全 文 ：武汉植物学研究 2001, 19( 1) : 67～72
Journal of Wuhan Botanical Research
外源基因在转基因油菜染色体上的定位及分析
刘　勇　李学宝　陈光荣
(华中师范大学生命科学学院, 武汉　430079)
Localization of CryIA( c) Transgene on Chromosomes in
Transgenic Oilseed Progeny by in situ Hybridization
LIU Yong, LI Xue-Bao , CHEN Guang-Rong
( Col leg e of L if e S ciences, Central China Normal Univ er sity, Wuhan　430079, Chin a)
关键词: 转基因油菜; 基因定位; 原位杂交
Key words: T r ansgenic oilseed plants; Gene localization; I n situ hybr idization
中图分类号: Q789　文献标识码: A　文章编号: 1000-470X ( 2001) 01-0067-06
原位杂交技术 ( in situ hybridizat ion, ISH )是基因定位的主要技术之一。近来,随着植
物细胞染色体制片技术的发展, 以及酶联放大检测系统的采用,在植物中已有低拷贝和单
拷贝甚至小于 1 kb的 DNA 序列定位的成功报道[ 1, 2]。染色体原位杂交技术不仅可以用于
基因的物理作图, 而且可以用来对转基因植物中的外源基因进行染色体定位 [ 3 5]。研究表
明,外源目的基因在转基因植物中的表达与整合位点有关 [ 6]。因而,进行外源基因在转基
因植物染色体上的定位以及研究外源基因的整合位点与表达之间的关系,对于开发和利
用转基因植物具有重要意义。
害虫是造成农业减产的主要原因之一。据不完全统计,全世界每年因虫害引起的作物
减产达总产量的 15% ,损失高达数千亿美元。因而, 获得抗虫品种已成为作物育种中的一
项十分紧迫的任务。植物基因工程技术的发展为防治害虫开辟了一条新的途径。苏云金
杆菌杀虫蛋白( Bacillus thuringiensis insect icidal cry stal pro tein)基因是使用最广泛的抗
虫基因,我们经多年研究已成功地将杀虫蛋白基因导入油菜中并获得了可育的转基因油
菜[ 7, 8]。本文报道了应用染色体原位杂交技术对 Cry IA ( c)基因在转基因油菜染色体上定
位的结果,为进一步研究 Cr yIA( c) 基因在转基因油菜中的整合位点与表达之间的关系
打下了基础。
收稿日期: 1999-10-26,修回日期: 2000-09-01。
基金项目:国家自然科学基金资助项目(编号: 39670389)。
作者简介:刘勇( 1970- ) ,男,讲师(硕士) ,主要从事植物分子遗传学研究。
1　材料与方法
1. 1　植物材料
实验用植物材料为 2个油菜品种及其转基因的后代株系,这 2个油菜品种是:中双 4
号 (属甘蓝型油菜,转基因后代株系为 T 3 代, 编号为: 甘 14-3)和望江凉亭(属芥菜型油
菜,转基因后代株系为 T 4代, 编号为:芥 2-1)。
1. 2　方法
1. 2. 1　染色体制备　取长至 1～2 cm 的油菜根尖, 用饱和
-溴萘在 25℃下处理 1. 5～
2 h,再用甲醇∶冰醋酸( 3∶1)固定 2 h以上, 水洗后用 1 mol / L HCl于 25℃酸解 30 min,
充分水洗后, 用 4%纤维素酶和 4%果胶酶等体积混合液 25℃酶解处理 20～30 min,火焰
干燥法制片。
1. 2. 2　探针标记　根据华美生物工程公司缺口平移试剂盒产品说明,采用一步法略作修
改: 10 L dNT P 混合液, 5 L 10×缓冲液, 5 L 探针 DNA (含 0. 7 kb CryIA( c)基因探
针) , 3 L Bio-11-dU T P, 22 L 水, 5 L 酶液( DNase/ DNA polymerase)混匀, 15℃反应
2. 5 h后, 加 5 L 0. 5 mo l/ L EDTA -Na2终止反应, 用 Sepharo re CL-6B 凝胶离心柱纯
化,斑点印迹检测其标记效果。
1. 2. 3　原位杂交及检测　参照 Gustafson 和Dill
[ 1]的方法, 略有改进。杂交液包含 25 L
探针, 62. 5 L 去离子甲酰胺, 25 L 硫酸葡聚糖, 12. 5 L 20×SSC 和 1. 25 L ssDNA,
100℃变性。染色体制片在 60℃下烤片 1 h, 37℃下用 RNase( 1 g/ mL)处理 1 h, 70℃下
在 70%甲酰胺中变性 3. 5 m in, 后经- 20℃ 70%、95%和 100%酒精系列洗涤, 37℃杂交
过夜。检测时首先用 42℃ 10%去离子甲酰胺、2×SSC 和 0. 1×SSC 系列浸洗, 室温下
0. 1% Triton 100 浸洗。依次加羊抗生物素抗体,兔抗羊抗体生物素偶联物和 SA-HRP
