全 文 ：线柱苣苔无菌萌发及快速繁殖研究
姚绍嫦，蓝祖栽，凌征柱
（广西壮族自治区药用植物园，南宁 530023）
摘 要：为了通过组织培养方法建立线柱苣苔高效再生体系，以线柱苣苔种子为外植体，在MS培养基中
添加6-BA与NAA不同浓度激素配比，筛选初代培养、继代增殖与生根培养等各阶段最适的培养基。结
果表明，用0.1% HgCl2溶液对线柱苣苔蒴果与种子灭菌10 min可有效抑菌。种子萌发及不定芽诱导的
最适培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA。最佳的继代增殖培养基为MS+0.5 mg/L 6-BA+
0.2 mg/L NAA，生根培养基为 1/2 MS+0.2 mg/L NAA。利用本试验所得出的结果，增殖系数为 13.5/20
天，可实现线柱苣苔种苗的快速繁殖，为种质资源的保护和可持续利用提供技术指导。
关键词：线柱苣苔；无菌萌发；快速繁殖
中图分类号：R282.2 文献标志码：A 论文编号：2014-2151
Germination and Rapid Propagation from Seed of Rhynchotechum obovatum (Griff.) Burtt
Yao Shaochang, Lan Zuzai, Ling Zhengzhu
(Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plant, Nanning 530023)
Abstract: The research aims to develop rapid propagation system from seed of Rhynchotechum obovatum
(Griff.) Burtt via tissue culture. The seed of Rhynchotechum obovatum acting as explants were germinated and
cultured on MS supplemented with different concentrations of hormone in order to select the optimum medium
for different phases. The results showed that, the seeds and capsules were efficiently sterilized by 0.1% HgCl2
for 10 min. The optimum medium for germination and buds induction was MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA.
The suitable multiplication medium was MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA and the suitable rooting medium
was 1/2 MS + 0.2 mg/L NAA. Using the methods obtained in this experiment, in vitro rapid propagation of
Rhynchotechum obovatum could be achieved at the multiplication rate of 13.5 per 20 days, which could
develop more seedlings in short time and provide guidance for the conservation and sustainable development of
the resource.
Key words: Rhynchotechum obovatum (Griff.) Burtt; sterile germination; rapid propagation
0 引言
线柱苣苔[Rhynchotechum obovatum (Griff.) Burtt]
是苦苣苔科线柱苣苔属的植物，产于云南、广西、广东
等地，生于山谷林中或溪边阴湿处[1]。线柱苣苔是中
国传统的民间草药，全草、叶、花均可入药，全草具有清
肝、解毒的功效，用于疮疥，叶、花用于咳嗽、烧烫伤
[2]。线柱苣苔在自然界中分布区域狭窄，对环境条件
要求较高，适生的环境范围较小[3]，且种子在自然状态
下难以萌发，严重制约了其开发利用。该科植物集观
赏和药用价值于一身，继 1972年Kukulczanda等以叶
片作为材料成功建立非洲堇的再生体系之后，前人纷
纷对该科的其他植物例如大岩桐、扭果花等商品花卉
进行了研究[3]，目前中国科学院植物研究所石雷、汤正
辉等已通过组织培养技术成功获得了唇柱苣苔属、非
洲堇属和大岩桐属等30余种离体保存材料，为本试验
的开展提供了指导。
