全 文 ：武汉植物学研究 2008，26(1)：99～103
Journa／of Wuhan Botanical Research
沉水植物光合作用测定的电化学方法
李伟 ，尹黎燕
(中国科学院武汉植物园水生植物生物学实验室，武汉 430074)
摘 要：光合作用速率测定是植物光合作用研究的重要基础，沉水植物由于所处生境的特殊性，难以应用在陆生植
物光合作用研究中发展起来的速率测定方法。在对水体中二氧化碳的基本特征进行详细描述的基础上，介绍了在
沉水植物光合作用研究中广泛应用的电化学方法——pH．stat法和 pH．drift法的原理，并给出了应用实例。这两种
测定水生植物光合作用的电化学方法所依据的溶液无机碳浓度的变化可以利用 Gran滴定法方便地计算出来。
关键词：沉水植物；光合作用；pH—stat；pH—drift；格兰氏滴定
中图分类号：Q一33 文献标识码 ：A 文章编号：1000—470X(2008)01—0099—05
The Electrochemical M ethods M easuring Photosynthesis
of Submerged M acrophytes
LI Wei ．YIN Li-Yan
(Laboratory ofAquatic Plant Biology，Wuhan Botanical Garden，The Chinese Academy ofSciences，Wuhan 430074，China)
Abstract：Measuring photosynthesis rate accurately is very important in photosynthesis studies．However
it is difficult to use the common measuring methods developed in land plant studies for the measurement of
photosynthesis of submerged macrophytes because of their special habitat．In this paper，the characteristics
of dissolved inorganic carbon is described in detail before the introduction of the principles of pH-stat and
pH-drift— the electrochemical methods measuring photosynthesis of submerged aquatic macrophytes． I11e
chan ges of inorganic carbon in water solutions of the two methods can be easily calculated by Gran-
titration．
Key words：Submerged macrophyte；Photosynthesis；pH-stat；pH-drift；Gran titration
作为“地球上最重要的化学反应”_1j，光合作用
一 直是生命科学研究的核心问题之一。有关光合作
用速率的测量则是光合作用研究的基础。通过对植
物光合作用过程的详细研究，以及红外 CO 测定技
术的成功应用，目前已有较为完善的测定植物光合
作用速率的方法，许多商品化的光合作用测定仪也
相继出现，这极大地促进了植物光合作用的研究。
然而，目前广 泛使 用 的光 合 作 用测 定仪 器 如
LiCor 6400系列，主要用于具有气生光合作用器官的
植物，对于主要光合作用器官沉没于水中的水生植
物来说，这些仪器基本上没有用武之地。针对这些
特殊生境中的植物，研究人员也发展了一些方法来
测定其光合作用速率，如黑白瓶法 ，氧电极
法 。前者通过比较不同光照条件下培养容器中
的氧含量变化来计算水生植物的平均光合作用速
率，后者虽然直接测量培养容器中的氧气含量变化，
但沉水植物在进行光合作用时，由于不断吸收水体
无机碳而导致水溶液 pH发生变化，这使得在整个
测量过程中无机碳的量始终处于变化过程中，据此
得到的氧气产生速率不能与特定的无机碳浓度直接
相联系，表达的仍然是水生植物的平均光合作用速
率。鉴于水生植物光合作用研究的需要，国外科学
家在对水中无机碳的变化进行详细研究的基础上，
提出了水生植物光合作用测定的电化学方法，随着
