全 文 ：植物科学学报　 ２０１５ꎬ ３３(１): ８１~８９
Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ
　 　 ＤＯＩ:１０􀆰 １１９１３ / ＰＳＪ􀆰 ２０９５－０８３７􀆰 ２０１５􀆰 １００８１
水杨酸诱发的 ＮＯ介导了丹参悬浮培养
细胞中丹酚酸 Ｂ的生物合成
张婧一ꎬ 陈红艳ꎬ 张洪培ꎬ 朱 楠ꎬ 董娟娥∗
(西北农林科技大学生命科学学院ꎬ 陕西杨凌 ７１２１００)
摘　 要: 水杨酸(ＳＡ)可诱导丹参悬浮培养细胞中一氧化氮(ＮＯ)产生、 苯丙氨酸解氨酶(ＰＡＬ)活化及丹酚酸 Ｂ
(Ｓａｌ Ｂ)的生物合成ꎮ 为了阐明 ＮＯ对丹参悬浮培养细胞中 Ｓａｌ Ｂ 生物合成的影响及作用机理ꎬ 本实验利用 ＮＯ
供体硝普钠(ＳＮＰ)、 ＮＯ 合成酶抑制剂 Ｌ￣ＮＮＡ(Ｎω ￣ｎｉｔｒｏ￣Ｌ￣ａｒｇｉｎｉｎｅ)、 ＮＯ 淬灭剂 ｃＰＩＴＯ (ｃａｒｂｏｘｙ￣２￣ｐｈｅｎｙｌ￣４ꎬ
４ꎬ５ꎬ ５￣ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｅ￣１￣ｏｘｙｌ￣３￣ｏｘｉｄｅ) 以及 ＰＡＬ 抑制剂 Ｌ￣ＡＯＰＰ ( Ｌ￣２￣ａｍｉｎｏｏｘｙｇｅｎ￣３￣ｐｈｅｎｙｌ ａｃｒｙｌｉｃ
ａｃｉｄ)分别处理丹参悬浮培养细胞ꎬ 并对其胞内 ＮＯ 水平、 ＰＡＬ活性和 Ｓａｌ Ｂ积累量进行了检测ꎮ 结果表明ꎬ 硝
普钠(ＳＮＰ)处理显著促进了 ＮＯ产生、 ＰＡＬ活性和 Ｓａｌ Ｂ的积累ꎬ 而 Ｌ￣ＮＮＡ和 ｃＰＩＴＯ 抑制上述过程ꎬ 说明 ＮＯ
诱发 ＰＡＬ活性提高并参与了 ＳＡ诱导的 Ｓａｌ Ｂ生物合成ꎻ Ｌ￣ＡＯＰＰ显著抑制了 ＰＡＬ活性及 Ｓａｌ Ｂ积累ꎬ 却对 ＮＯ
产生没有显著影响ꎬ 揭示 ＮＯ位于 ＰＡＬ的上游ꎮ 这说明 ＳＡ诱发的 ＮＯ产生、 ＰＡＬ活化及 Ｓａｌ Ｂ合成之间存在因
果关系ꎬ 即 ＮＯ通过激活 ＰＡＬ触发 Ｓａｌ Ｂ生物合成ꎮ
关键词: 一氧化氮(ＮＯ)ꎻ 苯丙氨酸解氨酶ꎻ 水杨酸ꎻ 丹参ꎻ 丹酚酸 Ｂꎻ 信号转导
中图分类号: Ｑ９４５􀆰 ７８　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ２０９５￣０８３７(２０１５)０１￣００８１￣０９
　 　 　 收稿日期: ２０１４￣０６￣１１ꎬ 退修日期: ２０１４￣０７￣０８ꎮ
　 基金项目: 国家自然科学基金 (３１１７０２７４)ꎻ 西北农林科技大学青年骨干支持计划资助ꎮ
　 作者简介: 张婧一(１９８３－)ꎬ 女ꎬ 硕士研究生ꎬ 研究方向为药用植物学(Ｅ￣ｍａｉｌ: Ａｍｂｅｒ－－ｚｈａｎｇ＠ｈｏｔｍａｉｌ􀆰 ｃｏｍ)ꎮ
　 ∗通讯作者(Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ􀆰 Ｅ￣ｍａｉｌ: ｄｚｓｙｓ＠ｎｗｓｕａｆ􀆰 ｅｄｕ􀆰 ｃｎ)ꎮ
Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ Ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｂｙ Ｓａｌｉｃｙｌｉｃ Ａｃｉｄ Ｍｅｄｉａｔｅｓ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ
Ｓａｌｖｉａｎｏｌｉｃ Ａｃｉｄ Ｂ ｉｎ Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ
ＺＨＡＮＧ Ｊｉｎｇ￣Ｙｉꎬ ＣＨＥＮ Ｈｏｎｇ￣Ｙａｎꎬ ＺＨＡＮＧ Ｈｏｎｇ￣Ｐｅｉꎬ ＺＨＵ Ｎａｎꎬ ＤＯＮＧ Ｊｕａｎ￣Ｅ∗
(Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｙａｎｇｌｉｎｇꎬ Ｓｈａａｎｘｉ ７１２１００ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ (ＳＡ) ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ (ＮＯ) ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎꎬ Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ ａｍｍｏｎｉａ￣
ｌｙａｓｅ (ＰＡＬ) ａｃｔｉｖａｔｉｏｎꎬ ａｎｄ ｓａｌｖｉａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ Ｂ (Ｓａｌ Ｂ) ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ. Ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ
ＮＯ ｉｎ ＳＡ￣ｉｎｄｕｃｅｄ Ｓａｌ Ｂ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓꎬ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＮＯ ｄｏｎｏｒ ｓｏｄｉｕｍ ｎｉｔｒｏｐｒｕｓｓｉｄｅ (ＳＮＰ)ꎬ
ＮＯ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｌ￣ＮＮＡ(Ｎω￣ｎｉｔｒｏ￣Ｌ￣ａｒｇｉｎｉｎｅ)ꎬ ＮＯ ｓｃａｖｅｎｇｅｒ ｃａｒｂｏｘｙ￣２￣ｐｈｅｎｙｌ￣４ꎬ４ꎬ５ꎬ５￣
ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｅ￣１￣ｏｘｙｌ￣３￣ｏｘｉｄｅ (ｃＰＩＴＯ)ꎬ ａｎｄ ＰＡＬ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｌ￣ＡＯＰＰ (Ｌ￣２￣ａｍｉｎｏｏｘｙｇｅｎ￣
３￣ｐｈｅｎｙｌ ａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ) ｏｎ ＳＡ￣ｉｎｄｕｃｅｄ ＮＯ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎꎬ ＰＡＬ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎꎬ ａｎｄ Ｓａｌ Ｂ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ
ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｌｙ. Ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ＳＮＰ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ＳＡ￣ｉｎｄｕｃｅｄ ＮＯ
ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎꎬ ＰＡＬ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓａｌ Ｂ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎꎬ ｗｈｉｃｈ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ＮＯ ａｃｔｉｖａｔｅｄ
ＰＡＬ ａｎｄ ｗａｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ＳＡ￣ｉｎｄｕｃｅｄ Ｓａｌ Ｂ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ. Ｌ￣ＡＯＰＰ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ ＰＡＬ ａｃｔｉｖｉｔｙ
ａｎｄ Ｓａｌ Ｂ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎꎬ ｂｕｔ ｄｉｄ ｎｏｔ ａｆｆｅｃｔ ＳＡ￣ｉｎｄｕｃｅｄ ＮＯ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎꎬ ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｔｈａｔ ＮＯ
ａｃｔｅｄ ａｓ ａｎ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｓｉｇｎａｌ ｏｆ ＰＡＬ. Ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ａ ｃａｕｓａｌ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ
ｂｅｔｗｅｅｎ ＳＡ￣ｉｎｄｕｃｅｄ ＮＯ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎꎬ ＰＡＬ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎꎬ ａｎｄ Ｓａｌ Ｂ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｓａｌｖｉａ
ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ. Ｖｉａ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＡＬꎬ ＮＯ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｈｅ ＳＡ￣ｉｎｄｕｃｅｄ Ｓａｌ Ｂ
ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ (ＮＯ)ꎻ Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ ａｍｍｏｎｉａ￣ｌｙａｓｅ (ＰＡＬ)ꎻ Ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ (ＳＡ)ꎻ
Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａꎻ Ｓａｌｖｉａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ Ｂ (Ｓａｌ Ｂ)ꎻ Ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ
　 　 ２０ 世纪 ９０ 年代ꎬ Ｄｅｌｌｅｄｏｎｎｅ 等提出一氧化
氮(ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅꎬ ＮＯ)作为信号分子参与了拟南芥
病原菌诱导的植物获得性免疫产生[１]ꎮ 此后ꎬ 关
于 ＮＯ介导植物生长、 发育及抗逆等过程的报道日
益增多ꎮ ＮＯ 可抑制种子休眠ꎬ 促进种子萌发[２]ꎬ
促进植物根生长[３]、 延缓开花过程[４]及调节植物
细胞程序性死亡[５]等ꎬ 参与了植物从生长到衰亡
的全过程ꎮ ＮＯ也广泛参与植物抗逆反应ꎬ 如通过
控制气孔开闭抵御干旱胁迫[６]ꎬ 降低 ＲＯＳ( ｒｅａｃ￣
ｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ)水平抵御重金属胁迫[７]ꎬ 作
为钙调素 ３ (ＣａＭ ３)上游信号抵御高温胁迫[８]ꎬ
介导酚类物质合成抵御真菌侵染[９]ꎬ 提高蛋白激
酶抑制因子的生物合成抵御伤害胁迫[１０]ꎬ 促进查
尔酮合酶(ｃｈａｌｃｏｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ)基因表达抵御 ＵＶ￣Ｂ
(ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ￣Ｂ)胁迫等[１１]ꎮ
ＮＯ还可通过介导其它信号分子、 合成酶及蛋
白激酶的产生而发挥信号转导作用ꎬ 如在病原菌诱
导的苍术(Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ ｌａｎｃｅａ)植株中ꎬ ＮＯ 作为
Ｈ２Ｏ２的上游信号介导了挥发油的合成[１２]ꎻ 在连翘
(Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ ｐｅｒｆｏｒａｔｕｍ)的悬浮培养细胞中ꎬ ＮＯ
促进了茉莉酸( ｊａｓｍｏｎｉｃ ａｃｉｄꎬ ＪＡ)含量增加[１３]ꎻ
在大戟(Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｅｋｉｎｅｎｓｉｓ)悬浮培养细胞中ꎬ
真菌诱导的 ＮＯ 是内源 ＳＡ(ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ)合成的
上游信号[１４]ꎻ 在烟草叶片中ꎬ ＮＯ 通过激活环磷
酸尿苷(ｃＧＭＰ)和环 ＡＤＰ 核糖(ｃＡＤＰＲ)促进了胞
内 Ｃａ２＋通道的打开[１５]ꎮ 在红豆杉培养细胞[１６]、
银杏培养细胞[１７]及马铃薯叶片[１８]中ꎬ ＮＯ 促进了
苯丙氨酸解氨酶 (ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ ａｍｍｏｎｉａ￣ｌｙａｓｅꎬ
ＰＡＬ)活性升高ꎮ 从产生机制来看ꎬ 生物或非生物
诱导因素均可促进植物细胞 ＮＯ水平的增加ꎬ 如脱
落酸、 茉莉酸甲酯可促进保卫细胞中 ＮＯ 的合
成[１９ꎬ２０]ꎻ 寡半乳糖醛酸 ( ｏｌｉｇｏｇａｌａｃｔｕｒｏｎｉｄｅｓꎬ
ＯＧｓ)介导了拟南芥防御应答中 ＮＯ的产生[２１]ꎻ 多
胺诱导的 Ｈ２Ｏ２和 ＮＯ 共同参与了拟南芥种子的萌
发[２２]ꎮ
水杨酸(ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄꎬ ＳＡ)是一种存在于植
物体内的酚酸类物质ꎬ 内源 ＳＡ被认为是一种信号
分子ꎮ 当病原体侵染植物时ꎬ 内源 ＳＡ 可以快速积
累到较高水平ꎬ 并通过调控细胞内氧化物水平来响
应外界胁迫ꎮ 外源施加的 ＳＡ可作为诱导子激活相
关酶(抗氧化酶、 合成代谢酶)及病程基因的表达ꎬ
开启 Ｃａ２＋、 Ｈ＋通道ꎬ 增加植物次生代谢物的合成
过程ꎬ 在植物抵御盐[２３]、 重金属[２４]、 高温[２５]、
病毒[２６]、 细菌[２７]等逆境胁迫方面起重要作用ꎮ
笔者所在课题组的前期研究表明ꎬ ＳＡ 可以有
效诱导丹参悬浮培养细胞中 Ｓａｌ Ｂ的积累ꎬ 并且苯
丙氨酸解氨酶(ＰＡＬ)参与了该过程[２８]ꎮ 然而 ＳＡ
诱导 Ｓａｌ Ｂ生物合成的机制尚不清楚ꎬ 介导这一过
程的信号分子也不明确ꎮ 本研究以广泛参与植物细
胞信号转导途径的 ＮＯ为研究对象ꎬ 利用 ＮＯ淬灭
剂和 ＮＯ合酶的抑制剂改变 ＳＡ诱导的丹参悬浮培
养细胞内 ＮＯ的水平ꎬ 分析细胞内 ＮＯ 水平对 Ｓａｌ
Ｂ积累的影响ꎬ 明确 ＳＡ 诱导的 ＮＯ 是否参与丹参
悬浮培养细胞中 Ｓａｌ Ｂ的积累ꎬ 为阐明诱导子调控
植物次生代谢产物的合成机制提供依据ꎮ
１　 材料和方法
１􀆰 １　 丹参悬浮培养细胞系的建立及诱导处理
愈伤组织培养方法同 Ｄｏｎｇ 等[２８]ꎮ 将新鲜丹
参种子(采自陕西天士力植物药业有限公司商洛丹
参 ＧＡＰ药源基地)用自来水冲洗 ２ ~ ４ ｈꎬ 并用纱
布去除种子表面的蜡质层后ꎬ 再用自来水冲洗 ３
次ꎻ 在无菌操作间进行灭菌处理(７０％乙醇ꎬ ３０ ｓꎻ
０􀆰 １％ ＨｇＣｌ２ꎬ １５ ｍｉｎ)后ꎬ 将种子接种到 ＭＳ 固体
培养基上(５􀆰 ５ ｇ / Ｌ琼脂和 ３０ ｇ / Ｌ 蔗糖)ꎬ ２５℃光
照培养(１２ ~ １６ ｈ / ｄꎬ 光强 ２０００ ~ ３０００ ｌｘ)ꎻ 培
养 ６０ ｄ后ꎬ 将无菌苗叶片剪成 ０􀆰 ５ ｃｍ × ０􀆰 ５ ｃｍ
的小块ꎬ 接种于 ＭＳ固体诱导培养基上ꎬ 在光照条
件下(２４ ± ２℃ꎬ １２ ｈ)诱导形成愈伤组织ꎮ 诱导培
养基中含有 １􀆰 ０ ｍｇ / Ｌ ＮＮＡ(天津博迪化工有限公
司)、 １􀆰 ０ ｍｇ / Ｌ ６￣ＢＡ (北京康倍斯科技有限公
司)、 １􀆰 ０ ｍｇ / Ｌ ２ꎬ４￣Ｄ(北京康倍斯科技有限公
司)、 ５􀆰 ５ ｇ / Ｌ 琼脂、 ３０ ｇ / Ｌ 蔗糖ꎮ 诱导出的愈伤
组织每 ２０ ｄ继代培养一次ꎮ
取转接后培养 １５ ｄ 的丹参愈伤组织ꎬ 按愈伤
组织与培养液 １ ∶１５(Ｗ/ Ｖ)的比例转接到 ＭＳ 液体
２８ 植 物 科 学 学 报 第 ３３卷　
培养基上(不含琼脂和激素ꎬ 含 ３０ ｇ / Ｌ 蔗糖)２５℃
黑暗悬浮培养(摇床转速为 １２５ ｒ / ｍｉｎ)２ ｄꎮ 然后
分别加入双蒸水、 ０􀆰 ５ ｍｍｏｌ / Ｌ Ｌ￣ＡＯＰＰ(Ｌ￣２￣ａｍｉ￣
ｎｏｏｘｙｇｅｎ￣３￣ｐｈｅｎｙｌ ａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄꎬ ＰＡＬ 抑制剂)、
０􀆰 ５ ｍｍｏｌ / Ｌ ＳＮＰ(ＮＯ供体硝普钠)、 ２ ｍｍｏｌ / Ｌ Ｌ￣
ＮＮＡ(Ｎω￣ｎｉｔｒｏ￣Ｌ￣ａｒｇｉｎｉｎｅꎬ ＮＯ 合成酶抑制剂)或
５０ μｍｏｌ / Ｌ ｃＰＩＴＯ(ｃａｒｂｏｘｙ￣２￣ｐｈｅｎｙｌ￣４ꎬ４ꎬ５ꎬ５￣ｔｅｔ￣
ｒａｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｅ￣１￣ｏｘｙｌ￣３￣ｏｘｉｄｅꎬ ＮＯ淬灭剂)ꎬ
０􀆰 ５ ｈ后再加入 ＳＡ (２２􀆰 ５ ｍｇ / Ｌ)进行诱导处理ꎮ
１􀆰 ２　 苯丙氨酸解氨酶(ＰＡＬ)活性检测
取 ２ ｇ愈伤组织ꎬ 加入 ５ ｍＬ 提取缓冲液充分
研磨后ꎬ 以 ４层纱布过滤并于 ４℃离心(１０ ０００ ｒ /
ｍｉｎ)１５ ｍｉｎꎬ 上清液即为粗酶提取物ꎮ 反应液终
体积为 ３ ｍＬꎬ 包含 ０􀆰 ５ ｍＬ 粗酶提取物、 ０􀆰 ５ ｍＬ
Ｌ￣苯丙氨酸(１６ ｍｍｏｌ / Ｌ)、 １􀆰 ５ ｍＬ Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌ 缓冲
液 ( ｐＨ ８􀆰 ９ꎬ ５０ ｍｍｏｌ / Ｌ )、 ０􀆰 ５ ｍＬ ＮａＣｌ
(３􀆰 ６ ｍｍｏｌ / Ｌ)ꎮ 反应液在 ３７℃温育 ６０ ｍｉｎ 后以
５０ μＬ ＨＣｌ (６ ｍｏｌ / Ｌ)结束反应ꎬ 然后将反应液离
心(１０ ０００ ｒ / ｍｉｎ)１０ ｍｉｎꎬ 在 ２９０ ｎｍ 下测定上清
液吸光度ꎮ
１􀆰 ３　 ＮＯ含量检测
将 ＮＯ 氧化成亚硝酸盐ꎬ 再利用 Ｇｒｅｉｓｓ 试剂
(１％ 对氨基苯磺酸ꎬ ０􀆰１％ Ｎ￣萘基￣乙二胺ꎬ ５％ 磷
