全 文 ：第 4 期
N o
.
4 A C T A
地 学 报
A G R E S T IA S IN IC A
1 9 9 9 年
D e e
.
1 2 月
1 9 9 9
几种小麦族禾草及其杂交后代
基因组 D N A 的 R A PD 研究 ‘
于 卓 云锦凤 马有志 , 辛志勇‘
(内蒙古农业大学 , 呼和浩特 0 1 0 0 1 9)
(
‘中国农业科学院作物育种栽培研究所 , 北京 1 0 08 1)
摘要 : 应用随机扩增多态性 D N A (R A PD )技术分析蒙古冰草 、航道冰草及其种间杂种 F : 、
BC , 代和加拿大披碱草 、野大麦及其属间杂种 F l 代的基因组 D N A 差异性 。 筛选出能检测各亲
本及杂交后代间遗传差异的适宜引物 ;从 D N A 分子水平验证出亲本加拿大披碱草和野大麦两
属间种比亲本蒙古冰草 、航道冰草二种间的亲缘关系远 ;杂种 F , 代的 R A PD 图谱有明显偏母本
的倾向 ; 随机扩增多态性 D N A 技术可用于牧草远缘杂种鉴定及遗传育种研究 。
关键词 : 小麦族禾草 ; 杂交种 ; 基因组 D N A ; 随机扩增多态性 D N A ; 适宜引物
1 引言
随机扩增多态性 D N A (R A PD ) (R a n d o m A m p lifie d Po ly m o p h ic D N A )是利用 D N A 聚
合酶链式反应 (P C R )和随机核酸单引物 , 检测 D N A 核酸序列多态性的一种分子标记新 技
术(w il ia m 、 等 , 1 9 90 ) 。 R A PD 技术具有程序简单 、 D N A 用量极少 、检测位点多 、 D N A 多态
性高 、成本较低等优点 (陈建莉等 , 1 9 9 6) , 在植物育种特别是玉米 、小麦 、大麦 、水稻 、燕麦 、黑
麦 、豆类等作物育种改 良中的应用研究 已取得新进展 , 可用于植物的基因作图和辅助选择
(T h or m a n n 等 , 1 9 94 ) 、系统发育和遗传变异分析 (金谷整一等 , 1 9 9 7 ) 、 品种和杂种纯度鉴定
(川田元滋 , 1 9 9 5 ) 、外源基因渐渗检测 (W illiam s 等 , 1 9 9 3 ) 、种质资源筛选 (件羲之 , 1 9 9 7 )以
及数量性状位点 (Q T L S )识别 (S k r o e h , 1 9 9 5 )等方面 。
目前 R A PD 技术在牧草上的应用研究较少 (张继益等 , 1 9 9 7 ; Br o m m e r , 1 9 9 5 ) 。 本试验
以几种小麦族多年生禾草及其杂交后代为材料 , 在 已报道的同工酶蛋 白质水平研究基础上
(于卓等 , 1 9 9 9 ) , 对其进行 R A P D 比较研究 , 旨在进一步从基因组 (G en o m e )D N A 水平上分
析亲本及杂交后代间的遗传差异性和相似性 , 探讨 R A PD 技术在牧草远缘杂种鉴定及其在
遗传育种方面应用的可行性 。
2 材料和方法
2
.
1 供试材料
早蒙 古 冰 草 (八g r口p少ro n m o n g o zic u m K e n g . ) 、 大航 道 冰 草 (A g 21〕py ro n c r is ta t u m
G a e rt n
.
C v
.
Fa ir w a y )及其种间杂种 F , 、 BC , 代〔(蒙古冰草 x 航道冰草 ) x 蒙古冰草〕、早加拿
大披碱草 (E ly m u s c a n a d e , 5 15 L . ) 、 士野大麦 (H o rd e u m bre v is u b u la t u m L in k . )及其属间杂
‘ 国家自然科学基金和农业部作物遗传育种重点实验室开 发性课题基金资助
草 地 学 报 1 9 9 9 年
种 F I 代 。
试验于 1 9 9 8 年 9一 10 月在中国农业科学院作物育种栽培研究所“农业部作物遗传育种
重点实验室 ”进行 。
2
.
2 D N A 的提取
参照 D e vo s 等 (1 9 9 2) 改进的酚一氯仿法 。 取供试植物再生 l 周的嫩 叶 59 (亲本按群体
随机取样 , F , 、 B C , 各取 5 个株系的混合样 )提取 D N A 。 用 D U 一 64 0 核酸蛋 白检测仪 (B ec m an
In C
.