37℃下各反应30 min, 室温下DA B显色 5 min, 1% Giemsa染色5 min, 充分干燥后,用二
甲苯透明,树胶封片。
1. 2. 4　杂交信号观察及统计分析　使用 Olympus BH-2 相差显微镜观察杂交结果,依据
染色体的相对长度和臂比进行不同染色体的识别。选择信号清晰、染色体形态好的分裂相
进行显微摄影。通过装配在图象转化装置上的电视荧光屏进行臂比及杂交位点与着丝粒
距离的测量, 并进行统计分析。
1. 2. 5　卡那霉素抗性实验　以 MS为基本培养基,附加 0. 1 mg/ L NAA, 配置不同浓度
的卡那霉素。待无菌苗长至 1. 5～2 cm 高, 切去根部,留下胚轴长 1 cm,在上述含不同浓
度培养基中继代培养,每 15～20 d继代一次,分别统计各供试植株在该浓度下的生根苗
数和未生根苗数, 计算生根率。重复实验,每次继代丢去未生根及已经白化的植株,直至全
部起始供试去根幼苗均不能生根或白化为止。
2　结果
2. 1　油菜染色体核型分析
取用油菜(中双4号和望江凉亭)的根尖细胞制备染色体,改良苯酚品红染色。参照李
懋学等 [ 9]的标准进行核型分析。2种油菜的核型见图版Ⅰ: 1～4,各号染色体的核型指标
的平均值见表 1。
68 武汉 植 物学 研究　　　　　　　　　　　　　　　第 19卷　　
表 1　甘蓝型和芥菜型油菜染色体相对长度、臂比和类型
T able 1　The chromosomes r elat ive lengt h, arm rat io and classification o f Brassica nap us and B . j uncea
序号
No.
甘蓝型油菜相对长度( % )
Relat ive length
臂比
Arm
rat io
类型
Class if ication
序号
No.
芥菜型油菜相对长度( % )
Relat ive length
臂比
Arm
rat io
类型
Class ificat ion
1 5. 10+ 2. 55= 7. 65 2. 00 sm 1 4. 86+ 2. 71= 7. 57 1. 79 sm
2 5. 10+ 2. 04= 7. 14 2. 50 sm 2 4. 32+ 2. 71= 7. 03 1. 59 m
3 4. 08+ 2. 76= 6. 84 1. 48 m 3 4. 05+ 2. 71= 6. 76 1. 49 m
4 4. 08+ 2. 55= 6. 63 1. 60 m 4 3. 91+ 2. 71= 6. 62 1. 44 m
5 3. 89+ 2. 44= 6. 33 1. 59 m 5 3. 38+ 3. 11= 6. 49 1. 09 m
6 3. 57+ 2. 55= 6. 12 1. 40 m 6 4. 59+ 1. 76= 6. 35 2. 61 　sm*
7 3. 78+ 2. 04= 5. 82 1. 85 sm 7 4. 05+ 2. 17= 6. 22 1. 87 sm
8 3. 57+ 2. 04= 5. 61 1. 75 sm 8 3. 38+ 2. 70= 6. 08 1. 25 m
9 3. 87+ 1. 53= 5. 40 2. 53 sm 9 3. 24+ 2. 71= 5. 95 1. 20 m
10 3. 06+ 2. 14= 5. 20 1. 43 m 10 2. 97+ 2. 71= 5. 68 1. 10 m
11 3. 06+ 2. 04= 5. 10 1. 50 m 11 3. 11+ 2. 03= 5. 14 1. 53 m
12 2. 96+ 2. 04= 5. 00 1. 45 m 12 2. 57+ 2. 31= 4. 88 1. 11 m
13 3. 07+ 1. 73= 4. 80 1. 77 sm 13 2. 70+ 2. 03= 4. 73 1. 33 m
14 2. 55+ 1. 53= 4. 08 1. 67 m 14 2. 84+ 1. 75= 4. 59 1. 62 m
15 2. 04+ 1. 94= 3. 98 1. 05 m 15 3. 51+ 0. 68= 4. 19 5. 16 st
16 2. 05+ 1. 73= 3. 78 1. 18 m 16 3. 24+ 0. 68= 3. 92 4. 76 st
17 2. 14+ 1. 43= 3. 57 1. 50 m 17 2. 70+ 1. 08= 3. 78 2. 50 sm
18 2. 25+ 1. 02= 3. 27 2. 21 sm 18 2. 30+ 1. 35= 3. 65 1. 70 m
19 1. 53+ 1. 53= 3. 06 1. 00 M
核型类型
Karyotype
2B
核型类型
Karyotype
2B
　　* 具随体染色体,随体长度未计算在内。
* SAT -chromosom e, the length of s atellit es was not inclu ded in the ch romosome length .