酸)测定所生成的亚硝酸盐含量ꎬ 进而推算出细胞
中 ＮＯ浓度ꎮ 丹参悬浮培养细胞经 ０􀆰 ２２ μｍ 微孔
滤膜过滤后ꎬ 取 １ ｍＬ 滤液加入 １ ｍＬ Ｇｒｅｉｓｓ 试剂
振荡混匀ꎬ 室温下放置 ３０ ｍｉｎ 后在 ５５０ ｎｍ 下测
定其吸光度ꎬ 然后根据吸光度值及 ＮａＮＯ２标准曲
线计算 ＮＯ含量ꎮ
１􀆰 ４　 丹酚酸 Ｂ(Ｓａｌ Ｂ)提取及其积累量检测
收获丹参培养物ꎬ １０００ ｒ / ｍｉｎ 离心 ５ ｍｉｎꎬ 然
后将收集的悬浮培养细胞放入 ４７℃真空干燥箱中
干燥至恒重ꎮ 取约 ０􀆰 ０５ ｇ 干燥细胞放入带塞试管
中ꎬ 用 ７０ ∶ ３０ (Ｖ / Ｖ)的甲醇￣水溶液超声波提取
４５ ｍｉｎꎻ 将提取液用 ０􀆰 ２２ μｍ微孔滤膜过滤后待检
备用ꎮ Ｓａｌ Ｂ 含量检测采用高效液相色谱法
(ＨＰＬＣ)ꎬ 色谱检测条件为: 色谱柱 ｓｈｉｍ￣ｐａｃｋ
ＶＰ￣ＯＤＳ(２５０ ｍｍ × ４􀆰 ６ ｍｍꎬ ５ μｍ)ꎬ 流动相为
甲醇￣水￣冰乙酸(体积比 ４３ ∶ ５６ ∶ １)ꎬ 流速 １ ｍＬ /
ｍｉｎꎬ 进样量 １０ μＬꎬ 检测波长 ２８１ ｎｍꎬ 柱温 ３０℃ꎮ
２　 结果与分析
２􀆰 １　 ＳＡ 对丹参悬浮培养细胞中 ＮＯ 含量、 ＰＡＬ
活性及 Ｓａｌ Ｂ积累量的影响
用 ２２ ｍｇ / Ｌ ＳＡ处理丹参悬浮培养细胞后ꎬ 按
照图 １所示时间点分别检测 ＳＡ处理后丹参悬浮培
养细胞中 ＮＯ含量、 ＰＡＬ活性及 Ｓａｌ Ｂ积累量ꎮ 结
果表明ꎬ ＳＡ处理 ４０ ｍｉｎ后 ＮＯ含量开始升高ꎬ 处
理 ４ ｈ时达到峰值(２􀆰 １１ μｍｏｌ / ｇ ＦＷ)ꎬ 其含量约
为对照组(Ｈ２Ｏ处理)的 １６􀆰 ５９ 倍(图 １: Ａ)ꎮ ＰＡＬ
活性在 ＳＡ 处理 ４ ｈ 后开始急剧升高ꎬ 至处理后
１６ ｈ时达到峰值(６９４􀆰１５ Ｕ / ｇ ＦＷ)ꎬ 其活性约为
对照组的 ５􀆰 ２２ 倍(图 １: Ｂ)ꎮ Ｓａｌ Ｂ 积累量在 ＳＡ
处理 ８ ｈ后开始升高ꎬ 至处理后 ４８ ｈ 时达到峰值
(１􀆰 ９５ ｍｇ / ｇ ＤＷ)(图 １: Ｃ)ꎮ 这说明 ＳＡ 处理使
丹参悬浮培养细胞中 ＮＯ 含量、 ＰＡＬ 活性及 Ｓａｌ Ｂ
积累量增加ꎬ 且显著高于对照组ꎬ 其中 ＮＯ 对 ＳＡ
诱导的响应最快ꎬ 其次是 ＰＡＬꎬ 而 Ｓａｌ Ｂ积累晚于
ＮＯ产生和 ＰＡＬ活化ꎮ
２􀆰 ２　 ＮＯ供体 ＳＮＰ对丹参悬浮培养细胞中 ＮＯ含
量、 ＰＡＬ活性及 Ｓａｌ Ｂ积累量的影响
由图 １可见ꎬ ＳＡ 诱导的丹参悬浮培养细胞内
ＮＯ含量增加先于 Ｓａｌ Ｂ积累量增加ꎬ 为了明确 ＳＡ
诱导的 ＮＯ含量增加是否与 Ｓａｌ Ｂ的积累有关ꎬ 我
们用 ＮＯ 供体硝普钠 ( ｓｏｄｉｕｍ ｎｉｔｒｏｐｒｕｓｓｉｄｅꎬ
ＳＮＰ)和 ＳＡ 处理丹参悬浮培养细胞ꎬ 并分别检测
其胞内 ＮＯ水平和 Ｓａｌ Ｂ 积累量(图 ２: Ａ)ꎬ 同时
分析了 ＳＮＰ对 ＰＡＬ活性的影响(图 ２: Ｂ)ꎮ
与对照组(Ｈ２Ｏ 处理)相比ꎬ ＳＮＰ 处理丹参悬
浮培养细胞后其胞内 ＮＯ水平和 Ｓａｌ Ｂ积累量显著
提高ꎬ 分别为对照组的 ３􀆰 ４７倍和 ７􀆰 ０５ 倍ꎻ 与 ＳＡ
诱导组相比ꎬ ＳＮＰ与 ＳＡ联合处理丹参悬浮培养细
胞后ꎬ 其胞内 ＮＯ含量(４􀆰 ４４ μｍｏｌ / ｇ ＦＷ)和 Ｓａｌ Ｂ
积累量(０􀆰 ６４ ｍｇ / ｇＤＷ)显著提高(图 ２: Ａ)ꎮ 这
说明 ＳＮＰ与 ＳＡ均可以促进 ＮＯ的产生及 Ｓａｌ Ｂ积
累ꎬ 且 ＳＮＰ与 ＳＡ有协同作用ꎮ
与对照组(Ｈ２Ｏ处理)相比ꎬ ＳＮＰ处理丹参悬浮
培养细胞后其胞内 ＰＡＬ活性由 １０３􀆰８９ Ｕ / ｇ ＦＷ增加
至 ３１６􀆰 ６８ Ｕ / ｇ ＦＷꎮ 与 ＳＡ 诱导组 ( ６９３􀆰０３ Ｕ /
ｇ ＦＷ)相比ꎬ ＳＮＰ与 ＳＡ联合处理丹参悬浮培养细
３８　 第 １期　 　 　 　 　 　 　 张婧一等: 水杨酸诱发的 ＮＯ介导了丹参悬浮培养细胞中丹酚酸 Ｂ的生物合成
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图 １　 ＳＡ对丹参悬浮培养细胞中 ＮＯ含量、 ＰＡＬ活性及 Ｓａｌ Ｂ积累量的影响
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｏｎ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｃｏｎｔｅｎｔꎬ ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ ａｍｍｏｎｉａ￣ｌｙａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙꎬ
ａｎｄ ｓａｌｖｉａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ Ｂ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｅｌｌｓ
４８ 植 物 科 学 学 报 第 ３３卷　
Control SA SNP SA+SNP
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!" Treatment
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S
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B

(
)
(
)
图中不同小写字母表示在 Ｐ < ０􀆰 ０５水平上差异显著ꎮ 下同ꎮ
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｏｗｅｒｃａｓｅ ｏｎ ｈｉｓｔｏｇｒａｍｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉｎｄｉ￣
ｃａｔｅｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ａｔ Ｐ < ０􀆰 ０５. ＳＡ: Ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ.
Ｓａｍｅ ｂｅｌｏｗ.
