t pro te ins,
such as ribulose1, 5b isphosphate ca rboxy lase /oxygenase( Rub isco ) in leaves. They engaged a la rge proportion o f the w ho lecell pro
te ins and thus preventd lowabundant pro teins from be ing uptaken by imm ob ilized pH grad ient( IPG ) str ip, consequently m aking the
latter poor ly de tectab le by 2DE. So they form ed high cove rage, shading on the other pro te in spots and affected the accurate express ion of
m ap in fo rm ation. H ow ever, through dep le tion o f the h ighabundant pro tein Rub isco during differentia l PEG prec ip itation m ethod, the
background no ise o f e lec trophoresis m ap w as little, and PEG fractionation im proved detection of lowabundant pro teins, there w as no
shading phenom enon among spo ts. Therefore it prov ided abundant informa tion for quantitativ e and qualitativ e analyses on the proteom es
from B rass ica leaves.
Key words: Brassica P ro teom e from leaves TwoD im ens iona l e lectrophoresis M ap
收稿日期: 20091221
基金项目:国家自然科学基金 ( 30671166, 30971812 )
作者简介:孔芳,博士研究生,研究方向:植物遗传学
通讯作者:王幼平,教授,博士生导师, Em ai:l w angyp@ yzu. edu. cn
随着后基因组时代的兴起, 蛋白质组学 ( pro
teom ics)研究已成为功能基因组学研究的重要方法
与内容 [ 1] ,它是对生物体生命活动最终执行者 ∀ ∀ ∀
蛋白质的定量、动态和整体性的研究 [ 2, 3] , 其三大核
心技术分别为双向电泳技术、质谱技术和生物信息
学 [ 4]。双向电泳 ( two d imensional e lectrophoresis, 2
DE )技术作为蛋白质组研究的起始与关键技术, 它
以蛋白质的等电点和分子量作为独立参数, 第一向
按蛋白质的等电点不同,对样品进行等电聚集 ( iso
e lectric focusing, IEF)分离,然后在第二向根据分子
量大小用十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳
( SDSPAGE)进行分离, 最终可获得分辨率很高的
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 5期
有二维图谱, 为后续蛋白质的鉴定提供良好的基
础 [ 5]。目前虽然许多技术已用于蛋白质分析中,如
高效液相色谱法 ( HPLC ) , 同位素标记亲和标签
( ICAT )和蛋白质微阵列 ( pro tein m icroarrays) [ 6, 7 ] ,
但样品的制备是蛋白质组分析中的关键步骤。维持
细胞正常代谢的结构蛋白 ( housekeeping prote in)以
10
5
- 10
6
/每个细胞的高丰度拷贝数存在于细胞
内 [ 8- 10] ,然而由于高丰度蛋白的存在, 掩盖了更具
研究意义的低丰度蛋白。低丰度蛋白在细胞内可能
具有重要的调节功能,但这些因子或分子以 100 /每
个细胞的相对较低丰度存在。低丰度蛋白是高动态
