全 文 ：p卿 7 zr
广 西 植 物 Guihaia 19(4)：367—-372 1999年 1】月
文章缗导 100~-3142(1999)o4—o]67_o6
部分裸子植物叶片总蛋白分析 ＆9母 ．
王 艇’，苏应娟’，
(1．申山大学生奇科学学院．广东广州 510275；
兰 建明
2 湖北中医学院药学秉，湖北武攫 430061)
摘 要：采用 SDS—PAGE技术，分析 了红豆杉科 (Taxaseae)植物南方红豆杉 (Taxus chinensis
cal．mairei(Lemse et Levi．)Cheng et L．K．Fu)、 穗 花杉 (Amentotaxus argotaenia (Hante)
Pitger) 云南穗花杉 (A yunnanensisLi)、白豆杉 (pseudotaxus chienii(Cheng)Cheng)以及三尖
杉科 (CephaIotaxaceae)．植物三尖杉 (Cephalotaxusfortune Hook．￡) 粗榧 (C sinensis
(Rehd．etWils．)Li)、海南粗榧 ( ．hainanensisLi)、篦子三尖杉 (C o ve Mast．)和罗汉松科
(Podocarpaseae) 植 物 罗 汉 橙 (Podocarpusmacrophylus(Thunb．)D．Don)、 鸡 毛 松 (P
imbricatusBI．)、竹柏 (P．nag,：(Thunb．)Zol1)、陆均松 (Dacrydiumpierre[Hicke1)共 I2种植物
的叶片蛋 白，在蛋白质水平上采用定性分析方法探讨 了3科的系统发育关系。 结果表明：【】)同
意在红豆杉科内建立穗花杉属 (Amentotaxus)的观点，不支持将穗花杉属 (Amentotuxus)独立
成科的处理方式。(2)白豆杉应为红豆杉科内一个属 Pseudotaxus。(3)三尖杉科 (属 )分为蓖子
三尖杉组和三尖杉组。(4)支持将竹柏类植物留在罗汉松科 内的观点，不支持蒋竹柏类植物独立
成科的处理方式。(5)三尖杉科与红豆杉科的亲缘关系比罗汉秘科更近。
关键词：塾星堑型i三 堑型j星婆丛至
中国分类号：Q949．66 文献标识码：A
：堡耋 屯笈 耱 ·于}f瑶白
Analysis of leaves total protein from some
Gymnosperms
WANG Ting。，SU Yir,g-juan。，HUANG Chao。，ZHU Jian-ming
【_Lq-e Science Schoo1．Zhongshan Umver,fty．G~ngzhou 510~5．clIjm，L Dep~rtmem ofPharn~ey Hubei Chin~ T~ditional
MedicalCollege,Wtthan 43006I．cbiM 1
Abstr_ct： Leaves total protein of 12 species ofTaxaceae
, Cephalotaxaoeae and Podocarpaseae was
analysed by using SDS-PAGE．The phylogenetlc relationships of three families were discus sed bv
fixed quality method．The results generated by protein impIy：(1)Amentotaxus is bet~r山 sed in the
Taxaseae than in a separated family
． (21 It is supported to assign Pseudolaxus chienii to a sepa rate
genus in Taxagseae,(3)It is agreed that Cephalotaxaceae(ceplalotaxus)should be divided in[0 two
Sections--Sect．Pectinatae and Sect．Cephalotaxus4_4)It is unreasolable to sepa rate nageiaoids from