该方法的建立与完善，水生植物光合作用的研究得
到了迅速的发展。与国际上的研究现状相比，国内
水生植物光合作用的研究相当滞后，原因之一就是
研究方法与研究技术的限制。本文就水生植物光合
作用测定的电化学方法 pH．stat法和 pH-drift法的
原理进行了详细的介绍，以推动相关研究的发展。
收稿 日期：2007—05—14，修回日期：2007—10—09。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30570291)；国家重点基础研究发展规划项目(2002CB412300)；中国科学院武汉植物园科技前
沿项 目。
作者简介：李伟(1967一)，男，博士，研究员，主要从事水生植物生物学、湿地生态学等方面的研究工作。
} 通讯作者(E—mail：liwei@rose．whiob．ac．cn)。
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100 武 汉 植 物 学 研 究 第 26卷
1 水体中Co：的基本特征
所有的绿色植物均具有相同的光合作用总反应
． 台仁
式：CO2+H2O (CH2O)+O2。该反应包含两个
电化学反应过程，即 CO 的吸收与 O 的释放，植物
光合速率的测定可以通过持续记录 CO 浓度的变
化和 O 浓度变化来表示。水生植物光合作用速率
测定的基本原理也是如此，然而由于水生植物所处
的生境特殊性，参与光合作用的无机碳在水中的变
化行为完全不同于大气，在水体中无机碳的含量不
象大气中那样保持着相对的稳定，而是随着环境条
件的变化发生着快速的变化，同时无机碳在水体中
的存在形式多样，而且各种形式之间由各种化学平
衡方程相互联系。因此在水生植物光合作用速率的
测定中，需要首先认识水体中二氧化碳的基本特征，
以理解相关测定方法的基本原理。
1．1 CO 参与的化学平衡
淡水和海水中溶解性的无机碳成分来源于矿物
和大气。来源于大气中的 CO 提供了可以与来源
于岩石的碱基进行反应的酸。水体也可以通过沉积
反应将溶解性碳转移到基质中，我们在溶岩地区溶
洞中看到的各种奇异瑰丽的景象就是这种沉积反应
的体现。
CO 的溶解度与温度相关，以全球 CO 浓度为
370 ppm计算，0~C时在纯水中大约有 1．10 mg·L
的CO 溶解。在 15~C时下降到 0．65 mg·L一，25~C
时仅有 0．28 mg·L～I s]。一直以来人们认为由于
水一气间的交换使得水域系统中的 CO 无法保持
过饱和或亚饱和状态。然而现在的研究表明，在世
界上的大多数湖泊中，CO 是过饱和的，其平均分压
是大气中的3倍 。
CO 在水溶液中参与许多化学平衡，大量的溶
解性无机碳(dissolved inorganic carbon，DIC)以离子
形态，如碳酸氢根HCO3-和碳酸根CO；一的形式存
在 。
首先，CO 在水溶液中溶解，由气态(g)转变成
溶解态(0q)：
CO2(g)一 CO2(0q)。
随后，溶解态的 CO 与水结合形成碳酸，并与
碳酸 H CO，之间建立如下平衡：
CO2( )+H2O — H2CO3(0q)。
在溶解 的 CO 中，仅仅只有约 1％是 以碳酸
H，cO 的形式存在。碳酸是一种弱酸，离解后产生
HCO／，随着离子强度和 pH 的下降，碳酸离解成
HCO3-的趋势也降低：
H2CO3 H +HCO3-，
离解常数 K．=4．41×10一 (25~C)。
在水体的基质富含碳酸盐的情况下，如果微生
物活动强烈，产生的 CO 水平高，H CO，离解产生
的H 将会把碳酸盐溶解，为简单起见，假设 ca 是
唯一的阳离子：
CaCO3+H2O+CO2 — Ca2 +2HCO3-。
在石灰质流域中，大约一半的 HCO3-是来源于
基质的侵蚀 (分解)，而在碳酸盐含量很低的流域
(例如火成岩、泥炭沼泽)中，几乎所有的 HCO／是
来源于呼吸作用产生的CO 。
HCO／可以进一步离解产生几乎不溶于水的
co；一：
HCO／ H +co23一．
离解常数 =4．7×10 (25℃)。
HCO／和CO；一可以水解产生 OH一：
HCO3-+H2O H2CO3+OH一，
co23一+H2O． -=HCO3-+OH一。
习惯上，在水体 中“自由态 CO ”(下文中以
co；表示)包括 CO 和 H CO，，后者仅占其中很小
的一部分。与大气中气态 CO 处于平衡状态时，水
中的自由态 CO 可以根据 CO 的溶解度及其在空
气中的分压计算出来。
水体中的“总 CO ”指的是所有无机碳(DIC)形