变化的,并且在不同的发育阶段和不同的生理病理
状态下基因表达也呈多样性而有所差别, 因而不能
象核酸以 PCR ( polymer cha in reaction)方式有效扩
增进行富集,从而造成检测的 困难性 ! [ 11, 12]。
油菜作为一种重要的经济作物, 研究油菜优质、
高产和抗病性等性状相关蛋白具要重要的意义。本
研究对油菜叶片总蛋白质的提取方法进行了改进,
通过改进的 PEG分步提取法可有效剔除油菜叶片
中高丰度的 Rubisco结构蛋白,提高低丰度蛋白可
检测性,使油菜蛋白质双向图谱的饱和度与分辨率
有所提高,这为进一步开展油菜的蛋白质组学的研
究奠定基础。
1 材料和方法
11 材料
甘蓝型油菜 (B rassica napus, AACC, 2n = 38, #扬
油 6号 ∃ )种子由江苏省里下河地区农科所提供。
12 叶片总蛋白的提取
三氯乙酸 /丙酮沉淀法:取室温条件下油菜种子
发芽后四周苗龄的第三片叶 3- 4 g放入预冷的研
钵中研磨成粉后,转至离心管,加入 3倍体积的蛋白
提取液 ( 30 mM TrisHC l( pH 80), 01 mM EDTA, 6
mM A scorbic ac id, 5mM M gC l2, 1% po lyv inyl pyrro li
done, 002% mercaptoethano,l 1% g lycero ,l 2%
SDS) , 4% 下混匀; 15 000 & g离心 15 m in,将上清
液转入另一离心管中, 向管中加 4倍体积的 10%
TCA溶液 ( 10% trich loroacet ic ac id, 002% m er
captoethano l( v /v ) ) ,混匀, - 20% 静置 3 h, 18 000 &
g离心 15 m in,沉淀用 80%冷丙酮洗涤 3次,最后用
冷丙酮 乙醚液 (体积 1∋1)洗涤,沉淀经真空干燥得
到粉末状蛋白, - 80% 冰箱保存备用。
聚乙二醇 ( PEG )分步提取法 [ 13] , 如图 1。称取
条件一致的 1 g叶片放入已预冷的研钵中, 加入 5
倍体积的蛋白质提取液 ( 05 M TrisHC ,l 1% Tri
tonX100, 20mM M gC l2, 2% ( v /v ) mercaptoethano,l
1mM PMSF, 1mM EDTA, 1% (w /v ) PVP),在冰浴上
研磨成糊状, 匀浆后移入 20 mL离心管中。在 4%
条件下 10 000 r/m in离心 15 m in,弃去沉淀后,每次
取上清液然后加入 PEG,置于冰浴上至少 30m in,重
复 3次,使 PEG浓度依次达到 8% , 16%和 24%, 最
后一步所得沉淀蛋白组分 F4作为 PEG法的双向电
泳材料。
图 1 油菜叶片蛋白质 PEG分步提取示意图
13 蛋白质含量测定
采用 R am ag li改进的 Bradford[ 14 ]方法, 以蛋白
质裂解液为空白, 以 1 mg /mL BAS标准蛋白 (标准
蛋白溶液用蛋白质裂解液配制 )为标准制备标准曲
线, 在紫外可见分光光度计上于 = 595 nm测定用
三氯乙酸 /丙酮沉淀法所获得油菜蛋白质样品的
含量。
14 双向电泳
141 水化加样及等电聚焦 称取 10 mg蛋白样
品, 在 15mL离心管中加入 350 L水化缓冲液 (含
7M U rea, 2 M Th iourea, 4% CHAPS, 65 mM DTT,
94
2010年第 5期 孔芳等:油菜叶片总蛋白质双向电泳样品制备方法的改进
02% B ioampho ly te载体两性电解质, 0001% 溴酚
兰 ) ,超声波裂解后, 在 4% 条件下 8 000 & g离心 2
m in,取上清液进行等电聚焦。选用 11 cm IPG胶条
( pH4- 7, B ioRad公司 ) , 蛋白上样量 350 g, 于水
化盘中水化上样 12 h。从水化槽中取出 IPG胶条移
入样品聚焦盘中,并以矿物油覆盖 (防止尿素析出、
蛋白氧化及产生冷凝水 ) , 置于等电聚焦仪 ( B io
Rad)进行聚焦。等电聚焦电泳参数为 250 V,慢速,
30 m in,除盐; 1 000 V, 快速, 60m in, 除盐; 8 000 V,
线性, 4 h,升压; 8 000 V, 快速, 45000,聚焦; 500 V,
快速, 任意时间, 保持。