图 ２　 ＳＮＰ对丹参悬浮培养细胞中 ＮＯ含量、
Ｓａｌ Ｂ积累量及 ＰＡＬ活性的影响
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｏｄｉｕｍ ｎｉｔｒｏｐｒｕｓｓｉｄｅ ｏｎ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ
ｃｏｎｔｅｎｔꎬ ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ ａｍｍｏｎｉａ￣ｌｙａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙꎬ
ａｎｄ ｓａｌｖｉａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ Ｂ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ
Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｅｌｌｓ
胞后其胞内 ＰＡＬ活性显著提高至 ８２０􀆰 １９ Ｕ / ｇ ＦＷ
(图 ２: Ｂ)ꎮ 这说明 ＳＮＰ和 ＳＡ可协同促进 ＰＡＬ活
化ꎮ
２􀆰 ３　 ＮＯＳ抑制剂 Ｌ￣ＮＮＡ 对丹参悬浮培养细胞中
ＳＡ诱导的 ＮＯ含量、 ＰＡＬ 活性及 Ｓａｌ Ｂ 积累量的
影响
Ｌ￣ＮＮＡ ( Ｎω￣ｎｉｔｒｏ￣Ｌ￣ａｒｇｉｎｉｎｅ ) 是 ＮＯ 合 酶
(ＮＯＳ)的抑制剂ꎬ 能够有效抑制 ＮＯＳ 活性从而抑
制 ＮＯ产生ꎮ 图 ２ 中用 ＮＯ 的供体 ＳＮＰ 处理丹参
悬浮培养细胞提高了胞内 Ｓａｌ Ｂ 的积累量ꎬ 暗示
ＮＯ与 Ｓａｌ Ｂ的积累有关ꎮ 为了进一步说明 ＳＡ 诱
发的 ＮＯ 产生能促进 Ｓａｌ Ｂ 的积累ꎬ 我们用
２ ｍｍｏｌ / Ｌ Ｌ￣ＮＮＡ 抑制 ＮＯＳ 活性并检测丹参悬浮
培养细胞中 Ｓａｌ Ｂ 积累量的变化(图 ３: Ａ)ꎬ 同时
分析 ＳＮＰ对 ＰＡＬ活性的影响(图 ３: Ｂ)ꎮ
与对照组(Ｈ２Ｏ 处理)相比ꎬ Ｌ￣ＮＮＡ 处理丹参
悬浮培养细胞后其胞内 ＮＯ水平和 Ｓａｌ Ｂ积累量无
显著变化ꎮ 与 ＳＡ诱导组相比ꎬ Ｌ￣ＮＮＡ 与 ＳＡ 联合
处理丹参悬浮培养细胞后其胞内 ＮＯ含量显著降低
(仅为 ＳＡ 诱导组的 ３５􀆰２１％)ꎬ Ｓａｌ Ｂ 的积累量也
显著降低为 ＳＡ诱导组的 ２４􀆰５３％(图 ３: Ａ)ꎮ 这说
明 Ｌ￣ＮＮＡ 处理显著抑制了 ＳＡ 诱发的 ＮＯ 产生ꎬ
从而抑制了 Ｓａｌ Ｂ积累量的增加ꎮ
与对照组(Ｈ２Ｏ 处理)相比ꎬ Ｌ￣ＮＮＡ 处理丹参
悬浮培养细胞后其胞内 ＰＡＬ 活性略有降低ꎻ 与 ＳＡ
诱导组相比ꎬ ＰＡＬ活性也显著降低ꎬ 仅为 ＳＡ诱导
组的 ４０􀆰 ８０％(图 ３: Ｂ)ꎮ 这说明 Ｌ￣ＮＮＡ可以有效
抑制 ＳＡ诱导的 ＰＡＬ活性提高ꎮ
Control SA L-NNA L-NNA+SA
0.0
1.0
2.0
3.0
0.0
0.2
0.4
0.6NO
Sal B
A
a a
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e
d d
!" Treatment
!" Treatment
Control SA L-NNA L-NNA+SA
0.0
100.0
200.0
300.0
400.0
500.0 B
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a
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图 ３　 Ｌ￣ＮＮＡ对丹参悬浮培养细胞中 ＮＯ含量、
Ｓａｌ Ｂ积累量及 ＰＡＬ活性的影响
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｌ￣ＮＮＡ (Ｎω ￣ｎｉｔｒｏ￣Ｌ￣ａｒｇｉｎｉｎｅ) ｏｎ ｎｉｔｒｉｃ
ｏｘｉｄｅ ｃｏｎｔｅｎｔꎬ ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ ａｍｍｏｎｉａ￣ｌｙａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙꎬ
ａｎｄ ｓａｌｖｉａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ Ｂ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ
Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｅｌｌｓ
２􀆰 ４　 ＮＯ淬灭剂对 ＳＡ 诱导的丹参悬浮培养细胞
中 ＮＯ含量、 ＰＡＬ活性及 Ｓａｌ Ｂ积累量的影响
ｃＰＩＴＯ是 ＮＯ淬灭剂ꎬ 它能够有效清除细胞内
的 ＮＯꎮ 为了明确 ＳＡ 诱导产生的 ＮＯ 对 ＰＡＬ 活性
和 Ｓａｌ Ｂ生物合成的影响ꎬ 我们用 ＳＡ和 ５０ μｍｏｌ / Ｌ
ｃＰＩＴＯ处理丹参悬浮培养细胞并检测其胞内 ＮＯ水
平、 ＰＡＬ活性及 Ｓａｌ Ｂ积累量的变化ꎮ
与对照组(Ｈ２Ｏ 处理)相比ꎬ ｃＰＩＴＯ 处理丹参
悬浮培养细胞后其胞内 ＮＯ水平及 Ｓａｌ Ｂ积累量均
无显著变化ꎮ 与 ＳＡ 诱导组相比ꎬ ｃＰＩＴＯ 与 ＳＡ 联
合处理丹参悬浮培养细胞后其胞内 ＮＯ含量显著降
低(仅为 ＳＡ诱导组的 ２６􀆰 ２２％)ꎬ Ｓａｌ Ｂ的积累量也
显著降低ꎬ 仅为 ＳＡ 诱导组的 １８􀆰 ７５％(图 ４: Ａ)ꎮ
这说明 ｃＰＩＴＯ处理显著抑制了 ＳＡ诱导的丹参悬浮
５８　 第 １期　 　 　 　 　 　 　 张婧一等: 水杨酸诱发的 ＮＯ介导了丹参悬浮培养细胞中丹酚酸 Ｂ的生物合成
培养细胞中 ＮＯ产生ꎬ 从而抑制 Ｓａｌ Ｂ积累量的增
加ꎮ
与对照组(Ｈ２Ｏ 处理)相比ꎬ ｃＰＩＴＯ 处理丹参
悬浮培养细胞后其胞内 ＰＡＬ 活性略有降低ꎻ 与 ＳＡ
诱导组相比ꎬ ｃＰＩＴＯ与 ＳＡ联合处理丹参悬浮培养
细胞后其胞内 ＰＡＬ活性由 ３８１􀆰２９ Ｕ / ｇ ＦＷ 降低至
１６１􀆰７５ Ｕ / ｇ ＦＷꎬ 下降幅度达 ５７􀆰 ５８％(图 ４: Ｂ)ꎮ
这说明 ｃＰＩＴＯ可以抑制 ＳＡ诱导的丹参悬浮培养细
胞中 ＰＡＬ活性提高ꎮ
Control SA cPITO cPITO+SA
0.0
1.0
2.0
3.0
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8NO
Sal B
A
a a
a
b
c
d
c c
Control SA cPITO cPITO+SA
0.0
100.0
200.0
300.0
400.0
500.0 B
a a
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c
!" Treatment
!" Treatment
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)
(
)
ｃＰＩＴＯ: ｃａｒｂｏｘｙ￣２￣ｐｈｅｎｙｌ￣４ꎬ４ꎬ５ꎬ５￣ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｅ￣１￣ｏｘｙｌ￣３￣
ｏｘｉｄｅ.
