全 文 ：武汉植物学研究 2004，22(1)：82～86
Journal of Wuhan Botanical Research
蝴蝶兰无菌萌发技术的研究
章玉平h ，刘成运 ，胡鸿钧 ，李建强
(1．中国科学院武汉植物园，武汉 430074}2．广州市乡镇企业管理干部学院农业技术系，广州 510405)
摘 要：研究了蝴蝶兰的种子无菌萌发技术。结果表明 120 d的蒴果已达生理上的成熟，在 KC、i／2 MS、花宝 1号
基本培养基上分别附加香蕉汁、苹果汁、胰蛋白胨能较好地萌发，萌芽率为85 。9 g·L_1琼脂、pH5．2-5．4、不添
加植物生长调节剂有利于种子萌发。附加 1 mg·L KT+0．1 mg·L～2，4-D有利于类原球茎状体 PLB的诱导，
附加 1 mg·L_1 NAA+1～3 mg·L-1 KT或 3～5 mg·L BA有利于PLB的增殖。1／2 MS、花宝 1号基本培养
基上附加香蕉汁、苹果酸、胰蛋白胨和活性炭有利于生根和幼苗生长。
关键词 ：蝴蝶兰；无菌萌发；组织培养；类原球茎状体
中图分类号：Q945．51；S682．31 文献标识码 ：A 文章编号：1000—470X(2004)01—0082—05
A Study on Asymbictic Germination of Phalaenopsis
ZHANG YU—Ping ，LIU Cheng—Yun ，HU Hong—Jun ，LI Jian—Qiang
(1．Wuhan Botanical Garden，The Chinese Academy of Sciences，Wuhan 430074，China；2．Department of
Agricultural Technology，Guangzhou Townsh Business Management Cadre College，Guangzhou 510405，China)
Abstract：Seeds asymbictic germination of Phalaenopsis ‘Fun Time’was studied．On the KC，
1／2 MS and Hyponex No．1 basal media supplemented with various complex additives(i．e．
banana juice，apple juice，tryptone and active carbon)seeds germinated wel1．Exogenous plant
growth substances inhibited seeds germination．9 g ·L Agar and pH value(5．2— 5．4)were
favourite for germination．The germination percentage of seeds aged 1 20 days after pollination
was over 85 ．Three media such as KC，1／2 MS，and revised NITSCH supplemented with
1 mg·L一 KT+ O．1 mg ·L一 2，4-D were used to induce PLB，supplemented with 1 mg ·L一
NAA + 1— 3 mg·L KT or 3— 5 mg ·L-1 BA were used to multiply PLB ．Hyponex No．1 or
1／2 MS medium supplemented with banana juice，tryptone，malic acid and active carbon were
suitable for root organogenesis and seedlings growth．
Key words：Phalaenopsis；Asymbictic germination；Tissue culture；Procotorm—like—body(PLB)