142 胶条的平衡 等电点聚胶后的胶条置于平
衡缓冲液( (含有 6 M尿素, 20%丙三醇, 2% SDS,
0375M TrisHC ,l pH 88和 2% DTT )中平衡 15
m in,然后再置于平衡缓冲液 ) (含有 6 M 尿素,
20%丙三醇, 2 % SDS, 0375M T risHC,l pH88和
2%碘乙酰胺 )平衡 15m in。
143 SDSPAGE电泳 制备分离胶: 质量分数为
125%, 用镊子小心放入已平衡好的胶条, 并用
08%低熔点琼脂糖 (含 0001%溴酚兰 )封固胶条,
放置约 5 m in,使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固,在
上、下槽中加入 1 &电泳缓冲液。采用 DYCZ24EN
型垂直电泳槽, DYY10型电泳仪 (均为北京六一仪
器厂 )电泳。以 5mA /胶板恒流电泳约 20m in,待样
品进入 SDSPAGE后再用 20mA /胶板恒流电泳,直
到溴酚兰到达分离胶底部距胶边缘约 1 cm处停止
电泳。
144 考马斯亮蓝染色 电泳后的凝胶用超纯水
洗 3次, 5 m in /次, 再放入 B io safe coomassie染色液
中染色过夜, 最后用超纯水脱色, 直至蛋白点清晰
为止。
145 凝胶成像及软件分析 用 GelDoc XR system
进行图像扫描, PDQuest二维分析软件对图像进行背
景消减、斑点检测、匹配 (均以 CK为 master胶 ),并分
析差异蛋白、计算斑点的等电点和分子量。
2 结果与分析
本试验采用 TCA /丙酮沉淀法和改进的 PEG分
步提取法分别提取油菜叶片总蛋白质,用 11 cm IPG
胶条 ( pH4- 7)等电聚焦,参照考马染色蛋白上样量
标准 ( 250 - 1 000 g ), 试验中上样量为 800 g,
12% SDSPAGE进行分离。对两种方法提取蛋白所
得的 2DE图谱进行比较分析, 经过软件分析和手
工修正,以匹配斑点进行相关性统计分析后发现,在
TCA /丙酮沉淀法 ( 2a)与 PEG分步提取法 ( 2b)图
谱分别检测到 75和 107个蛋白质斑点,后者在前者
基础上增加了 32个蛋白斑点。从图 2a中可以看
出, 采用 TCA /丙酮沉淀法提取出来的蛋白双向电
泳图谱背景中由于叶片中 持家蛋白 !Rub isco的干
扰, 在胶条 pH6 - 7碱性且蛋白质分子量 50 kD大
小部位会形成很粗的横条纹, 对其它蛋白质点构成
高度覆盖和遮蔽, 影响图谱信息的准确表达。并且
TCA /丙酮法在蛋白质提取过程中, 蛋白质在形成沉
淀的同时,叶片中的多糖和脂类物质并未能完全溶
于有机溶剂中被除掉,而是与蛋白质一并沉淀,在后
续的处理中,不易与蛋白质沉淀分离,这样也会对双
向电泳图谱形成干扰,这一现象清楚地展现在蛋白
质双向电泳图谱上。图 2a中椭圆型区域内大型横
条纹,聚集在胶条等电点 pH4- 5酸性部位,就是染
色后的多糖或脂类成分, 同时也会对附近的蛋白质
点构成遮蔽,使蛋白质图谱信息失真。而采用改进
的 PEG提取的方法,首先经 PEG多步提取后可去
除 90%的高丰度蛋白 Rubisco,而提取液中的 PMSF
成分又可抑制丝氨酸蛋白酶 (如胰蛋白酶、胰凝乳
蛋白酶、凝血酶 )和巯基蛋白酶 (如木瓜蛋白酶 ), 有
效地预防蛋白质成分的降解, 提高了分离后的蛋白
质的纯度,减少了双向电泳中的干扰物质,从而使得
蛋白质双向电泳图谱背景清晰度增强, 无不规则、大
块斑点或横条纹形成。相比较, 蛋白质点间无相互
遮蔽现象产生。
为了检验 PEG提取法的蛋白损失量, 本研究做
了 3次重复性蛋白提取试验, 表 1总结了 3次重复
间误差未达到显著水平。在 PEG法提取的总蛋白
量中, 在第三步中达到最高水平量, 在平均总量
181 mg中达到 838 mg, 超过蛋白总量的 46%以
上, 而 PEG总量与 TCA /丙酮法提取的蛋白总量相
差仅 026mg(每 4 g叶片 ), 蛋白质的边际损失效应
可能是由于分步提取而造成的。这些结果表明, 聚
乙二醇分步提取方法可能会恢复较高重复性的可溶
性蛋白。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 5期
蛋白上样量为 800 g, 11 cm 胶条 ( pH 4- 7 ), 在 12%的