)测定样品的 D N A 浓度 。 取少量样品在 0 . 8 %A ga ro se 凝胶电泳上检测 D N A 纯度 。 将
纯度符合 R A PD 分析要求的材料 D N A 置于一 20 C 冰箱中保存备用 。
2
.
3 R A PD 分析
扩增反应在 9 6 0 0 一PC R 仪 (Pe r k in E lm e r In 。 . )进行 。
2
.
3
.
1 反应液 总体积 2 5 u l。 反应液 组成 : lom m o l/ L T r is 一H C I pH S . 3 , som m o l/ L K C I ,
2
.
o m m o l/ L M g e l
Z , 4 种 dN T p (d A T p 、 d CT p 、 d G T p 、 dT T p )各 0 . lm m o l/ L , 引物 1 5 n g ( 1 0
个核昔酸 , O p e r o n In e . ) , 模板 D N A Zo n g , T a p 酶 IU (p r o m a g e In e . ) , d dH ZO Z 。
2
.
3
.
2 反应程序 9 4 C预变性 lm in , 每个循环 9 5 C 变性 1 5 s e e , 3 7 ‘C复性 4 5 s e e , 7 2 ‘C 延伸
lm in
,
4 5 个循环 , 最后 7 2 C 延伸 sm in , 4 ‘C停止待测 。
2
.
3
.
3 扩增产物用 1 . 5 %A g a r o s e 凝胶电泳分离 , 用 PC R M a r ke r 和 入D N A / H in d l +
E e o R I 作分子量标记 (M a r k e r ) , 并设负对照 (用 d d H ZO : 代替模板 D N A 同时电泳 , 以排除
因操作等污染对 R A PD 结果的影响 ) 。
2
.
3
.
4 分离的 D N A 片段经 E B 染色后 , 用 Bi 。 一R A D G el D oc 一1 0 0 0 电脑扫描仪旧 本岛津 )
观察 , 热敏打印输 出结果 。
2
.
4 数据统计
参照刘少林等 (1 9 9 6) 提出的方法 , 记录材料扩增的 D N A 总带 (片段 )数以及与其他材
料相对迁移率 (D N A 片段电泳迁移距离与指示剂澳酚兰移动距离之比 )一致的带数 , 此共 同
带数相对于两个比较材料平均总带数的百分比为两个材料间的带型相似率 (% ) 。相似率大 ,
表明材料间 D N A 同源性区段多 , 遗传差异小 , 反之 , 则遗传差异大 。
3 结果与分析
本试验从 O Pe ro 介F 系列 20 个随机引物中筛选出重复性好 、适于供试植物基因组 D N A
扩增引物 (见表 1 ) 。 不同材料用不同引物扩增结果分析如下 。
3
.
1 蒙古冰草和航道冰草及其杂种 F , 、 BC , 基 因组 D N A 扩增结果
3
.
1
.
1 蒙古冰草 、 航道 冰草及其杂种 F l 、 BC I 代的基 因组 D N A 分别用引物 OPF06 、
O PF o 7
、
O PF o歇O PF 1 3 扩增 出稳定 、清晰的 R A P D 带型 , 供试材料 4 个引物扩增 的 D N A
总带数在 15 ~ 18 之间 , 引物带数变化幅度为 2一 7 , 平均每引物的带数范围为 3 . 8~ 4 . 5 , 四
种材料合计扩增带数 6 5 , 所有 D N A 片段长度 (分子量 )约为 20 0 ~ 1 7 o o b p 。 同一种材料不 同
引物扩增的 D N A 片段数 目、分子量大小 、位置和带宽窄等各异 。 不同材料同一引物扩增的
D N A 片段数 目、大小及位置等亦均存在明显差异 , 充分显示四种材料基因组 D N A 呈多态
性 (见图 1 、表 2 ) 。
3
.
1
.
2 分析表 3 的数据可知 , 亲本蒙古冰草和航道冰草间的 R A PD 带型相似率为 51 . 4 % ,
第 4 期 于 卓等 : 几种小麦族禾草及其杂交后代基因组 D N A 的 R A PD 研究 2 8 9
表 1 适宜引物及碱基序列
T a b le 1 A p p r o p r ia te p rim e r a n d n u e le o tid e s e q u e n e e o f te s te d m a t e r ia ls
蒙古冰草、航道冰草及其杂种 F , 、B CI
A
. 爪。刀 g o lie u 刀函 , Fa ir w a y a n d the ir F l hy b r id a n d B C
引物 碱基序列
P r im
e r s N u ele o t id e s e q u e n e e
()PF 0 6 5
,
G G G A A T T CG G 3
‘
O PF 0 7 5
,
CC G A T A T CCC 3
‘
() PF 0 3 5
,
CC T G A T CA CC 3
‘
()PF 1 3 5
‘
G G C T G C AG A A 3
‘
加拿大披碱草 、野大麦及其杂种 Fl
E
.