蝴蝶兰(Phalaenopsis)是兰科蝶兰属植物，花形
奇特，色彩艳丽，花期很长，具有较高的观赏价值，近
年来在国内外花卉市场上颇受欢迎。由于它是单茎
性附生兰，难以进行常规的无性分株繁殖；同时种子
细小、无胚乳，营养物质含量极少，自然情况下发芽
率极低。通过无菌播种人工培养，能够在短时间内获
得大量幼苗，是现阶段经济有效的快速繁殖方法和
工厂化育苗的重要途径。
关于蝴蝶兰的无性繁殖，近年来国内外都有过
报道，但多数以花梗顶芽、花梗腋芽、花梗节间组织、
叶片、茎尖和茎段作为外植体，有关蝴蝶兰种子的无
菌萌发少有报道 卜引。本文报道蝴蝶兰种子无菌萌
发技术，为蝴蝶兰的工厂化生产提供理论依据和积
累有关资料。
1 材料和方法
1．1 材料
日本产大轮白花系品种
收稿日期；2003—06l_19，修回日期：2003—09—18。
作者简介：章玉平(1968一)，男，硕士，讲师，从事植物生理学和花卉学的教学、科研工作。
Phalaenopsis ‘Fun
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第 1期 章玉平等：蝴蝶兰无菌萌发技术的研究 83
Time，，由昆明庆成花卉公司提供。
1．2 方法
1．2．1 外植体及其灭菌、接种
剪取不同生长期(授粉后 80、95、110、120 d)的
蒴果，表面用 自来水洗净，然后用浸过 70 酒精的
纱布擦拭干净，再用 0．1 的升汞灭菌 12~15 min，
用无菌水冲洗 4"--5次，最后用无菌滤纸吸干果皮外
的水。于无菌条件下在超净工作台上切开蒴果，刮出
种子，接种于培养基中。
1．2．2 培养基
种子无菌萌发培养基 ①KC+20 g·L Suc
(蔗糖)+9 g·L叫Agar(琼脂)；②KC+150 g·
L 苹果汁+1 g·L AC(活性炭)+20 g·L
Suc+9 g·L_。Agar；~KC+150 g·L 苹果汁±
0．5 mg·L．1 KT± 0．5 mg·L NAA + 20 g·
L叫Suc+9 g·L叫Agar；④3 g·L叫花宝 1号+
2 g·L Tryptone(胰蛋白胨)+1 g·L AC+
35 g·L叫Suc+9 g·L Agar；⑤3 g·L 花宝 1
号+2 g·L Tryptone+100 g·L 苹果汁或香蕉
汁+1 g·L AC+20 g·L叫 Suc+9 g·L_。Agar；
⑥1／2 MS+2 g·L Tryptone+100 g·L 苹果
汁或香蕉汁+1 g·L．1 AC+20 g·L叫 Suc+9 g·
L_。Agar。花宝 1号为美国HYPONeX公司生产的
花宝牌 (HYPONex)水溶性复合肥，N：P：K一
7：6：19。1／2 MS指MS中的大量元素减半，其它成
分不变，下同。①～④、⑥号培养基 pH值为 5．4。
⑤号培养基 pH值设 5．0、5．2、5．4、5．6、5．8、6．0
六个处理，琼脂含量设 15、10、9 g·L 三个处理。
苹果汁和香蕉汁分别为新鲜的苹果和香蕉去皮后用
食品捣碎机打碎研磨成糊状再加入到培养基中一同
灭菌。
成苗培养基 ⑦3 g·L 花宝 1号+30 mg·
L 苹果酸+150 g·L 香蕉汁+2 g·L_。Tryp—
tone+30 g·L Suc+9 g·L_。Agar；⑧1／2 MS
+30 mg·L 苹果酸+150 g·L 香蕉汁+2 g·
L一 Tryptone+ 30 g·L一 Suc+ 9 g·L一 Agar。
PLB诱导及增殖培养基 ⑨KC+MS的铁盐
及微量元素+1 g·L．1 AC+30 g·L叫Suc+9 g·
L—Agar；@Nitsch(1969)的大量元素+MS的铁盐
及微量元素+1 g·L AC +30 g·L Suc+9 g·
L一 Agar；⑩ 1／2 MS+1 g·L一 AC+30 g·L一
Suc+9 g·L—Agar。⑨～⑩中生长调节剂分别设
KT ：0．5、1、2 mg·L_。；NAA ：0．5、1、2 mg ·L_。；
2，4-D：0．1、0．5、1 mg·L 各 3个处理。