SDSPAGE分离胶上电泳,随后考马斯亮蓝染色,图 a中
箭头所指为 Rub isco蛋白,椭圆区域所指为多糖和脂类
物质的干扰。蛋白分子量标准 kD
图 2 TCA /丙酮沉淀法 ( a)与 PEG分步提取法 ( b)的
2DE比较
表 1 TCA /丙酮沉淀法与 PEG分步提取蛋白量相比较
PEG蛋白总量
( mg /4 g叶片 )
TCA蛋白总量
(m g/4 g叶片 )
样品
重复 F
*
1
F2 F3 F4 F5
蛋白总和
( F1F5 )
蛋白总和
(TCA提取 )
1 232 368 816 208 152 177 213
2 246 390 880 200 160 187 206
3 235 370 820 203 150 178 201
平均
值 237 376 838 204 154 181 207
* 数据显示 PEG3次重复间误差未能达到显著水平 (P <
005 ),样品重复 F
1
F
5
为 PEG分步提取的蛋白量
3 讨论
植物叶片中存在大量的酚、醌类及色素类物质,
可通过氢键与蛋白质结合而干扰蛋自质的电泳行
为,因此,对高等植物绿色组织的蛋白质电泳难度较
大。该研究通过比较 2种不同的蛋白提取方法,通
过 2DE观察所得蛋白图谱, 差异是比较明显的。
通过大量的油菜蛋白提取和 2DE试验, 本研究认
为 PEG分步提取的方法优于传统的 TCA /丙酮沉淀
法。由于植物叶片中含有高丰度的将 CO2还原成
有机碳的 Rub isco限速酶 [ 15] , Rubisco本身是植物叶
片可溶性蛋白中含量最高的蛋白, 约占 50 % [ 16 ]。
由于高丰度蛋白不参于基因调控, 因此成为干扰双
向电泳蛋白质组分析的重要因子。表现在两方面:
一是 Rubisco蛋白会与低丰度蛋白结合在一起, 从
而造成后者的 不可检测性 ![ 17] ; 二是由于 Rub isco
蛋白占叶片可溶性蛋白样品中较大比重,而胶条的
承载能力又有限, 又会造成低丰度蛋白可能以少量
甚至于未能被胶条吸胀。因而试验在常用的 TCA /
丙酮一步沉淀法基础上, 对油菜叶片总蛋白提取过
程作了改进, 利用 PEG逐步去除油菜叶片中 Rubi
sco蛋白的干扰, 达到效果理想、图谱清晰的 2DE
图谱,为蛋白质双向电泳提供了真实可靠的基础数
据。经过两种蛋自质提取方法的分析比较可知, 改
进的 PEG法适用于油菜叶片总蛋白质的提取与双
向电泳分析,同时对叶片类蛋白的提取具有一定的
借鉴意义。
此外, 干燥后的蛋白质样品在等电聚焦前要溶
解在水化上样缓冲液中, 因该缓冲液中含有高浓度
的尿素,遇热后分解产生氰酸盐而引起蛋白质氨基
甲酰化,这会影响后继的质谱鉴定。因此,溶解后的
蛋白质样品尽量不要加热, 温度也不宜超过 37% 。
另外,蛋白质样品一旦溶解在含尿素的水化上样缓
冲液中,最好当天使用, 如果冷冻保存,应分装冻存
以减少反复冻融对蛋白的损耗。
理想的染色方法应该具备灵敏度高、线性动态
范围宽的特点,并且可以兼容 MS分析及 Edm an测
序等。为了获得清晰准确的 2DE图谱, 采用合适
的染色方法至关重要。目前常用的染色方法有考马
斯亮兰、银染和荧光染色法。银染法尽管灵敏度高,
但步骤繁琐、耗时长, 需要严格把握时间,并且稳定
性和重复性较差, 而且银染过程中加人的甲醛会引
起蛋白质修饰,影响后继的质谱鉴定,荧光染色灵敏
度也很高,但是试剂昂贵, 并需要专门的仪器设备。
考马斯亮兰 R250染色法易操作, 可是灵敏度低, 样
品中许多低丰度蛋白检测不到。本试验是使用 B io
Rad的胶体考马斯亮兰 G250进行染色。
参 考 文 献
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(下转第 110页 )
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 5期
究方向。
XF9、XF18和 XF2216三株放线菌对西瓜枯萎
病有很强的抑菌活性, 是较好的防治枯萎病的有益
微生物,从中开发出新型、高效、无毒天然农用杀菌
剂的潜力十分巨大。三株拮抗菌的获得不仅为开发
出廉价、高效的生物农药奠定了菌种基础,而且为进
一步的研究西瓜枯萎病高效拮抗菌的拮抗机制提供
了试验基础。
参 考 文 献
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