2. 2　转基因油菜的染色体原位杂交
用生物素标记的 Cry IA ( c)基因探针进行原位杂交,结果表明, 在甘 14-3株系中, 观
察了 206个分裂相细胞, 82个具有杂交信号,检出率为 39. 81%; 在芥 2-1株系中观察了
179个分裂相细胞, 69个具有杂交信号,检出率为38. 54%(图版 I: 5, 6;表 2)。在同时进行
的对照组油菜分裂相细胞中,没有检测到杂交信号(图版 I: 7, 8)。
表 2　转基因油菜原位杂交统计分析
Table 2　Assay o f in situ hybr idization in tr ansgenic Brassica nap us and B . j uncea plants
转基因油菜株系*
Trans form ant
染色体
Chromosome
信号距着丝点百分距离
Percent dis tance f rom
the cent romere
观测细胞总数
T he number of
cell s observed
检出信号细胞数
T he num ber of
cell s wi th s ingal
检出率( % )
Detect ion rate
甘 14-3 1 22. 22±1. 12** 206 82 39. 81
芥 2-1 7 80. 00±3. 28 179 69 38. 54
　　* 甘 14-3: T 3 代转基因甘蓝型油菜;芥 2-1: T 4 代转基因芥菜型油菜; * * 标准差。
　　* T he thi rd generat ion of t ransgenic Br assic a napus plant , the fourth generat ion of t ransgenic B . j uncea plant ;
　　** Standard deviat ion.
通过核型分析,以染色体长度、臂比、着丝点位置确定杂交信号的位置。在 Olympus
BH-2相差显微镜下, 观察到的杂交信号总是出现在转基因油菜甘 14-3有丝分裂相中第
1号染色体长臂和芥 2-1有丝分裂相中第 7号染色体短臂(图版 I: 5, 6)。它们与着丝粒的
69　第 1期　　　　　　　　　　　　　　刘 勇等:外源基因在转基因油菜染色体上的定位及分析
百分距离分别为 22. 22±1. 12和 80. 00±3. 28(表 2)。
2. 3　转基因油菜后代株系的卡那霉素抗性分析
以培养 1周左右的转基因油菜后代株系的去根幼苗为材料, 对 4个株系的转基因油
菜后代植株进行了 Km 抗性试验,其中 3个为芥菜型油菜株系, 1 个为甘蓝型油菜株系,
结果列于表 3。
表 3　转基因甘蓝型油菜和芥菜型油菜后代卡那霉素抗性分析
T able 3　Analysis o f tr ansgenic Brassica nap us and B . j uncea progenies r esist ant to kanamycin
卡那霉素浓度
Km concent rat ion
芥 2-1* 芥 2-2 芥 9-5 芥 CK 甘 14-3 甘CK
15 m g/ L
20 m g/ L
30 m g/ L
50 m g/ L
总苗数　　
生根苗数　
未生根苗数
生根率( % )
总苗数　　
生根苗数　
未生根苗数
生根率( % )
总苗数　　
生根苗数　
未生根苗数
生根率( % )
总苗数　　
生根苗数　
未生根苗数
生根率( % )
97 125 229 70 102 52
97 125 229 0 102 0
0 0 0 70 0 52
100 100 100 0 100 0
97 125 229 102
71 123 192 67
26 2 37 35
73. 2 98. 4 83. 8 65. 7
60 93 172 60
39 64 101 40
21 29 71 20
65. 0 68. 8 58. 7 66. 7
39 55 71 24
2 7 6 1
37 48 65 23
5. 1 12. 7 8. 5 4. 2
　　* 试验用转基因油菜芥 2-1、2-2、9-5为 T4 代,甘 14-3为 T3 代。
* T he t rans gen ic B rassia j unc ia plants 2-1, 2-2, 9-5 w ere at the fou rth gener at ion of t rans formed p lan ts ; th e
t ransgenic Br assia nap us plant 14-3 w as at the th ird g enerat ion.