1．2．3 培养条件
种子萌发前用散射光照射，萌发后置于光强
2 000"-3 000 Ix的光下，14 h／d，温度(25±1)℃；其
它培养条件为光强 2 000 Ix，8～10 h／d，温度为(25
±1)℃ 。
2 结果与分析
2．1 种子萌发过程
以⑤号培养基为例，无菌播种 10 d后胚明显膨
大，呈淡黄色，个别呈淡黄色小球体，15 d后小球体
陆续出现，2O d后可以用肉眼明显看到，25 d后约
有 4O --50 萌发，呈黄绿色，30 d后 75 以上的
原球茎(Protocorm)呈绿色，45 d后发芽率为 85 ，
且形成第一片叶，6O d后形成第二片叶，转移到新
的培养基上形成再生植株(表 1)。
表 1 种子培养过程中形态变化和发芽率
Table 1 The morphoiogical change and germination
percentage of Phalaenopsis ‘Fun Time’after culture
培养时间(d)
Days
after
culture
形态变 rm率
in M
orphoiogi∞lchang
rcen
1O 胚明显膨大，呈淡黄色 0 dC。
15 少数小球体，呈淡黄色 少数 dC
2o 少数小球体，体积增大，呈淡黄色 少数 dC
25 原球茎，黄绿色 40~50 cB
3O 原球茎，绿色 75 bA
45 原球茎，绿色，长出第一片叶 85 aA
* 数字后大、小写字母表示 SSR测验达 0．01、0．05显
著水平。
* The diferent capital and small letters indicated sig—
nificances at P一0．01 or P一0．05 level of SSR test
respectively．
2．2 不同因子对种子萌发的影响
2．2．1 不同培养基对种子萌发的影响
采用①～⑥号培养基对 120 d的蒴果进行培
养。结果①、③号培养基上的种子不能萌发，②、④、
⑤、⑥号培养基上的种子均可萌发。①和②号、②和
⑧号相对比说明KC基本培养基不能使蝴蝶兰种子
萌发，附加苹果汁后却能萌发。外源植物生长调节剂
对种子萌发有抑制作用。从②、④、⑤、⑥号培养基中
可以看出天然物质如苹果汁、香蕉汁、胰蛋白胨和活
性炭对种子萌发具有促进作用。3种基本培养基
KC、I／2 MS和花宝 1号对蝴蝶兰种子萌发的作用
差异不显著。但后续苗的生长以花宝1号为好(表2)。
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84 武 汉 植 物 学 研 究 第 22卷
衰 2 不同培养基对种子萌发的影响
Table 2 The effects of different media on the seed
germination of Phalaenopsis‘Fun Time’
培养基
Medium
发芽率(％)
Germination percentage
①
②
③
④
⑤
⑥
0 bB。
80 aA
0 bB
80 aA
85 aA
85 aA
*所需注释同表 1。
* What need notes refer tO table 1．
2．2．2 不同琼脂含量对种子萌发的影响
在⑤号培养基中分别加入 15、1O和 9 g·L
琼脂 结果加 9 g·L 琼脂的效果最好，10 g·L
次之，15 g·L_1最差(表 3)。这是因为加 15 g·L
琼脂的培养基太硬，种子吸水困难，发芽率仅为
25 9，6，加 10 g·L_1琼脂的培养基适合种子萌发，发
芽率直接接种为 5O％，加几滴无菌水接种发芽率为
8o 加 9 g·L 琼脂的培养基最适合于蝴蝶兰种
子萌发，发芽率为85 。究其原因可能是这种可以流
动的水渗透到种皮后直接被呈休眠状态的胚吸收。
表 3 不同琼脂含量对种子萌发的影响
Table 3 The effects of agar value on the seed
germination of Phalaenopsis ‘Fun Time’
琼脂(g)