基金项目：广西卫生厅科研课题“药用唇柱苣苔等六种苦苣苔科药用植物离体种质保存技术研究”(Z2011156)。
第一作者简介：姚绍嫦，女，1980年出生，广西容县人，高级工程师，硕士，主要从事药用植物组织培养技术研究。通信地址：530023广西省南宁市长
岗路189号广西药用植物园，Tel：0771-5610462，E-mail：yaoshaochang@163.com。
收稿日期：2014-08-07，修回日期：2014-10-08。
中国农学通报 2014,30(31):280-284
Chinese Agricultural Science Bulletin
本试验研究人员自 2006年开始对该科植物进行
了研究，目前已成功获得了药用唇柱苣苔[4]、条叶唇柱
苣苔[5]、菱叶唇柱苣苔[6]等10多种离体保存材料。组织
培养技术是植物引种驯化及繁育的一种重要手段，通
过组织培养可以克服植物在迁地保育、繁衍、杂交育种
及工厂化生产中的障碍，达到种质资源保护和利用的
目的，然而迄今尚未发现任何关于线柱苣苔组织培养
相关的研究报道。因此，笔者以种子为外植体，探讨了
线柱苣苔外植体灭菌、丛生芽的诱导与增殖、生根移栽
等技术环节。本研究旨在建立线柱苣苔离体培养再生
体系，以有效保存与开发稀有的种质资源，并为进一步
在细胞水平上对线柱苣苔进行遗传改良和直接生产次
生代谢产物等研究应用奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
线柱苣苔引种栽培于广西药用植物园引种繁育
圃，选取成熟的荚果作为外植体材料。
1.2 方法
1.2.1 外植体的灭菌 对于成熟且尚未开裂的蒴果，将
蒴果采回后放入烧杯，加几滴洗洁精震荡清洗几次，再
用流水冲洗15 min。对于已开裂的果实，将种子取出，
用高压灭菌的滤纸包好。在超净工作台上用75%酒精
浸泡蒴果与包有种子的滤纸 10~15 s，然后在 0.1%
HgCl2溶液中浸泡灭菌10 min，用无菌水清洗4次。对
于蒴果，用解剖刀将果皮纵向切成两半，把种子取出均
匀放在培养基上。对于滤纸包好的种子，用镊子打开
滤纸，夹取种子均匀放在培养基上。种子萌发培养基
均为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA。
1.2.2 种子萌发与初代诱导培养 待种子萌发后，幼苗
长出1~2片真叶时，切去根部，接种到不同激素组合的
初代培养基上诱导丛生芽，以MS为基本培养基，添加
不同浓度的 6-BA(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L)和NAA
(0.2、0.5 mg/L)，共设计 10种培养基。每种培养基 30
瓶，每瓶接种1个幼苗。培养30天，统计芽诱导率。
1.2.3 继代增殖培养 将丛生芽转接到增殖培养基中进
行继代培养，以MS为基本培养基，添加不同浓度的6-
BA(0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L)和NAA 0.2 mg/L，
共设计 6个组合。10瓶/组合，3芽/瓶，观察丛生芽增
殖情况，培养20天统计增殖系数。
1.2.4 生根培养 选取高度达 1 cm以上的芽进行生根
培养。以 1/2 MS为基本培养基，添加不同浓度的
NAA(0.1、0.2、0.5 mg/L)或者 IBA(0.1、0.2、0.5 mg/L)，
共设计6个组合。30瓶/组合，2芽/瓶。观察芽的生根
情况，培养20天统计生根率。
1.2.5 培养条件 所有培养基均附加蔗25 g/L糖和琼脂
5 g/L，20 mL/瓶，121℃灭菌 20 min。培养条件为
(26±2)℃、光照强度30 μmol/(m2· s）、光照时间10 h/天。
1.3 数据统计
采用单因素完全随机设计，重复 3次，用 SPSS
13.0进行差异显著性分析，计算结果表示为平均值±标
准差，采用LSD法进行多重比较，小写字母表示差异
达到显著水平(P＜0.05)，大写字母表示差异达极显著
水平(P＜0.01)。
2 结果与分析
2.1 种子灭菌与萌发
对未开裂的蒴果在0.1%的HgCl2溶液中浸泡灭菌
10 min达到较好的灭菌效果，未发现污染，并且发芽率
较高。通过对未开裂的蒴果进行灭菌与直接对种子
（滤纸包好）进行灭菌2种灭菌方式的比较（见表1），对
未开裂的蒴果进行灭菌的方式不仅达到较好的灭菌效
果而且发芽率较高、发芽时间较短、生长较整齐，可能
是由于种子未直接接触 HgCl2溶液，有效地避免了
HgCl2溶液对种子的伤害，更有利于种子的萌发。种子
在MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA培养基上培养
10天时开始萌发（图1）。继续培养约20天，幼苗长出
1~2片真叶，此时即可用于丛生芽诱导。
2.2 初代诱导培养
线柱苣苔的无菌苗在不同激素配比的培养基均能
诱导出丛生芽，但是在出芽数、丛生芽诱导率、诱导时