式的总和，即：CO 、H cO3、UCO；和cO；一。
DIC的不同离子形式的比例取决于 pH值。大
多数淡水生态系统的pH值在 6～8之间，在这些系
统中，UCO；是 DIC的主要组成部分，缓冲 pH值快
速变化的无机缓冲能力也几乎完全由HCO；提供。
当系统的pH值很高(9～10．5)时，CO；一将为系统
的缓冲能力提供一小部分贡献。在低 pH(<5．7)
水生态系统中，有很高比例的 DIC是以自由态 CO
(包括 H CO，)的形式存在，系统的缓冲能力很低，
仅存 的缓 冲能力 由 nco；提供。但 pH值低到
4．5～5时。nco；所能提供的缓冲能力几乎可以忽
略了。这时水体中能够检测的缓冲能力是由有机酸
和铝提供的。
1．2 碱度
在淡水水体中，碱度是其中碱基总量的测度，
可以用强酸滴定的方法确定，强酸滴定将中和其中
所有的羟基、碳酸根和碳酸氢根离子。因此，碱度可
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第 1期 李 伟等：沉水植物光合作用测定的电化学方法 101
以被定义为可滴定碱基的等价浓度。其他用于描
述碱基的名词有：碱库 (alkaline reserve)、总碱度
(total alkalinity)以及酸中和能力(acid neutralizing
capacity，ANC)。比较而言，ANC是更确切的定义。
较高的ANC意味着对于所添加的一定量的酸或碱
来说，pH值的变化较小，水体的缓冲能力较大。
在碳酸钙质的湖泊中，通过滴定将 pH值降低
至4．5，就可以计算出碱度，在这个 pH值下，所有的
HCO；被转化成了 H CO 。在这种滴定过程 中，
由于不能够区别特定的缓冲体系，因此最好用可
滴定碱基 的定量浓度表示碱度 [meq·L (mili．
equivalents per L)或者 Ixeq·L ]，而不要用 ppm或
mg·L～CaCO，的单位，后者虽然常用，但是其表达
的意思是水体的缓冲能力是由CO；一提供的，并且
假设钙是唯一存在的阳离子，这显然是错误的。将
以ppm CaCO 表示的碱度除以 5O即可转化为以
meq·L 表示的碱度，以这种方式表示的碱度是应
用格兰氏滴定(后详)方法计算光合作用速率所必
须的。
碱度具有保守性，其中对我们测定光合作用速
率最重要的一点就是往体系中加入，或者移出溶解
性CO，时碱度保持不变。为什么会如此，有许多解
释方法，这里我们仅仅直观地加以说明。当在具一
定碱度的水溶液中加入碳酸时，碳酸通过释放质子
而导致水体中平衡方程的改变：
H2co3--~H +HCO；，HCO；— H +co；一。
随着溶液中 H 的上升，它们将与溶液中构成
碱度的成分(碳酸盐，碳酸氢盐，硼酸盐，磷酸盐等)
结合从而使得溶液碱度下降。然而，随着每一个碳
酸分子离解产生降低碱度的 H ，将会相伴产生一
个增加碱度的HCO3-或者 CO；一，因此碱度的净变
化为零。所以在水溶液中加入碳酸时，会导致溶液
pH值的变化，及构成碱度的不同成分的变化，但是
碱度本身不会变化。然而如果加入强酸，如盐酸、硫
酸或者磷酸，情况就不是这样了，将导致溶液碱度
下降。
2 水生植物光合作用测定的电化学方法
在自然状况下，水体中的无机碳始终处于变化
过程中，其中水体中各种生物的活动均会影响无机
碳的含量和状态。因此，在自然开放状况下，通过测
定水体中无机碳或者氧气的变化来研究水生植物的
光合作用速率存在许多难以克服的困难。目前水生
植物光合作用速率的测定主要针对实验室封闭系统
开 展 。
在封闭体系中，水与大气之间的交换过程不再
存在，这种情况下，H co；(包括溶解态 CO 和碳
酸)可以被认为是一种不挥发性酸。对简单水溶性
碳酸盐溶液来说，6种溶解性成分——cO 、H CO 、
HCO3-、CO 一、H 和 OH一——在平衡浓度时的相互
依赖关系可以用一组方程加以完全描述。在封闭体
系中，由于不存在与大气之间的交换，在一定的环境
条件如一定的气压和温度下，溶解在水中的 CO 及
其参与的各个离解方程之间处于平衡状态。
水环境中水生植物对无机碳的利用依赖于以下
几个因素：总碱度，Alk=[HCO3-]+2[CO；一]+
[OH一]一[H ](equiv·In～，equiv·In～ =meq·
L )；总无机碳浓度，[c ]=[co；](自由态cO =
溶解态CO2+H2CO3)+[HCO3-]+[CO；一](mol·
Il )，([]表示浓度)。水中无机碳种类通过彼此