Agar
发芽率(OA)
Germination percentage
15
10
10(~n几滴无菌水)
9
25 eC’
50 bB
80 aA
85 aA
*所需注释同表 1。
* W hat need notes refer to table 1．
2．2．3 外源植物生长调节剂对种子萌发的影响
在③号培养基中分别加入 0．5 mg·L KT或
0．5 mg·L NAA 或 0．5 mg·L KT+ 0．5 mg·
L叫NAA时种子均不萌发(表 2)。这表明生长调节
剂对蝴蝶兰种子萌发有抑制作用。不同属种的兰科
植物种子萌发时对外源生长调节剂的敏感度不同。
一 类称为难萌发的种子，多数地生兰属于此类，如硬
叶吊兰、建兰、寒兰和套 叶兰[7-9]、五唇兰lao ；另一
类称为易萌发的种子，如大多数附生兰。难萌发的种
子在萌发时需要对种子进行预处理如剪破种皮，
0．1 mol·L NaOH或 0．5 9，5 H2O2处理且{菸赖于
外源生长调节剂；而易萌发的种子则不需要预处理
和外源生长调节剂[n]。但曾宋君等[ 认为低浓度
(O．2 mg·L_1)的 BA有利于种子的萌发，BA浓度
超过 1．0 mg·L叫时，抑制作用比较明显。可以认为
蝴蝶兰的种子属于易萌发的种类，萌发过程中不需
要外源生长调节剂。
2．2．4 不同 pH值对种子萌发的影响
种子萌发在⑤号培养基上进行，接种 45 d后统
计其发芽率。可以看出pH值在 5．0-~5．6之间发芽
率差异不显著。pH值低于 5．0或高于 5．6影响较
大，最适 pH值为 5．2-~5．4(表 4)。
衰 4 不同 pH值对种子萌发的影响
Table 4 The efects of pH value on the seed germination
of Phalaenopsis‘Fun Time’
pH值 发芽率(0A)
pH value Germination percentage
*所需注释 同表 i。
* W hat need notes refer to table 1．
2．2．5 不同成熟期种子对发芽的影响
取授粉后 8O、95、110、120 d的蒴果于无菌条件
下剖开，可见 80"-95 d的果实内呈乳青色或乳白
色，粘性较大，在水中(含 3 H O )不易分散，种子
尚未形成，在⑤号培养基上不能萌发。110 d种子基
本形成，6O 可以萌发，120 d以上的种子已达生理
上的成熟，分散较容易，发芽率为 85 (表 5)。蝴蝶
衰 5 不同成熟期蒴果对种子发芽率的影响
Table 5 The efects of seeds of diferent maturity on germinatin of Phalaenopsis‘Fun Time’
*所需注释同表 1。
易at need notes refer tO table 1．
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第 1期 章玉平等：蝴蝶兰无菌萌发技术的研究
兰的果实自授粉后到正常开裂需要 14O～150 d。但
通过试验可以认为 120 d的种子 已达生理上的成
熟，不必等到蒴果开裂时再去培养。这样既可以缩短
育种时间，又可以简化灭菌程序，因为未开裂的果实
内部是无菌的，而且在果实开裂前较长的一段时间
内(约为从授粉到果实开裂所需时间的四分之一)种
子的发芽率差异不大。这和段金玉在朵朵香与其它
兰属植物[8 3以及天麻[1。3，Helena Mathews V．在万
带兰杂种[1。3的种子萌发得到的结果相似。
2．3 由原球茎诱导类原球茎状体(Protocorm—
Like—Body，PLB)
将培养 45 d的种子所形成的原球茎转移到含
不同生长调节剂的PLB诱导培养基⑨、⑩、⑩上，原
球茎可以增殖形成类原球茎状体(PLB)。不同生长
调节剂水平下形成的PLB比例不同。生长调节剂浓
度高，形成PLB比例高，但过高的 2，4一D可导致品
种发生变异，幼苗叶片扭曲。因此对保持品种特性不
利。而采用 1 mg·L_1 KT+0．1 mg·L一2，4-D虽