c a n a
de
n s is ,万 . bre v is u b ula tu m a n d th e ir 下 2 hy b r id
引物 碱基序flJ
P r irn e
r s
N u e le o t id e s e Pu e n e e
()PFZO S
,
G G T CT A G A G G 3
‘
O PFO5 5
‘
CCG A A T T CC C 3
‘
O PF 0 8 5
‘
G G G A T A T C G G 3
,
O PF 1 4 5
‘
T G CT G CA G G T 3
,
表 2 基因组 D N A 扩增带数
T a ble 2 S t a tis tie r e s u lts o f a m p lified g e n o m ie D N A fr a g m e n t s o f te s te d m a te r ria ls
统计项目
Ite m s
总带数
蒙古冰草 航道冰草 种间杂种 Fl
A
. n , o , g ol ic
u m F a irw a y In te r s pe e i
e s
hy br id
17 l8 1 5
B C
I
BC
l
1 5
加拿大披碱草 野大麦
E
. ‘a ”a d e n s is H
.
bre v i
su
b
u
la t
u m In t
属间杂种Fl
e rg e n e r a hyb
r
id
30 2 5 2 9
问7.3
T o t a lD N A fr a g m e n t
s
带数变幅
R a n g e o f D N A fr a g m e n ts
引物的平均带数
A
v e r a g e D N A fr a g m e n ts
D N A 片段长度 (b p )
D N A fr a g m e n t
s s
iz e (bp )
3~ 6 2 ~ 7 5 ~ 11 3 ~ 10
6
.
3
30 0 ~ 17 00 20 0~ 16 ()0 30 0~ 1 70 0 3 00 ~ 1 60 0 40 0 ~ 37 00 30 0 ~ 3 70 0 25 0~ 3 70 0
图 l 蒙古冰草和航道冰草及其种间杂种 F , 、 Bc , 的 R A PD 图谱
F ig
.
1 R A P D p r o file s o f th e A
.
m o n g o lic u m
,
Fa irw a y a n d th e ir F , h y b rid a n d b a e ke r o s s l(BC
,
)
泳道 l ~ 4 为引物 〔)PF o 6 . 5 ~ 8 为 ()PF o 7 , 9一 x Z 为 ()PF o 3 , 1 3一 1 6 为 O PF 1 3 ; l 、 5 、 9 、 1 3 为早蒙古冰草 ; 2 、 6 、 1 0 、 1 4
为 大航道冰草 ; 3 、 7 、 1 1 、 1 5 为种间杂种 F , ; 4 、 8 、 1 2 、 1 6 为 现 l ; M 为 入D N A / H in d 班 + E e o R I分子量 M a r k e r , M I 为 PCR
M
a r k e r
,
N 为 负对照 。
1一 4 : I〕r im o r 〔)PF o 6 ; 5 ~ 8 : O PF o 7 ; 9 ~ 12 : ()PF o 3 ; 23 一 1 6 : O PF 1 3 . l , 5 , 9 , 1 3 : 早八 . m o n即 zic u n : ; 2 , 6 , 1 0 , 1 4 : 舍F air-
w a y ; 3 , 7 , 1 ]
, 1 5 : F , hy b
r id ; 4
,
8
, 12 . 1 6
:
B C
I .
M
:
S iz e m a
r
k e
r o f 入D N A / H in d 班 + E e o R I , M l : PC R m a r k e r , N : N e g a t iv e
e
k
.

第 4 期 于 卓等 : 几种小麦族禾草及其杂交后代基因组 D N A 的 R A PD 研究
但未扩增 出可见的 D N A 带谱 , 证明以上受试材料所得结果具有可比性和可靠性 。
表 3 基因组 D N A 扩增带型相似率比较
T a b le 3 G e n o m ie D N A R A PD p r o file s im ila rity r a te o f te s te d m a t e ria ls
统计项 目 蒙古冰草 蒙古冰草 航道冰草 早F l 蒙古冰草 加拿大披碱 加拿大 野大麦
一航道冰草 一F, 一F l 一BC I 一BC I 草一野大麦 披碱草一F I 一Fl
It e m s 八. , o , gol 介u 川 八
. 勿。, gol ic
u m Fa irw ay 早F l A . 。朋gol ic u 用 ￡. ca : a de : 5 1、 E . ca , a 己e n s; 、 刀 . 今二is u -
and Fa ir w ay a n d its F z a n d its Fz a n d BC
z a n d BC
I a n d H
.