Podocarpus to establish an new family Nageiaseae． c5)Cephalotaxaseae is moIe closed t0 Taxa0eae
婚 日期=
作者倚舟：
基叠摩目：
199 —O 一n
王 越 (196 }．男．耐蕞授。从
目寡自枯抖学基垒 (3950013-3971~1tt7)，广东省白赫抖学基盘 (95OO99。970176)和广州市抖委重点攻美项日
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368 广 西 植 物 19卷
than Podocarpaccac．
Key wo~ds： Taxacea~；Cephalotaxaceae；Podocarpaceae；leaves total protein
在裸子植物的分类和研究方面一直都存在许多困难和分歧．尽管自本世纪初 来植物学者就为此
进行着不懈 努力 ，但是至今仍 然没有获得满意结果．其 中在红豆杉 科 (Taxaceae)、三 l尖杉科
(Cephalotaxaceae)和罗汉松科 (Podocarpaceae)系统学研究 中所存在的争论更为明显。 目前对红豆杉
科、三尖杉科和罗汉松科的比较形态学、术材显微结构、叶的解剖特征、配子体发育、胚胎发生、细
胞学及植物化学 “叫 方面的研究均有报道，但从叶片蛋白质分析 3科植物系统位置的报道却非常有
隐
本文研究 了红豆杉科 (Taxaceae)植物南方红豆杉 (Taxi~schinen．~is var．mairei(Lemee etLev1．)
Cheng etL．K．Fu)穗花杉 ( m阴f0f口x argotaenia(Hance)Pilger)、云南穗花杉 (A．yunnanensis
Li)、自豆杉 (Pseudotaxus chienii(Cheng)Cheng)以及三尖杉科 (Cephalotaxaceae)植物三尖杉
(CephalotaxusfortuneiHook．E)、粗框 (c．sinensis(Rehd．etWils．)Li) 海南粗榧 (c．hainanens~
Li)、篦 子三尖 杉 (c oliveriMast．)和罗 汉松科 (Podocarpaceae)植物 罗汉 松 (Podocarpus
macrophyllus(Thunb．)D．Don) 鸡毛松 (P imbricatus) 竹柏 (P．nagi(Thunb．)ZoI1)、陆均松
(Dacrydium pierrei Hioke1)共 l2种植 物 的叶 片蛋 白， 在 蛋 白质 水 平对 3科植 物 的系 统 发
育进行 了探讨．
1 材料与方法
1．1 材料来源
l2种植物材料来源见表 1，凭证标本藏于
华南植物园和中山大学植物标本室
1．2 主要试剂
Acr(acrylmide， 丙 烯 酰 胺 )、 Bis
(methylene-bisarylmide,NN一甲叉 双 丙 烯
胺)．SDS (Dodeeylsufate-Na-Salt，十二烷
基 磺 酸 钠 ) 为 S~rva 产 品 ． TEMED
(NN，NN-tetramethyle Thylene-Diamine~
N，NN 一四甲基乙二胺 )购自北京天象人有
限公 司．Tris (三羟甲基氨基甲烷 )购自美国
SIGMA 公司 (优级纯)． mercaptoethend
( 巯基乙醇)购 自美国 SIGMA公司 (优级
纯)．其余试剂为分析纯试剂．
1．3 实验方法
衰1 材料来濠
Table 1 Theorigm ofmateriak
编号 名称
样品 株敷
Number of
plants
采 集地
Ori n
参见于玲等 方法．称取 0．25 g植物材料，加液氮迅速研磨成细粉，然后转移 至 1．5 mI
Eppendorf管中，加 l ml丙酮轻轻振摇效分钟， 1 000 r／min离心效分钟，弃丙酮液 重复一
次·将 EP管放人干燥器 中真空抽干后，加 2x样品缓冲液 (0．125 mol／L Tris，pH 6 ； 10％
SDS；4％ 卢一巯基乙醇；10％甘油；0．02％ 溴酚蓝)1 ml研磨一段时间，15 000 r／rain离心 l0