间的化学平衡相联系 即：CO +H O— H CO，
"HCO3-+H — co；一+2H ，pH值决定它们
存在的状态。对于一定碱度的溶液，pH值的增加将
引起[c ]下降，因此[c ]会随着 pH值发生改变。
不同pH值时总无机碳的不同组成如图 1所示 ¨。
昌
●
昌
一
0
=
矗
b
8
0
U
图 1 不同pH下无机碳存在的形态(1 meq’L～KHCO3
溶液，20~C，引自Maberly and Spence，1983 )
Fig．1 The concentrations of different DIC species
as function of pH
沉水植物光合过程的发生以水溶液为介质，水
溶液中植物光合作用 CO 的利用必然导致水体中
pH值的升高，因此可直接测定 pH值的变化，或在
维持系统 pH值稳定的状态下测定光合放氧量来测
定其光合速率。
2．1 pH-stat法的原理
Patrick等[1 进一步发展了 pH．stat法并应用到
对大型沉水植物光合作用的测定。pH-stat系统利
用碳酸(富含 CO 的溶液)作滴定剂补偿溶液 pH值
因光合作用导致的升高，使反应介质 pH值始终保
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武 汉 植 物 学 研 究 第26卷
持恒定。如果精确获知滴定剂 CO 浓度和所加滴
定剂的体积，那么可计算出光合作用植物吸收 CO
的量。从前面关于水体中 CO，的基本特征可以知
道，在一定环境条件下，pH值的恒定意味着 DIC含
量的恒定，那么在实验体系中添加的DIC即是水生
植物光合作用消耗的 DIC，因此通过对添加 DIC的
量的测定或者测定在该条件下的 O 产生速率即可
计算出水生植物的光合作用速率。在特定 pH值条
件下获得的光合作用速率就是特定无机碳浓度下的
光合作用速率。
在实际的操作中，沉水植物光合作用反应溶液
和滴定剂的总碱度，总 CO 和 自由 CO 浓度通过
Gran滴定法_1 计算，而 pH值与所加滴定剂体积的
数据对可通过计算机分析。同时光合作用过程中，
温度、光强及沉水植物光合放氧浓度可持续地通过
数据采集器(data—logger)记录反馈到已编程的计算
机内进行分析，直接得出光合放氧速率。因此 pH—
stat法可同时测出沉水植物光合反应 CO 吸收量和
光合放氧量。同样地，在测定时将光源除去，使植物
在黑暗条件下进行反应，那么即可测出其呼吸作用
速率。
pH—stat法的不足：用富含 CO：的溶液作滴定剂
时，由于会受周围大气 CO 的影响，因而可能对精
确测定其总碱度、总碳含量以及 自由CO 浓度有影
响。另外，pH—stat装置较为复杂。但该系统能精确
维持 pH值恒定，对光合放氧量的测定不失为一种
好方法。
图2是应用 pH—stat方法对水藓(Fontinalis anti—
pyretica)光合作用速率的测定结果。水藓是一种固
着生长的沉水苔藓植物，通常生长在溪流或河流的
石块上。测定时采用人工配置的碱度为 1 meq·L
的溶液培养植物，滴定液是用纯 CO 鼓气 1 min的
培养液，在测定中利用 自动电位滴定仪根据反应体
系 pH值的变化逐步添加到测定系统中以维持系统
pH值的稳定。实验过程中选用的 pH值为 6．5、
7．5、7．7、8．0和8．3，应用 Gran滴定法计算，这些
pH值状态下(20~C)所对应的自由态 CO 浓度分别
是：618．8、61．6、38．7、19．3和9．5 I~mol·L～。图
2即显示了不同自由态 CO 浓度状态下水藓光合作
用速率的变化，运用反应动力学方程进行拟合，可以
得出水藓光合作用速率随水体 自由态 CO 含量变
化的规律。结果显示当水体自由态CO 含量趋于0
时，水藓光合作用速率趋于 0，水藓不能够利用溶液
中的 HCOf进行光合作用。
图2的结果是基于植物的干重表达的，如果我
们通过其他分析得到植物的鲜重、干重、叶绿素含量
或者其他与光合作用有关酶活性之间的关系，也可
以将测定结果转化成其他单位。另外根据 Gran滴
定法也可以得出溶液中不同形态碳含量之间的关
系，根据需要也可以用不同形态的碳来表达光合作
用速率。
彗
董兰
辇
CO2 concentration(!．tnlO1·L )
图 2 水藓光合作用速率随水体自由态 CO：浓度的变化
Fig．2 Photosynthetic oxygen evolution rate as
a function offree[CO2]