brev i
su 一 a n d it
s
F z b
u la tu m a n d
b u la t u加 it s Fl
共同带数 9 12 10 互 不一一一一甲万一一~一飞万一一 - - 不厂一
Sa m e D N A fra g m e n t s
平均总带数 17 . 5 16 1 6 . 5 15 1 6 2 7 . 5 2 9 . 5 22
A
v e r a g e to ta l DN A
fr a g m e n t
s
相似率(% ) 5 1 . 4 75 . 0 6 0 . 6 6 0 . 0 68 . 8 4 3 . 6 74 . 6 44 . 4
D N A fr a g m e n t
s im ila r ity
r a te (% )
4 讨论与结论
4
.
1 植物育种的基础是遗传变异 。传统的育种方式主要集中在从分离群体后代中进行优化
选择 , 而选择则是建立在表现型基础之上的 。尽管应用现代遗传学和统计学方法能减少环境
效应对于性状的干扰 , 但是环境对性状的影响是十分复杂而难于避免的 。 D N A 是生物遗传
信息的贮存库 , 即生物的一切遗传性状都是由 D N A 携带的遗传信息所决定 , D N A 序列上
的差异可以反映出不同受试材料之间的遗传差异 。 本研究应用 R A PD 技术对几种小麦族多
年生禾草及其杂交后代的 D N A 多态性进行分析 , 通过不同引物与模板 D N A 结合 , 比较所
扩增的 D N A 片段差异 , 进而确定亲本间及其与杂交后代间的遗传差异性和相似性程序 。 试
验结果表明 , 加拿大披碱草和野大麦两亲本间的 R A PD 带型相似率较蒙古冰草和航道冰草
两亲本间大 7 . 8 % , 即属间种的遗传差异 比种间大 , 其亲缘关系较种间远 , 验证了这四种小
麦族禾草传统形态学分类和染色体组分类是正确的 。
4
.
2 从 O Pe ro n 一F 系列 20 个引物中筛选出适于蒙古冰草 、航道冰草及其种间杂种 F , 和
BC
, 代的扩增引物为 O PF o 6 、O PF o 7 、O PF o 3 、O PF 1 3 。 适于加拿大披碱草 、野大麦及其属间
杂种 F l 的扩增引物为 O PF Zo 、O PFo s 、O PF os 、O PF 1 4 。 依据 R A PD 带型相似率大小分析得
出 , 种间及属间杂种 F , 代的 D N A 带型均有明显偏母本遗传的趋势 , BC , 代的 D N A 带型略
偏向其回交 舍蒙古冰草 。
4
.
3 R A PD 作为分子标记 , 能直观地反映出亲本及杂交后代间的遗传差异 , 因而该技术在
牧草远缘杂种鉴定 、杂种回交后育性恢复状况的分析及其后代群体中目标性状植株的检测
等方面均有实际应用价值 。
参 考 文 献
1 于卓 、云锦凤 , 1 9 9 9 . 小麦族内几种远缘禾草及其杂种过氧化物酶同工酶分析 . 中国草地 , (2 ) : 7 ~ 10
2 刘少林 、靖深蓉 、郭立平等 , 19 6 . 棉花线粒体基因组和叶绿体基因组与细胞质雄性不育 (MS) 关系的
R AP D 研究 . 见 : 作物雄性不育与杂种优势研究进展 ( I ) . 北京 :中国农业出版社 , 149 ~ 154
2 9 2 草 地 学 报 1 9 9 9 年
3 陈建莉 、 R ie h a r d , R . C . W a n g 、薛秀庄等 , 1 9 9 6 . 用 IJ a n g d o n 二体代换系统建立小麦染色体 R A p D 标记 .
遗传学报 , 2 3 (1 )3 2一 3 8
4 张继益 、董玉深 , 1 9 9 7 . 小麦族旱麦草属植物的 R A PD 研究初报 . 河北农业大学学报 , 2 。(3 ) : 27 一 32
5 川四元滋 , 1 9 5 . R A PD 分析忆 上乙 卜巾毛 口 口 夕 (z ea 二ay 、)自殖系统刃多型分析. 日草志 , 41 (3) : 2 51
~ 2 5 5
6 件羲之 , 1 9 9 7 . 桓苗含的 匕乙最近的技衍阴癸勤向一R A P D 分析 含用、、九品幢澈别 . 震林水座技街研究少
个 一于少卜 , 2 0 (6 ) : 3 5一 4 4
7 金 谷整一 、渡进敦史 、 白石逸 , 1 9 9 7 . R A PD ? 一力 一含用 协赴九洲 忆分布寸乙冲 夕厂 夕 (材七lia az ed a rc h)
内遣傅燮异刃解析 . 九洲大攀曹演林报告 , 76 : 1一 19
8 B r o m m e r E C
,
1 9 9 5
.