min，取上清液加热 (100℃，3rain)再 12000 r／rain离心 10min取上清液．利用垂直板进行
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4期 王 艇等： 部分裸子植物叶片总蛋白分析 369
SDS—PAGE 电泳，浓缩胶浓度 12％，分离腔 5％，起始稳流 30 IliA 1 h，然后稳流 4O mA， 当
染料前沿距硅橡胶框底边 1．5 cm 时，停止电泳，关闭电源．取出凝胶板放于培养皿中，加固定液
(50％甲醇 454 ml与珠乙酸 46 ml混均 )固定过夜．然后将染色液 (O．125 g考马斯亮蓝 R 250溶
于 185 ml蒸馏水，62．5 ml异丙醇，27．5 ml珠乙酸过滤而成)倒人培养皿 中，染色 l h左右，用
蒸馏水漂洗数次，再用脱色液 (1 000 ml水溶液中含 75 ml冰乙酸和 5O m1甲醇 )脱色直至蛋白
质区带清晰．照相，并计算相对迁移率．
1．4 数据分析
参照王义弘 ¨的方法．根据肽谱之间的相似性，按各个种的肽谱计算出一组肽谱相似系数，以
此来确定对此种的肽谱相似程度，并在肽谱相似系数表示的组成差别的基础之上进行双轴系统的肽
谱排序。
2 结果
21 数据处理
数据处理的基本程序
如下：
(1)计算 各个 种蛋 白
质肽 谱 带相 似 系数(c)，
c 2w／(a+b)×100％ ．
式中，a为种 A蛋 白质
肽谱带数，b为种 B蛋白
衰2 12种材料的币相似值总和(￡)与 x c1 e【．yItcJit-ll~
Table 2 T~ SLII ofdm tmi]antyvalue and forproteinzo13~ of12materials
2 3 4 j 6 7 8 9 10 Il 12 Z
4．3 66．0 33．3 74．5 47j 47．5 46．7 69．5 74．2 74．2 75．0 585．7 31．9
65．2 3Z2 46．7 46．7 46．7 ．8 69．0 73．8 73．8 74．5 578．7 31 6
57 nO
46．2 13．9
5n3 2B．5
5n3 勰 5
50 3 2 5
521 29．5
5．5O 63．6
O 68．1
丝 ．5 lO0
5^ 3 7Z2
46 m0
5^ 2 14．3
66．0 54．2
68．O 5 9
722
46．9
仉0
Om
1^ 3
5^ 2
56
j6
45．B 66．0
I^ 3 5^ 2
1^ 3 j^ 2
1^ 3 5^ 2
56．9 56．9
56．9 j6．9
56．9 56．9
52 5
68．2 576．5
m 0 455．6
6mO 455
6m0 455．6
5^ 481．7
30．2 543．4
30．] 569 2
617 7
质肽谱带数，-．r为 A、B两种的相同谱带数．(2)
配对计算各种间的肽谱带相似系数，与计算不相
似系数 d(d=ll~-c)构成一个矩阵． (3)计算
各种肽谱带不相似值总和 z(表 2)．(4)确定各个
肽谱在x轴上的位置。 =(L．2斗D}D吾)／2L，其
中 为 所 求 种 的 肽 谱 沿 x 轴 对 不
相似值总和最大的种 A (自豆杉 )肽谱的距离，
L为种 A与种 B (鸡毛松，与种 A最不相似 )
肽谱之间的不相似值，DI为种 A与所求种肽谱
之间的不相似值，Db为种 B与所求种肽谱之间
的不相似值． c5)确定各个种的肽谱在 Y轴上的
位置。先计算出各种的肽谱在 x轴上的吻合性差
r ‘—‘= —— —’ ’一
度值(e1)ei=√D：一x yi=((L +(IY,)a-
(D b) )／2L，其中 Y．为所求种的肽谱 Y轴对
最高 ei值种 Al，(云南穗花杉)肽谱的距离，L，为种
A 与种 B (陆均松，与种 A 最不相似)肽谱之
间的不相似值，D，I为种A 与所求种肽谱之间的
不相似值， b为种 B 与所求种肽谱之间的不相似值．
20 ‘O 60 B0 Io0
图 1 12种材料蛋 白质肚谱相似程度的二维排序
FI昏 l 1h polafordi~ nfor motein
∞ ofl2materials
瑚舢；蓍
1 7 n
7 n 如
如
m m
卯 ∞ ∞
m 们 m
3 2 2 2 4 5 4 4 2 他他他 ¨