灭菌方式
灭菌未开裂的荚果
直接灭菌种子
污染率/%
0
26.67
萌发率/%
100
83.17
萌发时间/d
10
12
表1 不同灭菌方式对线柱苣苔种子灭菌及萌发的影响
图1 种子在MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA上
培养10天开始萌发
姚绍嫦等：线柱苣苔无菌萌发及快速繁殖研究 ··281
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间以及生长情况上存在较大差别（表 2）。当 6-BA
1.0 mg/L与NAA 0.2 mg/L配合时，丛生芽诱导率最
高，达100%，且诱导速度快、芽多而密、颜色翠绿、生长
旺盛（图 2），其他配比的丛生芽诱导率均较低且丛生
芽诱导时间较长、生长较慢，特别是当6-BA的浓度增
加到 2.5 mg/L时，丛生芽出现玻璃化现象，影响其生
长。丛生芽在最适的诱导培养基中培养25天时，丛生
芽长成簇状结构，此时的芽可进行继代培养培养过程
中未发现愈伤组织形成。因此，MS+6-BA 1.0 mg/L +
NAA 0.2 mg/L培养基是线柱苣苔初代诱导的最适培
表2 不同激素配比对线柱苣苔丛生芽诱导的影响
培养基
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
激素浓度/(mg/L)
6-BA
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
NAA
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
接种数/个
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
出芽数/个
18.67
30.00
24.67
23.67
17.33
11.33
7.67
20.33
18.67
17.33
丛生芽诱导率/%
62.22±0.31 D
100.00±0.00 A
82.22±0.21 B
78.89±0.36 B
57.78.±0.35 E
37.78±0.16 F
25.56±0.58 G
67.78±0.37 C
62.23±0.46 D
57.78±0.72 E
诱导时间/d
37
25
27
28
30
36
33
34
36
38
生长情况
大量丛生芽，生长缓慢
大量丛生芽，生长旺盛
大量丛生芽，生长较快
大量丛生芽，生长较快
大量丛生芽，生长较慢
少量丛生芽，生长缓慢
少量丛生芽，生长较慢
大量丛生芽，生长较慢
大量丛生芽，生长缓慢
大量丛生芽，生长缓慢
注：表中计算结果为平均值±标准差，并采用LSD法进行多重比较(P=0.01)。
养基。
2.3 继代增殖培养
细胞分裂素 6-BA对线柱苣苔丛生芽增殖具有重
要的作用，经方差分析发现各处理均达到极显著差异
(P=0.01)。从表3可看出，6-BA浓度较低(0.1~0.2 mg/L)
时，芽的增殖系数很低，说明6-BA浓度仍需增加。当
6-BA浓度增加到 0.5 mg/L时，增殖系数明显增加，为
13.5/20天（图 3），且芽的叶片较大、翠绿、生长快。随
着6-BA浓度的进一步增加，增殖系数反而开始下降，
特别是当6-BA浓度增加到1.5 mg/L时，芽出现玻璃化
现象。因此，综合增殖系数与芽生长情况来考虑，笔者
认为适宜线柱苣苔继代增殖的培养基为MS+6-BA
0.5 mg/L +NAA 0.2 mg/L。
图2 无菌苗在MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA上
培养30天诱导的丛生芽
培养基
1
2
3
4
5
6
激素浓度/(mg/L)
6-BA
0.1
0.2
0.5
1.0
1.5
2.0
NAA
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
增殖系数
5.80±0.13 D
6.75±0.21 D
13.50±0.25 A
10.35±0.12B
8.59±0.31 C
8.30±0.25 C
生长情况
芽少、叶小、生长缓慢
芽少、叶小、生长缓慢
芽多、叶大、生长迅速
芽较多、叶较大、生长迅速
芽多、叶小、轻微玻璃化
芽较多、叶小、玻璃化
表3 不同6-BA浓度对线柱苣苔不定芽增殖的影响
注：表中计算结果为平均值±标准差，并采用LSD法进行多重比较(P=0.01)。
··282
2.4 生根与移栽
试管苗在生根培养基中培养 10天可观察到根原
基形成，白色幼嫩的根开始生成，培养20天进行统计，
结果表明（表 4），不同的生根培养基均能诱导试管苗
生根，生根率达到 100%，说明线柱苣苔容易诱导生
根。在添加NAA的培养基中，诱导出来的根细长、生
长快、根部形成少量愈伤组织、后期移栽成活率高；在
添加 IBA的培养基中，诱导出来的根粗、短、生长慢、根
部形成一定量的愈伤组织后再在愈伤组织上长根、后