图 ４　 ｃＰＩＴＯ对丹参悬浮培养细胞中 ＮＯ含量、 Ｓａｌ Ｂ
积累量及 ＰＡＬ活性的影响
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃＰＩＴＯ ｏｎ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｃｏｎｔｅｎｔꎬ
ｐｈｅｎｙｌａ￣ｌａｎｉｎｅ ａｍｍｏｎｉａ￣ｌｙａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙꎬ
ａｎｄ ｓａｌｖｉａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ Ｂ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ
Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｅｌｌｓ
２􀆰 ５　 ＰＡＬ抑制剂 Ｌ￣ＡＯＰＰ 对 ＳＡ 诱导的丹参悬浮
培养细胞中 ＮＯ含量、 ＰＡＬ活性及 Ｓａｌ Ｂ积累量的
影响
为了进一步明确 ＰＡＬ 活性变化与 Ｓａｌ Ｂ 积累
量之间的关系ꎬ 我们用 ０􀆰 ５ ｍｍｏｌ / Ｌ Ｌ￣ＡＯＰＰ(Ｌ￣２￣
ａｍｉｎｏｏｘｙｇｅｎ￣３￣ｐｈｅｎｙｌ ａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄꎬ ＰＡＬ 专一性
抑制剂)处理丹参悬浮培养细胞并检测其胞内 ＰＡＬ
活性和 Ｓａｌ Ｂ 积累量ꎮ 结果表明ꎬ 与对照组(Ｈ２Ｏ
处理)相比ꎬ Ｌ￣ＡＯＰＰ 处理丹参悬浮培养细胞后对
其胞内 ＰＡＬ活性及 Ｓａｌ Ｂ 积累量均有显著抑制作
用ꎮ 与 ＳＡ 诱导组相比ꎬ Ｌ￣ＡＯＰＰ 与 ＳＡ 联合处理
丹参悬浮培养细胞后其胞内 ＰＡＬ活性由 ６９３􀆰 ０３ Ｕ /
ｇ ＦＷ降低至 １００􀆰 ８７ Ｕ / ｇ ＦＷꎬ 即下降了 ８５􀆰４５％ꎻ
Ｓａｌ Ｂ积累量也由 ０􀆰 ５０ ｍｇ / ｇ ＤＷ降至 ０􀆰 ０９ ｍｇ / ｇ
ＤＷꎬ 即下降了 ８２􀆰００％ (图 ５: Ａ)ꎮ 这说明 Ｌ￣
ＡＯＰＰ可以有效抑制 ＳＡ 诱导的丹参悬浮培养细胞
中 ＰＡＬ活化ꎬ 从而使 Ｓａｌ Ｂ积累量减少ꎮ
当丹参悬浮培养细胞内产生的 ＮＯ 水平下降
时ꎬ ＰＡＬ活性和 Ｓａｌ Ｂ 的积累量也显著降低ꎬ 但
ＰＡＬ活化是否影响丹参悬浮培养细胞内 ＮＯ 水平
尚不清楚ꎮ 用 Ｌ￣ＡＯＰＰ 处理丹参悬浮培养细胞后
并检测其胞内 ＮＯ 水平发现ꎬ 与对照组(Ｈ２Ｏ 处
理)相比ꎬ Ｌ￣ＡＯＰＰ 处理丹参悬浮培养细胞后其胞
内 ＮＯ 水平无显著变化ꎻ 与 ＳＡ 诱导组相比ꎬ Ｌ￣
ＡＯＰＰ 和 ＳＡ联合处理丹参悬浮培养细胞后其胞
内 ＮＯ 含量也无显著变化 (图 ５: Ｂ)ꎮ 这说明
ＰＡＬ活性变化不影响 ＳＡ 诱发的丹参悬浮培养细
胞中 ＮＯ产生ꎮ
３　 讨论
植物抵御逆境胁迫往往伴随次生代谢物的积
Control SA L-AOPP L-AOPP+SA
0.0
200.0
400.0
600.0
800.0
0.0
0.2
0.4
0.6PAL
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Control SA L-AOPP L-AOPP+SA
0
1
2
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!" Treatment
!" Treatment
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)
(
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Ｌ￣ＡＯＰＰ: Ｌ￣２￣ａｍｉｎｏｏｘｙｇｅｎ￣３￣ｐｈｅｎｙｌ ａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ.
图 ５　 Ｌ￣ＡＯＰＰ对丹参悬浮培养细胞中 ＰＡＬ活性、 Ｓａｌ Ｂ
积累量及 ＮＯ含量的影响
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｌ￣ＡＯＰＰ ｏｎ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｃｏｎｔｅｎｔꎬ
ｐｈｅｎｙｌａ￣ｌａｎｉｎｅ ａｍｍｏｎｉａ￣ｌｙａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙꎬ
ａｎｄ ｓａｌｖｉａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ Ｂ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ
Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｅｌｌｓ
６８ 植 物 科 学 学 报 第 ３３卷　
累ꎮ 作为广泛参与植物逆境应答的信号分子ꎬ ＮＯ
调控植物细胞次生代谢途径的信号转导ꎮ Ｍｏｄｏｌｏ
等用 ＮＯ处理大豆种子ꎬ 发现外源 ＮＯ可以提高大
豆种子发芽点黄酮和异黄酮类物质的含量[２９]ꎮ 人
参(Ｐａｎａｘ ｇｉｎｓｅｎｇ)根培养细胞中ꎬ ＳＡ诱发的 ＮＯ
迸发与人参皂甙积累量呈正相关[３０]ꎮ 以桔青霉
(Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ)细胞壁制备的真菌诱导子可
以诱发长春花(Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ)培养细胞中
ＮＯ迸发ꎬ 而 ＮＯ专一性淬灭剂 ｃＰＩＴＯ 不仅可以抑
制 ＮＯ迸发ꎬ 还能够阻断真菌诱导子对胞内长春花
碱生物合成的促进作用ꎬ 表明 ＮＯ合成积累是桔青
霉细胞壁诱导子诱发长春花碱生物合成的必要条
件[１３]ꎮ 此外ꎬ 在内生菌诱导的大戟 ( Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ
ｐｅｋｉｎｅｎｓｉｓ)悬浮培养细胞中ꎬ ＮＯ介导了异大戟素
的生物合成[１４]ꎮ 在真菌诱导的苍术(Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ
ｌａｎｃｅａ)植株中ꎬ ＮＯ 参与调控挥发油的合成积
累[１２]ꎮ 本研究结果也表明ꎬ ＳＡ诱导丹参悬浮培养
细胞后其胞内 ＮＯ 含量、 Ｓａｌ Ｂ 积累量均显著提
高ꎻ ＮＯ抑制剂 Ｌ￣ＮＮＡ 或 ＮＯ 淬灭剂 ｃＰＩＴＯ 处理
显著抑制了 ＳＡ 诱发的丹参悬浮培养细胞中 Ｓａｌ Ｂ
积累量提高ꎬ ＮＯ供体 ＳＮＰ处理则显著提高了 Ｓａｌ
Ｂ积累量ꎮ 说明 ＳＡ诱发的 ＮＯ 产生是丹参悬浮培
养细胞中 Ｓａｌ Ｂ生物合成信号转导途径中所必需的
信号分子ꎮ
ＰＡＬ是苯丙烷代谢途径的限速酶ꎬ 它参与了
黄酮类、 生物碱类及萜类等次生代谢物的合成ꎮ
Ｄｏｎｇ等研究表明ꎬ ＰＡＬ 是 ＳＡ 诱导的丹参悬浮培
养细胞中 Ｓａｌ Ｂ 生物合成途径中的关键酶[２８]ꎬ 但
在 Ｓａｌ Ｂ 合成途径中 ＰＡＬ 如何被激活却不清楚ꎮ
ＵＶ￣Ｂ诱导的银杏 (Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ)培养细胞中ꎬ
ＮＯ是 ＰＡＬ 的上游信号ꎬ 它通过调控 ＰＡＬ 活性介
导了类黄酮类物质的合成[１７]ꎮ 在红豆杉 ( Ｔａｘｕｓ
ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ)培养细胞紫杉醇的合成积累中ꎬ ＮＯ 通
过促进茉莉酸甲酯合成提高了 ＰＡＬ 活性[１６]ꎮ 在马
铃薯叶片中ꎬ ＮＯ通过提高伤害部位 ＰＡＬ表达参与
了马铃薯叶片对伤害胁迫的响应[１８]ꎮ 本实验中 ＳＡ
诱发的 ＮＯ含量达到峰值的时间为处理后 ４ ｈꎬ 早
于 ＰＡＬ活性达到峰值的时间(处理后 １６ ｈ)ꎻ 同
时ꎬ ＳＮＰ 处理显著提高了丹参悬浮培养细胞中
ＰＡＬ活性ꎬ ＮＯ抑制剂 Ｌ￣ＮＮＡ及 ＮＯ淬灭剂ｃＰＩＴＯ
有效抑制了该合成酶的活性ꎬ 但 ＰＡＬ 抑制剂处理
并未对丹参悬浮培养细胞内 ＮＯ 水平产生显著影
响ꎮ 这说明 ＳＡ诱发的 ＮＯ位于 ＰＡＬ 上游ꎬ 且 ＮＯ
通过调控 ＰＡＬ活性参与调控 Ｓａｌ Ｂ的生物合成ꎮ
植物体内次生代谢物质的合成是受细胞内部相
关信号分子调控的一系列复杂的生化反应过程ꎬ
ＳＡ作为外源诱导子本身并不能直接参与细胞内的
次生代谢过程ꎬ 因此在植物细胞内必然存在着相应
的信号转导机制来感受并传递该诱导信号ꎮ 本研究
表明ꎬ ＳＡ诱发的 ＮＯ是丹参悬浮培养细胞中 Ｓａｌ Ｂ