2．2 pH-drift法的原理
光合作用过程中植物对无机碳的吸收会引起
pH的升高，即当除去了co；时，随着碳酸浓度的减
少溶液酸度下降，因此 pH值升高；当溶液中除去
HCO3-时，[OH一]增加，碱度仍保持不变，pH值也
上升。在恒定碱度溶液系统中，沉水植物进行光合
作用时，pH值升高直至达到稳定，此时，最终所达到
的 pH值依赖于碱度和物种对碳的吸收能力_1 ，这
种能力是判断水生植物是否具有利用 HC03-能力
的重要基础数据。pH值的升高使水中各种碳形态
之间的平衡发生转移，因此，在一封闭系统中植物本
身光合作用会引起总无机碳浓度[c ]下降并同时
会改变co；、HCO3-和 CO；一成分。总无机碳的吸
收率可通过单位时间内上升 0．01个 pH单位(如果
电极的分辨率好，可以用更精确的单位)的变化计
算。应用 Gran滴定法在各个 pH值与相应的无机
碳成分之间建立定量关系，以此为基础，获得 [c ]
在单位时间内的变化即光合速率(C 吸收率)。在
实际的操作过程中，记录 pH值的变化同样可以用
数据采集器自动进行，各种相应的计算由计算机分
析。整个试验装置若置于黑暗条件下，所测定的为
植物呼吸作用。
pH．drift法的不足：由于溶液 中碳吸收放出的
0，累积后可能会导致光呼吸发生。但是相对于
pH—stat法，其测定装置较为简单，测定条件(只需记
录pH值的变化即可)易于控制。
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第 1期 李 伟等：沉水植物光合作用测定的电化学方法 103
pH—stat方法是研究水生植物对 HCO3-的利用
能力的一个主要方法，Maberly and Madsen[14]在水
马齿属植物(Calitriche hermaphroditica)无机碳利用
方面的研究中详细表述了该方法在水生植物光合作
用研究中的应用。
2．3 Grail滴定(Gran titrations)
如上所述，无论采用哪一种测定方法，在计算时
均需要准确快速得知反应体系中 DIC的量及其变
化。现在虽然也有商品仪器(利用气体红外检测
仪)可以用来测定液体中无机碳的浓度，但是该仪
器价格昂贵，难以广泛应用。下面我们介绍利用滴
定法快速计算总碱度、总 CO 和 自由 CO 的数学
方法。
Tailing【12]将 Gran滴定法发展应用于测定淡水
总碱度、总 CO 和自由CO 浓度。Gran滴定的数学
方法 如 下：用 已知 浓 度 n的 标 准 HCI(例 如
0．100 mol·L )滴定某一样品溶液，于 pH值 7．6—
6．7范围之间与pH值4．4—3．7范围之间分别记录
3个读数。
在酸性范围(pH值 4．4—3．7)内根据每个 pH
值读数应用下面的公式计算所对应的 (反对数参
数)值：
F2=[antilog(a—pH)]·( + )。
其中，a是任何合适的数值，一般选用 5； 、
分别表示样品体积(mL)和滴定体积(mL)。( +
)是对被滴定剂所稀释的样品溶液的修正。将 3组
F 和 作图，可得一直线，其与 轴交点即为 ；
也可用回归分析得到。
在偏碱性范围(pH值 7．6—6．7)内根据每个
pH值读数应用下面的公式计算所对应的F 值：
F =[antilog(b—pH)]·( +v)／L·( 一 )。
其中，b是任何合适的数值，一般选用 8；( 一
)是对滴定中碱度下降的修正。F。对 作图或作
回归分析，得一直线与 轴交点即为 ，。交点 ，和
代表终点，在此终点之外[H co；]和无机酸浓度
在以上所示 pH值范围内，随着反对数参数值 F 和
成比例地增加。
将 和 代入下列公式，即可得到所测定样品
溶液的自由 CO 浓度、碱度和总CO 浓度：
自由CO 浓度[co；]：
V1 mmo卜L一 )： 】． 100 0．n
；
y
总碱度：，2(meq．L一 )： ． 1000．n；
总CO 浓度[c ]：
CT mmo卜L一 )：／2一V ： ．n( )。
r
以上描述了对某一 pH值条件下溶液中自由态
CO 浓度、碱度以及总碳浓度的测定过程，可以应用
于其他的pH值条件。通过这样的滴定与计算 ，可
以得出溶液中不同无机碳之间的关系，服务于光合
作用速率的计算。在实际应用中，可以编写成实用
程序，以方便各种计算。如果利用计算机控制实验
过程，就可以实现沉水植物光合作用速率测定的自
动化。
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