A n a lys is o f a n n u a lM七d ic a g o s p e e ie s u s in g R A PD m a r ke r s . G e n o m e , 3 8 : 3 6 2~ 3 6 7
9 D e v o s K M
,
G a le M D
,
l9 9 2
.
T he u s e o f r a n d o m a m p lifie d p o ly m o r p hie D N A m a rk e r s in w h e a t
.
T h e o r
·
A PPI
.
G e n e t
. ,
8 4
:
5 6 7一 5 7 2
1 0 S k r o e h P W
,
1 9 9 5
.
Q u a lit a tiv e a n d q u a n tit a tiv e eh a r a e te r iz a tio n o f R A PD v a ria tio n a m o n g s n a p b e a n
(P ha se o lu s v u lg a r is ) g e n o ty p e s
.
T h e o r
.
A p pl
.
G e n e t
. ,
9 1 : 1 0 7 8 ~ 1 0 8 5
1 1 T ho rm a n n C E
,
R a fa ls k i J A
,
1 9 9 4
.
Co m p a r itio n o f R F I
J
P a n d R A P D m a r ke r s to e st im m a tin g g e n e t ie
r e la tio n sh ip s w it h in a n d a m o n g e r u e ife r o u s s p e e ie s
.
T h e o r
.
A p pl
.
G e n e t
. ,
8 8 : 9 7 3 ~ 9 8 0
1 2 W illi
a m s J G K
,
K u be lik A R
,
I
J
iv a k K J
,
1 9 9 0
.
D N A p o ly m o r p h is m s a m p lifie d b y a rb itr a ry p r ime
r s a r e
u s e fu l a s g e n e t ic m a r k e r
.
N u el
.
A e id s R e s
. ,
2 2 : 6 5 3 1 ~ 6 5 3 3
1 3 W illi
a m s J G K
,
I
才
iv a k K J
,
T in g e y S V
,
1 9 9 3
.
G e n e tie a n a lys is u s in g R APD m a r ke r s
.
M
e th o d s in E n z y
-
m o lo g y
,
21 8
:
7 0 4~ 7 4 0
R A P D A n a lys is o n th e G e n o m ie D N A o f S e v e r a l
T r itie e a e G r a s s e s a n d T h e ir H yb r id s
Y u Z h u o Y u n Jin fe n g
(In n e r M
o n g o lia A g rie u ltu r a lU n iv e r s ity
,
H o hh o t 0 1 0 0 1 9)
M a Y o u z hi X in Z h iyo n g
(In s tit u te o f C r o p B r e e d in g a n d C u ltiv a tio n
,
C h in e s e A e a d e m y o f A g r ie u lt u r a l S e ie n e es
,
Be ijin g 1 0 0 0 8 1)
A b st ra e t : T he G e n o m ie D N A diffe r e n e e s a m o n g A g r o仍 , ro n m o n g o lic u m X A g r oPy ro n c r ist a tu m c v ·
Fa irw a y F l h y b rid
, th e ir b a e ke r o s s l (F lhy b rid X A
. 二o n g o lic u m )a n d E ly m u s c a n a d e n sis X Il o rd e u m bre -
v isu bu la tu m F l h y br id w e r e a n a ly z e d b y u s in g R A PD
.
T he a p p r o p ria te p rim e r s w h ic h e a n b e u s e d to d e te r
-
m in e t he g e n e tie d iffe r e n e e s a m o n g p a re n t s a n d th e ir h y b rid s w e re s e le e te d
.
It w a s te ste d a n d v e rifie d th a t
th e g e n e tie diffe re n e e s in D N A b e tw e e n E
.
c a n a d e n sis a n d H
.
b re v isu bu la t u m w e r e g r e a te r th a n th a t b e
-
tw e e n A
.
m o n g o lie u m a n d A
.
e r ist a tu m e v
.
F a irw a y
.
T h e R A PD Pr o file s o f Fz h yb rid s te n d e d t o th e ir m o th e r
o b v io u s ly
.
R A PD e a n b e u s e d t o id e n t ify h yb rid s a n d t o s tu d y g e n e tie b r e e din g o f g r a s s e s
·
K e y w o r d s : T rt ic e a e g r a s s e s ; H yb r id ; G e n o m ie D N A ; R A PD ; A p p r o p r ia te p rim e rs