期移栽成活率低。经方差分析表明，在培养基中添加
NAA与 IBA的移栽成活率差异达到显著水平 (P=
0.05)，以 1/2 MS+NAA 0.2 mg/L效果较好（图 4），移栽
成活率较高，达到86.0%。
图3 在MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA上
培养20天获得的增殖丛生芽
表4 不同生长素浓度对线柱苣苔再生芽生根及移栽成活的影响
培养基
1
2
3
4
5
6
激素浓度/(mg/L)
IBA
0
0
0
0.1
0.2
0.5
NAA
0.1
0.2
0.5
0
0
0
生根率/%
100±0 a
100±0 a
100±0 a
100±0 a
100±0 a
100±0 a
成活率/%
71.67±1.67 a
86.00±2.32 a
73.33±1.67 a
66.67±1.67 bc
63.33±1.67 bc
56.67±1.67 bc
生长情况
根细长、生长快
根细长、生长快
根细长、生长快
根粗短、生长慢
根粗短、生长慢
根粗短、生长慢
注：表中计算结果为平均值±标准差，并采用LSD法进行多重比较(P=0.05)。
3 结论与讨论
本研究以种子为外植体，建立了线柱苣苔组培快
繁体系，研究结果表明，用0.1% HgCl2溶液对种子进行
直接或者间接灭菌10 min均可有效除菌，间接灭菌的
效果更佳。适宜种子萌发及不定芽诱导的培养基为
MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，继代增殖培养基
为MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，生根培养基为
1/2MS+0.2 mg/L NAA。利用本试验所得出的结果，增
殖系数为 13.5/20天，可实现线柱苣苔种苗的快速繁
殖，为种质资源的保护和可持续利用提供技术指导。
植物组织培养的成功与否首先在于能否建立起无
菌外植体，在以往获得成功的苦苣苔科植物中大多以
幼嫩叶片为外植体[7]，然而该科大多数植物均通体布
满茸毛、大量外生菌滋生于茸毛中，给外植体灭菌带来
了极大的困难。本试验研究人员曾在鹤顶兰[8]、山豆
根[9]等药用植物的组织培养中采用对未开裂果实进行
灭菌后再将种子取出接种的方式均取得了较好的效
果，线柱苣苔果实为蒴果，在蒴果开裂之前，蒴果中的
种子应是无菌的，因此，笔者尝试以未开裂的蒴果为外
植体建立线柱苣苔的无菌培养体系。试验结果表明，
以未开裂的蒴果为外植体达到很好的灭菌效果，避免
了种子直接与HgCl2接触，将灭菌剂对种子的伤害程
度降到最低。当蒴果开裂后，只能直接对种子进行灭
菌，增加了组织培养中除菌的难度，通过延长灭菌时间
虽也能降低污染率，但灭菌剂与种子长时间的接触，会
对细小的种子产生毒害，从而影响种子的萌发。
图4 在1/2 MS+0.2 mg/L NAA上培养20天获得的生根苗
姚绍嫦等：线柱苣苔无菌萌发及快速繁殖研究 ··283
中国农学通报 http://www.casb.org.cn
在植物离体培养诱导愈伤组织和丛生芽过程
中，涉及到核酸合成与降解的平衡、DNA的复制与
转录、特定基因控制下的特定蛋白的形成，这个过程
取决于是否有合适的激素诱导，只有在细胞分裂素与
生长素的合理配置下，才能获得较高的诱导率[10]。前
人对该科植物进行丛生芽诱导常用细胞分裂素 6-BA
与生长素NAA、IBA组合 [7]，本研究在前人基础上用
6-BA与NAA组合也成功诱导出线柱苣苔的丛生芽，
且利用较高浓度的细胞分裂素(1.0 mg/L 6-BA)和低浓
度的生长素(0.2 mg/L NAA)获得丛生芽诱导率的最大
值(100%)。随着 6-BA激素浓度的增加(2.5 mg/L)，丛
生芽的诱导率反而下降，且产生的芽开始出现玻璃
化现象。在丛生芽的继代增殖过程中也表现出相同
的变化规律，随着 6-BA激素浓度的增加，其增殖系
数反而下降，且出现玻璃化现象，说明在一定范围
内，6-BA浓度增加有利于丛生芽的诱导与增殖，这
与前人的研究结果类似，其原因有待进一步研究与
探讨。迄今为止仅发现猫耳朵 [11]和金红花 [12]的诱导
培养基 6-BA为 2.0 mg/L，其余的均不超过 1.0 mg/L，
说明该科植物属于对 6-BA敏感的植物，易于启动诱
导丛生芽。
在生根培养的试验中，试管苗生根的难易与母株
的生理状态[13]、取材季节和环境条件等因素有关[14]，在
植物生长调节剂的使用上大多以NAA、IAA、IBA单独
或配合使用，或与KT配合使用以达到诱导生根的效
果[15]。本研究发现线柱苣苔与同科其他植物相似，较
易生根，在 1/2 MS培养基中加入一定浓度的NAA或
者 IBA后，均能诱导生根，说明生长素类的物质能够较
容易引起该科植物体内分布的特异性改变，这一变化
与器官发生密切相关，从而促进根的生成。
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