生物合成信号转导途径中所必需的信号分子ꎻ ＮＯ
位于 ＰＡＬ上游ꎬ 并通过调控 ＰＡＬ 活性参与 Ｓａｌ Ｂ
的生物合成ꎮ 本实验虽然明确了 ＮＯ作为信号分子
调控丹参悬浮培养细胞中 Ｓａｌ Ｂ生物合成ꎬ 但其信
号途径的组成(如 ＮＯ 受体)及与其它信号转导途
径之间的关系尚不清楚ꎻ 当 ＮＯ等信号分子完成信
号转导过程后ꎬ 该信号如何被清除等还有待进一步
深入研究ꎮ
参考文献:
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ｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ [ Ｊ] . Ａｎｎ Ｂｏｔꎬ
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ｓｐｏｎｓｅｓ: ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｒｏｌｅｓ ｆｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙ￣
ｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ａｎｄ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ[Ｊ] . Ｆｅｂｓ Ｌｅｔｔꎬ ２００１ꎬ
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ｄｏｐｈｙｔｅ￣ｉｎｄｕｃｅｄ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｏｉｌ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ａｔｒａｃ￣
ｔｙｌｏｄｅｓ ｌａｎｃｅａ ｐｌａｎｔｌｅｔｓ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｎｉｔｒｉｃ
ｏｘｉｄｅꎬ ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｏｘｉｄｅ[ Ｊ] .
Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍꎬ ２０１１ꎬ ４６(３): ７３０－７３５.
[１３] 　 Ｘｕ ＭＪꎬ Ｄｏｎｇ ＪＦ. Ｅｌｉｃｉｔｏｒ￣ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｂｕｒｓｔ
ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｃａｔｈａｒａｎｔｈｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ
Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｅｌｌｓ [ Ｊ] . Ａｐｐｌ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔꎬ ２００５ꎬ ６７(１): ４０－４４.
[１４] 　 Ｇａｏ ＦＫꎬ Ｒｅｎ ＣＧꎬ Ｄａｉ ＣＣ. Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｎｉ￣
ｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅꎬ ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄꎬ ａｎｄ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅ￣
ｃｉｅｓ ｏｎ ｉｓｏｅｕｐｈｐｅｋｉｎｅｎｓｉｎ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｕ￣
ｐｈｏｒｂｉａ ｐｅｋｉｎｅｎｓｉｓ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ａｎ
ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇａｌ ｅｌｉｃｉｔｏｒ[ Ｊ] . Ｊ Ｐｌａｎｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｒｅ￣
ｇｕｌꎬ ２０１２ꎬ ３１(４): ４９０－４９７.
[１５] 　 Ｄｕｒｎｅｒ Ｊꎬ Ｗｅｎｄｅｈｅｎｎｅ Ｄꎬ Ｋｌｅｓｓｉｇ ＤＦ. Ｄｅｆｅｎｓｅ
ｇｅｎｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｏｂａｃｃｏ ｂｙ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅꎬ ｃｙｃｌｉｃ
ＧＭＰꎬ ａｎｄ ｃｙｃｌｉｃ ＡＤＰ￣ｒｉｂｏｓｅ[ Ｊ] . Ｐｏｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉꎬ
１９９８ꎬ ９５(１７): １０３２８－１０３３３.
[１６] 　 徐茂军ꎬ 董菊芳ꎬ 朱睦元. ＮＯ参与真菌诱导子对红
豆杉悬浮细胞中 ＰＡＬ活化和紫杉醇生物合成的促进
作用[Ｊ] . 科学通报ꎬ ２００４ꎬ ４９(７): ６６７－６７２.
[１７] 　 Ｈａｏ Ｇꎬ Ｄｕ Ｘꎬ Ｚｈａｏ Ｆꎬ Ｓｈｉ Ｒꎬ Ｗａｎｇ Ｊ. Ｒｏｌｅ ｏｆ ｎｉ￣
ｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｉｎ ＵＶ￣Ｂ￣ｉｎｄｕｃｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＡＬ ａｎｄ
ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｌａｖｏｎｏｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉ￣
ｌｏｂａ ｃａｌｌｕｓ [ Ｊ ] . Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔꎬ
２００９ꎬ ９７(２): １７５－１８５.
[１８] 　 Ｐａｒíｓ Ｒꎬ Ｌａｍａｔｔｉｎａ Ｌꎬ Ｃａｓａｌｏｎｇｕé ＣＡ. Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ
ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｔｈｅ ｗｏｕｎｄ￣ｈｅａｌｉｎｇ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ ｐｏｔａｔｏ
ｌｅａｆｌｅｔｓ[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍꎬ ２００７ꎬ ４５(１):
８０－８６.
[１９] 　 Ｄｅｓｉｋａｎ Ｒꎬ Ｃｈｅｕｎｇ ＭＫꎬ Ｂｒｉｇｈｔ Ｊꎬ Ｈｅｎｓｏｎ Ｄꎬ
Ｈａｎｃｏｃｋ ＪＴꎬ Ｎｅｉｌｌ ＳＪ. ＡＢＡꎬ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｏｘｉｄｅ
ａｎｄ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｉｎ ｓｔｏｍａｔａｌ ｇｕａｒｄ ｃｅｌｌｓ
[Ｊ] . Ｊ Ｅｘｐ Ｂｏｔꎬ ２００４ꎬ ３９５(５５): ２０５－２１２.
[２０] 　 Ｗａｎｇ ＪＷꎬ Ｗｕ ＪＹ. Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｉｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｍｅｔｈ￣
ｙｌ ｊａｓｍｏｎａｔｅ￣ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｅｆｅｎｓｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｎｄ ｓｅ￣
ｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｔａｘｕｓ ｃｅｌｌｓ [ Ｊ] .
Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌꎬ ２００５ꎬ ４６(６): ９２３－９３０.