2 2 7 7 7 5 0 B 8 5 弛扼扼扼n 住住
㈣圳 ； mm
2 3 4 5 6 7 8 9
∞ ∞ ∞ ∞ ∞
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370 广 西 植 物 l9卷
各个种肽谱在两轴排序系统的位置分别由x轴和 y轴坐标表示(图 1)．
2 蛋白质肢潜
各种材料所呈现的蛋 白质谱带数 目不等，除白豆杉谱带较少外 (1i条)，其余谱带数目均较多，
其中云南榧谱带多达 36条，各谱带迁移率 (Rf值)在 0．026～0．987之间。根据蛋白质谱带的迁移
率．可将蛋白质谱带划分为 3个区段．第一区段Rf=0．026～0．282，此区段的特点是蛋白质谱带相似
性程度较高，数目较少；第二区段 Rf=0．282～0,615，此区段除白豆杉外，其余蛋白质谱带相似性程
度较高．数目较多；第三区段 Rf=0．615～0．987，此区段蛋白质谱带特点是特异性较高
3 讨论
3．1 总蛋白质的提取
从植物叶片中直接提取总蛋白质进行电泳往往会困为谱带背景过深而得不到理想的实验结果甚至
根本无法看清谱带，本实验也遇到了类似的问题。为了解决这一问题，试用了将样品加液氮研磨后分
别用丙酮、丙酮+三氯乙酸及提取液中加入 PVP进行处理，结果发现，用丙酮处理两次然后再进行提取
就能解决谱带背景过深的问题。另外，我们也对比了嫩叶与老叶的谱带，发现它们之间没有区别
1 2 红豆杉科
红豆杉科 (Taxaceae)是裸子植 1 2 3 4 S 6 7 8 9 1 0 11 12
物的一个重要科，我国有 4个属：红
豆杉 属 (Taxus)、 白豆杉属 (Pseu-
dotaxux)、 穗 花 杉 属 (Amemom—
xus)和榧树属 (Torreya)。有关白
豆杉 属 (Pseudotaxus)和 穗 花杉 属
(Amentotaxus)的系统位置一 直存
在明显的分歧。
穗花杉属是否归属红豆杉科及其
在红豆杉科内的分类等级还有争议。
穗花杉属是 Pilger根据模式种 Amen-
totax~ argotaenia(Hance)Pilger于
1916年建立 的．此种最早被作为罗
汉橙属 (Podocarpus)的一个成员，
后被移人三尖杉属，最终又独立为穗
花杉属。Pilger 根据雄球果的复
合性把穗花杉属和三尖杉属归人三尖
杉科 但是 Kudo观察雌球果后认为
它不应放在三尖杉科而应成立新穗花
杉 科 (Amentotaxa-ceae)。 而
Koidzumi(9 3认为穗花杉属和三尖杉
属有联系，主张把红豆杉科和三尖杉
科置于同一科内，两者均降至亚科地
位。Florin认为应把穗花杉属从三尖
图2红豆杉科 三尖杉科及罗汉检科部分植物的叶 总蛋白电泳图
F 2 The SDS electrophoretogram ofleave~total proteiD
of some plants ofTa Lceat Cephalotaxaceae
and Podocarpaceae
i·薯糟 2i南t花挣 3自Ⅱ牡 ‘甫 i杉 5．= 杉
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4期 王 艇等： 部分搡子植物叶片总蛋白分析 37
杉科移到红豆杉科。Keng‘LO J也认为穗花杉属放在红豆杉科比放在三尖杉科或是独立成科更好，并
且认 为红豆杉科可能是通过穗花杉属和三尖杉科相联系．席 以珍 ‘。‘ 对穗花杉 ( 删 加 圳
ⅡrgotaP^ia(Hance)Pliger)、云南穗花杉 (正 yunnanensisLi)花粉外壁的超微结构进行了研究，支持
把穗花杉属从红豆杉科分离出来建立穗花杉科。管启良等 ”¨报道了穗花杉 (正 argotaenia(Hance)
Pilger)雌株和雄株的染色体数目、核型，认为穗花杉均不同于红豆杉科其它属和三尖杉科，而接近
罗汉松科罗汉松属的某些种，赞同将穗花杉属归于罗汉松科． 由二维排序结果可知，穗花杉 (
argotaenia(Hanc~)Pilger)、云南穗花杉 (正yunnane~tfs Li)与红豆杉科其它两种植物的亲缘关系较
近，因此穗花杉属 (Amentotaxus)应置于红豆杉科 内，不支持将穗花杉属 (Amemotaxuaj独立成
