全 文 ：植物科学学报　 ２０１４ꎬ ３２(５): ４７５~４８６
Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ
　 　 ＤＯＩ:１０􀆰 １１９１３ / ＰＳＪ􀆰 ２０９５－０８３７􀆰 ２０１４􀆰 ５０４７５
不同水陆环境中喜旱莲子草甲基化调控因子表达水平
和差异表达基因启动子区甲基化状态分析
邓 莹１ꎬ 高乐旋１ꎬ２ꎬ 朱 珠１ꎬ 杨 继１∗
(１􀆰 复旦大学生命科学学院ꎬ 上海 ２００４３３ꎻ ２􀆰 上海辰山植物园ꎬ 上海 ２０１６０２)
摘　 要: ＤＮＡ甲基化是一种重要的表观遗传调控方式ꎬ 参与对植物生长发育的调控ꎬ 并在植物逆境胁迫响应中
发挥作用ꎮ ＤＮＡ甲基化的建立和维持是胞嘧啶甲基转移酶、 染色质重塑酶、 组蛋白修饰因子和去甲基化因子等
协同作用的结果ꎬ 环境胁迫能诱导植物体内 ＤＮＡ甲基化状态改变ꎬ 进而改变基因表达水平和式样ꎬ 影响植物的
适应性ꎮ 喜旱莲子草是一种恶性入侵植物ꎬ 种内遗传多样性很低ꎬ 主要依靠极强的表型可塑性侵占不同水陆生
境ꎮ 对克隆繁殖的喜旱莲子草个体进行不同时间的淹水处理ꎬ 并用定量 ＰＣＲ方法检测 １６ 个 ＤＮＡ甲基化调控基
因在不同处理条件下的表达水平和变化趋势ꎬ 发现其中 １３个基因在不同处理时间点的表达水平有明显变化ꎬ 且
在淹水植株中多数基因在处理前期被强烈诱导上调表达ꎮ 运用亚硫酸氢钠测序技术对两个在不同水陆条件下明
显差异表达基因(Ｃｏｎｔｉｇ９４２和 Ｃｏｎｔｉｇ２３３３６)的上游启动子区甲基化动态进行分析ꎬ 发现启动子区多个胞嘧啶位
点的甲基化修饰状态在不同水陆条件下及淹水处理的不同时期呈现快速且可逆的动态变化ꎬ 可能影响这些基因
在不同环境条件下的表达水平ꎮ 本研究结果能帮助了解喜旱莲子草表型可塑性变异和适应性发生的分子机理ꎮ
关键词: 喜旱莲子草ꎻ 表型可塑性ꎻ 甲基化调控因子
中图分类号: Ｑ３４４＋􀆰１３　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ２０９５￣０８３７(２０１４)０５￣０４７５￣１２
　 　 　 收稿日期: ２０１４￣０４￣０８ꎬ 退修日期: ２０１４￣０５￣１４ꎮ
　 基金项目: 国家自然科学基金资助项目(３１０７０２０１)ꎻ 系统与进化植物学国家重点实验室开放课题资助项目(ＬＳＥＢ２０１１￣０８)ꎮ
　 作者简介: 邓莹(１９８８－)ꎬ 女ꎬ 硕士研究生ꎬ 主要从事植物系统和进化研究(Ｅ￣ｍａｉｌ: ｙｙｓｕｍｍｅｒ５５＠１６３􀆰 ｃｏｍ)ꎮ
　 ∗通讯作者(Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ􀆰 Ｅ￣ｍａｉｌ: ｊｉｙａｎｇ＠ｆｕｄａｎ􀆰 ｅｄｕ􀆰 ｃｎ)ꎮ
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒｓ
ａｎｄ Ｄｙｎａｍｉｃ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ Ａｌｔｅｒｎａｎｔｈｅｒａ
ｐｈｉｌｏｘｅｒｏｉｄｅｓ ｕｎｄｅｒ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｗａｔｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ
ＤＥＮＧ Ｙｉｎｇ１ꎬ ＧＡＯ Ｌｅ￣Ｘｕａｎ１ꎬ２ꎬ ＺＨＵ Ｚｈｕ１ꎬ ＹＡＮＧ Ｊｉ１∗
(１. Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｆｕｄａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００４３３ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ
２. Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｃｈｅｎｓｈａｎ Ｂｏｔａｎｉｃａｌ Ｇａｒｄｅｎꎬ Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０１６０２ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ
ｖａｒｉｏｕｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ. Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｎｚｙｍｅｓ ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅ ｉｎ ｔｈｅ ｄｙｎａｍｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ
ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ. Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｃａｎ ｂｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ
ｃａｎ ｒｅｓｕｌｔ ｉｎ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｂｙ ａｌｔｅｒｉｎｇ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｅｖｅｎｔｕａｌｌｙ ｏｎｔｏｇｅｎｅｔｉｃ