然培养物中只有 5O 形成 PLB，但这些 PLB体积
较小，数量并不少，易于分散而不必切割，在进行增
殖培养时易成活。同时 5O 的幼苗根生长茁壮，根
长出许多白色小根毛，转移到成苗培养基上很快成
苗(表 6)。
表 6 不同生长调节剂水平下 PLB和幼苗出现的比例
Table 6 The rate of PLB／plantlet at various level of
exogenous growth substances
生长调节剂 类原球茎状体 幼苗
Exogenous growth substances PLB Plantlet
1 mg·I 一 KT+1 mg·L一 2，4-D 80％以上 20％以下
1 mg·L一 KT+O．5 mg·L一 2，4-D 80％ 20％
1 mg·L KT+0．1 mg·L一 2，4-D 50％ 50
2．4 PLB的增殖
选取生长于附加 1 mg·L KT+0．1 mg·
L 2，4一D的培养基上的PLB转移到⑨、⑩、⑩培养
基上。15 d后开始产生新的 PLB，30 d后转移到新
鲜的培养基中。培养基中不再用2，4一D，改为1 mg·
L NAA+1～3 mg·L KT 或 3～5 mg·L
BA，增殖率可达 3～5倍。应用不同浓度的生长调节
剂可使PLB的体积产生变化。生长调节剂浓度高，
PLB体积大、数量少、表面光滑。相反则体积小、数
量多、不十分光滑。大的PLB在继代时必须切割，而
切割是造成死亡的重要原因，大约 7O 的 PLB死
亡。而数量较多、体积小的PLB不必切割，只需用解
剖刀或针分散开，即可转移，成活率可达 8O 以上。
张菊野等[1‘3在研究切割方式对春兰原球茎生长的
影响指出掰开法最佳，横切法次之，纵切法最差。但
Amaki[15]认为杂种朵丽蝶兰 (Doritaenopsis)的原球
茎纵切可促进苗的形成。这可能是因为兰花原球茎
的种类和生理状态有异而有所不同。
2．5 成苗培养
成苗培养基⑦、⑧号均可，成活率高，幼苗茁壮，
生长快。从母瓶转移到半母瓶(第一次转移用的三角
瓶)再到子瓶(第二次转移用的三角瓶)的过程中，为
了避免转移时造成污染和死亡，当种子形成原球茎
后可以一次性转移到成苗培养基上，每 1 000 mL的
三角瓶可转移 3O株幼苗。采用⑦、⑧号成苗培养基
生根率可达 100 。可见苹果酸和香蕉汁对长根具
有促进作用。已有大量文献报道 1／2 MS培养基对
试管植物的长根具有促进作用[1 3。
2．6 试管苗出瓶移栽
出瓶前先将封口打开，让试管苗适应外部环境。
出瓶的小苗要先用清水将附在小苗上的培养基洗干
净，栽植在洁净的水苔上，置于阴凉处，注意保持基
质湿润、环境湿度和通风。1个月后小苗生长稳定，
开始喷施液肥。等到小苗有新叶长出时，便可移植到
小盆上。出瓶后的植株一般 1．5～2年便可以开花。
3 讨论
3．1 种子萌发的最佳条件
蝴蝶兰种子极其微小，结构简单，无胚乳，但一
个蒴果中含种子数量巨大。利用种子无菌萌发可在
短期内获得大量的幼苗，是切实可行的快速繁殖手
段之一。
种子萌发时宜选择 120 d以上的蒴果作培养材
料，基本培养基采用花宝 1号、KC、或 1／2 MS，添加
琼脂 9～1O g·L一，pH值 5．2～5．4，不添加外源生
长调节剂，有机添加物如香蕉汁、苹果汁和胰蛋白胨
对种子萌发及幼苗的生长具有促进作用，活性炭(吸
收有毒物质)有利于克服外植体褐化，且有利于长
根 。
3．2 原球茎增殖的机理
原球茎最初是兰花种子萌发过程中的一种形态
学结构。种子萌发初期并不出现胚根，只是胚逐渐膨
大，以后种皮的一端破裂，膨大的胚呈小圆锥状，称
作原球茎[1 3。
原球茎的个体发生特点有别于愈伤组织的器官
发生型。其特点是：在同一块培养物上，同时存在着
处于不同发育阶段的分生区、芽和小植株，而且它不
像愈伤组织那样必须切割创伤才能继代增殖，它可
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86 武 汉 植 物 学 研 究 第 22卷