[２１] 　 Ｒａｓｕｌ Ｓꎬ Ｄｕｂｒｅｕｉｌ￣Ｍａｕｒｉｚｉ Ｃꎬ Ｌａｍｏｔｔｅ Ｏꎬ Ｋｏｅｎ Ｅꎬ
Ｐｏｉｎｓｓｏｔ Ｂꎬ Ａｌｃａｒａｚ Ｇꎬ Ｗｅｎｄｅｈｅｎｎｅ Ｄꎬ Ｊｅａｎｄｒｏｚ
Ｓ. Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｏｌｉｇｏｇａｌａｃｔｕ￣
ｒｏｎｉｄｅ￣ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｂｏｔｒｙ￣
ｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ[ Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ
Ｅｎｖｉｒｏꎬ ２０１２ꎬ ３５(８): １４８３－１４９９.
[２２] 　 Ｔｕｎ ＮＮꎬ Ｓａｎｔａ￣Ｃａｔａｒｉｎａ Ｃꎬ Ｂｅｇｕｍ Ｔꎬ Ｓｉｌｖｅｉｒａ Ｖꎬ
Ｈａｎｄｒｏ Ｗꎬ Ｆｌｏｈ ＥＩＳꎬ Ｓｃｈｅｒｅｒ ＧＦ. Ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ ｉｎ￣
ｄｕｃｅ ｒａｐｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ (ＮＯ) ｉｎ
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ [ Ｊ ] . Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ
Ｐｈｙｓｉｏｌꎬ ２００６ꎬ ４７(３): ３４６－３５４.
[２３] 　 Ｎｏｒｅｅｎ Ｓꎬ Ａｓｈｒａｆ Ｍ. Ａｌｌｅｖｉａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｖｅｒｓｅ ｅｆｆｅｃｔｓ
ｏｆ ｓａｌｔ ｓｔｒｅｓｓ ｏｎ ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ (Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ Ｌ.)
ｂｙ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ: ｇｒｏｗｔｈ
ａｎｄ ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ[Ｊ] . Ｐａｋ Ｊ Ｂｏｔꎬ ２００８ꎬ ４０(４):
１６５７－１６６３.
[２４] 　 Ｐｏｐｏｖａ ＬＰꎬ Ｍａｓｌｅｎｋｏｖａ ＬＴꎬ Ｉｖａｎｏｖａ Ａꎬ Ｓｔｏｉｎｏｖａ
Ｚ. Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｓａｌｉｃｙｌｉｃ Ａｃｉｄ ｉｎ Ａｌｌｅｖｉａｔｉｎｇ Ｈｅａｖｙ Ｍｅｔａｌ
Ｓｔｒｅｓｓꎬ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ａｄａｐｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｓｔｒｅｓｓ Ｔｏ￣
ｌｅｒａｎｃｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｅｒａ ｏｆ Ｃｌｉｍａｔｅ Ｃｈａｎｇｅ
[Ｍ] . Ｂｅｒｌｉｎ: Ｓｐｒｉｎｇｅｒꎬ ２０１２: ４４７－４６６.
[２５] 　 Ａｉｒａｋｉ Ｍꎬ Ｌｅｔｅｒｒｉｅｒ Ｍꎬ Ｍａｔｅｏｓ ＲＭꎬ Ｖａｌｄｅｒｒａｍａ Ｒꎬ
Ｃｈａｋｉ Ｍꎬ Ｂａｒｒｏｓｏ ＪＢꎬ Ｄｅｌ Ｒｉｏ ＬＡꎬ Ｐａｌｍａ ＪＭꎬ
Ｃｏｒｐａｓ ＦＪ. Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ
ａｎｄ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ ｐｅｐｐｅｒ (Ｃａｐｓｉ￣
ｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ Ｌ.) ｐｌａｎｔｓ ｕｎｄｅｒ ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
８８ 植 物 科 学 学 报 第 ３３卷　
ｓｔｒｅｓｓ[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｖｉｒｏꎬ ２０１２ꎬ ３５(２): ２８１－
２９５.
[２６] 　 Ｋｕｎｄｕ Ｓꎬ Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ Ｄꎬ Ｐａｌ Ａ. Ｓａｌｉｃ ａｃｉｄ ａｍｅｌｉｏ￣
ｒａｔｅｓ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｖｉｇｎａ ｍｕｎｇｏ ｃｕｌｔｉｖａｒ ｔｏ ｍｕｎｇ￣
ｂｅａｎ ｙｅｌｌｏｗ ｍｏｓａｉｃ ｉｎｄｉａ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ [ Ｊ] . Ｓｃｉ
ｃｕｌｔꎬ ２０１２ꎬ ２１(３): ２３１－２３６.
[２７] 　 Ｄｏｏｒｎｂｏｓ ＲＦꎬ Ｇｅｒａａｔｓ ＢＰꎬ Ｋｕｒａｍａｅ ＥＥꎬ Ｖａｎ
Ｌｏｏｎ Ｌꎬ Ｂａｋｋｅｒ ＰＡ. Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｊａｓｍｏｎｉｃ ａｃｉｄꎬ ｅｔｈ￣
ｙｌｅｎｅꎬ ａｎｄ ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ ｒｈｉｚｏ￣
ｓｐｈｅｒｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ
[Ｊ] . Ｍｏｌ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎꎬ ２０１１ꎬ ２４ (４): ３９５ －
４０７.
[２８] 　 Ｄｏｎｇ ＪＥꎬ Ｗａｎ ＧＷꎬ Ｌｉａｎｇ ＺＳ. Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ
ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ￣ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｈｅｎｏｌｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ａｎｄ
ｒａｉｓｅｄ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ ａｎ￣
ｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ ｃｅｌｌ ｃｕｌ￣
ｔｕｒｅ[Ｊ] . Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌꎬ ２０１０ꎬ １４８(２－３): ９９－１０４.
[２９] 　 Ｍｏｄｏｌｏ ＬＶꎬ Ｃｕｎｈａ ＦＱꎬ Ｂｒａｇａ ＭＲꎬ Ｓａｌｇａｄｏ Ｉ. Ｎｉ￣
ｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ￣ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｈｙｔｏａｌｅｘｉｎ ａｃｃｕｍｕ￣
ｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｏｙｂｅａｎ ｃｏｔｙｌｅｄｏｎｓ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｔｈｅ
Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ ｐｈａｓｅｏｌｏｒｕｍ ｆ. ｓｐ. ｍｅｒｉｄｉｏｎａｌｉｓ ｅｌｉｃｉｔｏｒ
[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌꎬ ２００２ꎬ １３０(３): １２８８－１２９７.
[３０] 　 Ｔｅｗａｒｉ ＲＫꎬ Ｐａｅｋ ＫＹ. Ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ￣ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｉｔｒｉｃ
ｏｘｉｄｅ ａｎｄ ＲＯＳ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ
ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐａｎａｘ ｇｉｎｓｅｎｇ ｒｏｏｔｓ[ Ｊ] . Ｊ Ｐｌａｎｔ
Ｇｒｏｗｔｈ Ｒｅｇｕｌꎬ ２０１１ꎬ ３０(４): ３９６－４０４.
(责任编辑: 刘艳玲)
９８　 第 １期　 　 　 　 　 　 　 张婧一等: 水杨酸诱发的 ＮＯ介导了丹参悬浮培养细胞中丹酚酸 Ｂ的生物合成