科的观点。
白豆杉属 (Ps~dotaxus)是郑万均 ”¨建立的，是我国裸子植物的特有属之一 本属仅有白豆杉
(Pseudotaxus chienit(Cheng)Chen曲一种．它的胚胎发育类似于红豆杉属 ¨ 。花粉形态的研究显示
应把白豆杉由红豆杉属分离出来成为一新属，而且应将白豆杉属上升为白豆杉族 (Pseudotaxeae)和红
豆杉族并列 ¨。张君增等 “ 根据白豆杉和红豆杉属的化学成分有很大的区别，支持自豆杉属上升
为白豆杉族的观点。在二维排序图上，白豆杉一方面和红豆杉科其它三种植物聚为一类；另一方面又
与这三种植物之间有一定的距离，因而支持白豆杉是红豆杉科内一个属的观点。
3．3 三尖杉科
一 般认为三尖杉科 (Cephalotaxaceae)仅包括三尖杉属 (Cephalotaxus)一属。胡玉熹 ∞：在光
镜 与扫 描 电镜 下 比较 了三尖 杉 属植 物 叶片构 造与 叶表 面 角质层 的特征 ， 发现 篦 子三 尖 杉
(Cephalotaxusoliveri)和三尖杉属的其余种类相似特征独特，建议将三尖杉属分为三尖杉组 (S∞L
Cephalotaxus)和燕子三尖杉组 (Sect．Pectinatae)。傅立国 ¨¨对三尖杉属的分类作了订正，认为三
尖杉属宜分为篦子三尖杉组 (SocL Pectinatae)和三尖杉组 (SocL Cephatotaxus)及 9个种。对篦子
三尖杉的胚胎学研究发现它与三尖杉属的其它种相比有不少共性但是也存在明显差异，赞同将篦子三
尖杉在本属中另立一组 “ ．
席以珍 ¨¨ 对三尖杉科的花粉形态及其外壁超微结构进行了研究。支持在该属中分别成立篦子三
尖杉组 (SOCL Pectinatae)和三尖杉组 (Sect。Cephalotaxus)的意见．总蛋白肽谱表明，三尖杉 粗
榧、海南粗榧相互之间亲缘关系较近．在蛋白质水平上未能分开，但篦子三尖杉跟这三种植物亲缘关
系相对较远，支持在三尖杉科内成立篦子三尖杉组和三尖杉组．
3_4 罗汉松科
罗汉松属是罗汉松科 (Podocarlmceae)中的一个颇为引人注目的类群．罗汉松属内的竹拍类植
物因叶脉和生殖器官的构造特殊，分类地位和进化也一直存在许多争议．De Laubenfeles修订罗汉松
科时曾将竹柏类独立成属．Page确认了 Nageia属名的合法性并指出竹柏类是极 自然的类群 傅德
志 ¨进一步主张将竹柏属从罗汉松科中分离出来建立单属新科竹柏科 (Nagejaceae D．Z。Fu) 在
蛋白质二维排序图上，罗汉松 (Podocarpusmacrophyllus)、鸡毛松 (Podocarp“ imbricⅡt“ ) 竹柏
(Podocarp~*nagi)三种植物亲缘关系相对较近，而陆均松与罗汉松科其它植物亲缘关系较远，这一
方面说明陆均松属是一个 自然类群，支持在罗汉松科内成立陆均松属，另一方面则不支持将竹柏屑从
罗汉橙科中分离出来建立单属新科。
i 5 红豆杉科．三尖杉科及罗汉松科之间的关系
红豆杉科、三尖杉科及罗汉橙科是研究操子植物系统发育的焦点之一．红豆杉科．三尖杉科及罗
汉松科是一个特殊类群。本世纪初Pilger根据这些类群具包裹种子的肉质结构和极为减化的珠鳞，把
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372 广 西 植 物 19卷
三尖杉科和罗汉松科包括在红豆杉科内。Neger认为三尖杉属的雌球花极为特殊，与红豆杉科区别显
著，首次建立三尖杉科，只包括三失杉属。Takhtajan认为红豆杉科、三尖杉科及罗汉松科之间的关
系密切．它们共同置于松杉目内。郑万均 13)在 《中国植劫志》中把三尖杉科置于红豆杉科和罗汉松
科之间，共属于松杉纲．
由二维排序结果可知，12种材料按科聚为三大类群，即红豆杉科、三尖杉科及罗汉松科三科之
间蛋白质谱带有较明显的区别，而科内各材料之间蛋白质谱带相似性程度较高。说明红豆杉科，三尖
杉科和罗汉捂科是 自然类群，并且，三尖杉科与红豆杉科 罗汉松科之间亲缘关系较后两科之间亲缘
关系近，支持郑万均 ”¨等将三尖杉科置于红豆杉科、罗汉松科之间。
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