以在营养丰富的培养基中无限增殖[】 引。原球茎增
殖的机理在于由其生长锥后面的薄壁细胞在适宜的
条件下转变成胚性细胞，通过胚性细胞团、球形胚发
育而来[】 。
外源生长调节剂对蝴蝶兰 PLB的生长有较大
影响。较高浓度时(1 mg·L KT+0．1 mg·L
2，4-D)PLB生长快而大，数量相对减少，但切割后
转移到增殖培养基中极易褐化死亡。采用较低浓度
时(1 mg·L KT+0．1 mg·L_。2，4一D)PLB数
量较多，体积较小，可避免切割，从而提高成活率和
减少变异。
参考文献：
[1] 陈之林，叶秀粪，梁承邺．蝴蝶兰花葶的离体培养EJ3．
园艺学报，2003，30(2)：242—244．
[2] 鲁雪华，郭文杰，徐力晖，林新华．蝴蝶兰花梗节间段
培养繁殖的初步研究[J3．园艺学报，2002，29(5)：
491-492．
[3] 林宗铿 ，黄德贵．蝴蝶兰花梗的组织培养及快速繁殖
[J3．福建热作科技，2001，26(1)：6—9．
[4] 杨美纯 ，周岐伟，许鸿源，卢美英．外部因子对蝴蝶兰
叶片原球茎状体发生的影响[J3．广西植物，2000，20
(1)：42—46．
[5] 曾宋君 ，彭晓明，张京丽，赵逢畔．蝴蝶兰的组织培养
和快速繁殖[J3．武汉植物学研究，2000，18(4)：344—
346．
[6] Jiang—Xiang D，Sumama Y．Foral induction and de—
velopment in Phalaenopsis in vitro[J]．Plant Cell
77ss Organ Culture，1995，43：71— 74．
[7] 段金玉 ，谢亚红．生长调节剂对硬叶吊兰种子萌发及
发育成小苗 的影响[J3．云南植物研究，1981，3(1)：
l9-24．
[8] 段金玉，谢亚红．在无菌条件下，生长调节剂和种子处
理对兰属十种植物种子萌发的影响[J3．云南植物研
究 ，1982，4(2)：197—201．
[9] 段金玉，谢亚红．朵朵香种子的萌发及生长调节剂对
根 茎分化的影响 [J]．云南植物研 究，1983，5(2)：
197-200．
Elo3 张菊野，俞玲风，李文安．五唇兰生物学特性及试管繁
殖的研究[J3．生物学杂志，1995(1)：2O一22．
[1 1 3 Arditti J．Factors affecting the germination of orchid
seeds[J]．Bot R，1967，33：1—97．
[123 段金玉，梁汉兴．天麻种子的发芽率与种子成熟度的
关系[J3．云南植物研究，1982，4(3)：303—306．
[133 Helena Mathews V，Rao P S．In vitro multiplicaton
of Vanda hybrids tissue culture technique[J]．Plant
Sci，1980，l7：383— 389．
[14] 张菊野，俞玲风，连宏坤．几种影响春兰原球茎生长与
分化的因素[J3．植物生理学通讯 ，1993，29(3)：175—
178．
[153 Amaki W。Haguchi H．Effects of dividing on the
growth and organogenesis of protocorm—-like—-bodies
in Dortitaenopsis[J]．Sci Hort，1989，89(5)：63．
[163 谭文澄，戴策刚主编．观赏植物组织培养技术[M]．
北京：中国林业出版社，1991．99—119．
E173 王熊，陈季楚，刘桂云，顾梅仙，包慈华．建兰和秋兰原
球茎的发生及其无性系的建立[J3．植物生理学报 ，
1981，7(2)：203—207．
E183 王熊，吴敦肃．建兰类原球茎状体生长发育过程中扫
描 电镜观察[J]．植物生理学报，1991，l7(2)：192—
196．
[19] 杨柏云．大花蕙兰原球茎解剖构造的观察[J3．植物学
通报，1994(增刊)：42．
维普资讯 http://www.cqvip.com