实验结果表明,在卡那霉素浓度为 15 mg/ L 时, 芥 2-1、芥 2-2、芥 9-5和甘 14-3株系
的生根率为 100% ;随着 Km 浓度的升高, 4个转基因油菜株系的生根能力随之下降。但在
各供试株系中,生根率存在着显著差异。其中,芥2-2生根率最高,其余依次为芥 2-1, 芥9-
5, 甘 14-3。对照组试验中,未转化油菜切除根的幼苗生根能力在 Km 浓度为 15 mg / L 时
即被完全抑制。
3　讨论
目前对于 T-DNA 介导的外源基因与植物核 DNA 的整合机制还没有完全明了。大量
的研究表明,在 T i质粒介导的植物遗传转化中,外源基因是以非正常重组的方式整合到
植物染色体上的,整合位点并不固定而是随机地插入整个基因组中[ 3, 5, 10 12] ; 但有研究认
为,在整合过程中外源基因优先插入到转录活跃区[ 13]。外源基因主要以单拷贝或呈串连
的多拷贝在单一位点整合[ 4, 5, 10 12] ,也有在同一染色体或不同染色体的多个位点上的整合
情况发生[ 10, 14] ;整合到植物染色体上的外源基因非常稳定 [ 4, 11, 12]。我们用生物素标记的
CryIA ( c)基因作探针,对 2个转 CryIA( c)基因油菜的后代株系芥 2-1( T 4代)和甘 14-3
( T 3代)中的外源基因进行了染色体原位杂交定位。结果在 2个株系的不同染色体上都检
70 武汉 植 物学 研究　　　　　　　　　　　　　　　第 19卷　　
测到了杂交信号, 表明外源杀虫基因不但已整合到油菜的核基因组中,而且还可以稳定地
遗传给后代。在同时进行的对照实验中,没有检测到杂交信号,表明正常油菜基因组中没
有该基因,杂交信号是由于外源 CryIA( c)基因整合到油菜染色体上所导致的结果。
外源目的基因在转基因植物中的稳定表达,是转基因植物研究中的关键问题。研究显
示[ 15 17] , 在转基因植物中, 外源基因以多拷贝形式插入常导致基因表达失活,而单拷贝插
入的基因表达一般不会受到抑制。引起多拷贝插入的基因表达失活的原因, 一般认为是:

多拷贝的重复序列之间异位配对抑制基因转录;  重复序列中的一个插入基因以反式
作用的沉默子方式抑制其他插入基因的表达。本试验所用的转基因油菜,分子杂交结果证
明,外源基因以单拷贝插入到油菜基因组[ 7, 8]。我们对 T 4代转基因油菜芥 2-1、芥 2-2、芥
9-5和 T 3代甘 14-3植株的后代株系 Km 抗性试验表明(表 3) ,外源基因在转基因油菜后
代植株中能稳定地表达。同时, 有研究显示,外源基因的表达与插入位点之间存在着位置
效应[ 18] , 但其确切的原因却未完全研究清楚。我们比较分析了各供试株系的 Km 抗性强
度(表 3) ,其中芥 2-2株系的 Km 抗性最高, 其余各株系的 Km 抗性大小依次为芥 2-1、
芥 9-5、甘 14-3。各株系的 Km 抗性存在着明显的差异,表明外源基因的表达可能与基因
插入位点不同有关。
致谢: 在进行油菜染色体原位杂交实验中,得到武汉大学生命科学学院宋运淳先生、刘立华先生等
的技术指导和支持, 在此表示真诚的感谢!
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图　版　说　明
图版Ⅰ: 1.甘蓝型油菜中期分裂相; 2.芥菜型油菜中期分裂相; 3.甘蓝型油菜染色体核型分析图; 4.芥菜型油菜染色
体核型分析图; 5. Cr yIA (c)基因探针与甘 14-3株系原位杂交结果,箭头示杂交信号; 6. Cr yIA ( c)基因探针与芥 2-1
株系原位杂交结果,箭头示杂交信号; 7. CryIA( c)基因与对照甘蓝型油菜原位杂交结果; 8. C ryIA ( c) 基因与对照芥
菜型油菜原位杂交结果
Explanation of plate
Plate Ⅰ: 1. Metaphase chromosomes in Br assia nap us; 2. Metaphase ch romosomes in Br assia j uncia; 3. Karyotype
an alysis of Br assia nap us; 4. Karyotype analysis of B rassia j uncia; 5. M etaphase chromosom es in tr ans form ant 14-3
sh ow ing a hybridizat ion s ite w ith p robe CryIA( c) , the signal is in dicated b y arr ow ; 6. Metaph ase chromosomes in
t ran sforman t 2-1 show ing a hybridiz at ion s ite w ith probe CryIA ( c) , the signal is indicated by arrow ; 7. in situ hy-
bridizat ion of wild-type Br assia nap us using CryIA( c) gene as the pr ob e; 8. in situ hybridizat ion of w ild -type Brassia
j uncea us ing C ryIA (c) g ene as the probe
72 武汉 植 物学 研究　　　　　　　　　　　　　　　第 19卷