ｔｒａｊｅｃｔｏｒｙ. Ａｌｔｅｒｎａｎｔｈｅｒａ ｐｈｉｌｏｘｅｒｏｉｄｅｓ ｉｓ ａｎ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｓｐｅｃｉｅｓ ｔｈａｔ ｇｒｏｗｓ ｉｎ ａ ｖａｒｉｅｔｙ ｏｆ ｈａｂｉｔａｔｓꎬ
ｓｈｏｗｉｎｇ ｈｉｇｈ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ. Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｎ
ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｌｌｙ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ａ􀆰 ｐｈｉｌｏｘｅｒｏｉｄｅｓꎬ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ １６ ＤＮＡ
ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ ｗｅｒｅ ｍｅａｓｕｒｅｄ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｉｍｅ ｐｏｉｎｔｓ ｏｆ ｗａｔｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｕｓｉｎｇ
ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ￣ＰＣＲ. Ｔｈｉｒｔｅｅｎ ｇｅｎｅｓ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ＤＮＡ ａｎｄ ｈｉｓｔｏｎｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｗａｔｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓꎬ ｗｉｔｈ ｍｏｓｔ ｕｐ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ
ｓｔａｇｅｓ ｏｆ ｗａｔｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ. Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｗａｓ ｅｍｐｌｏｙｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ
ｏｆ ＣｐＧ ｉｓｌａｎｄｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｔｗｏ ｇｅｎｅｓꎬ Ｃｏｎｔｉｇ９４２ ａｎｄ Ｃｏｎｔｉｇ２３３３６ꎬ ｗｈｉｃｈ
ｗｅｒｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｗａｔｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ. Ｓｏｍｅ ｃｙｔｏｓｉｎｅｓꎬ
ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ ａｔ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ＣＨＨ ｓｉｔｅｓꎬ ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅｄ ｆａｓｔ ａｎｄ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ
ｓｔａｔｕｓ ｄｕｒｉｎｇ ｗａｔｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ. Ｔｈｅｓｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｐｒｏｂａｂｌｙ
ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｌｔｅｒｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ａｌｔｅｒｎａｎｔｈｅｒａ ｐｈｉｌｏｘｅｒｏｉｄｅｓꎻ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙꎻ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ
ｆａｃｔｏｒ
　 　 喜旱莲子草(Ａｌｔｅｒｎａｎｔｈｅｒａ ｐｈｉｌｏｘｅｒｏｉｄｅｓ(Ｍａｒｔ.)
Ｇｒｉｓｅｂ.)是苋科(Ａｍａｒａｎｔｈａｃｅａｅ)莲子草属多年生
宿根草本植物ꎬ 原产南美洲ꎮ 由于对不同水陆环境
有很强的适应性ꎬ 并能通过克隆生长进行快速繁
殖ꎬ 喜旱莲子草自引入中国后迅速扩散ꎬ 广泛分布
于河流、 湿地、 农田和公共绿地等多种生境中ꎬ 成
为一种恶性入侵植物ꎮ 大量研究明确了入侵中国的
喜旱莲子草种内遗传多样性较低ꎬ 主要依靠极强的
表型可塑性侵占不同生境[１]ꎮ
表型可塑性(ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ)是指同一
基因型对不同环境应答而产生不同表型的特性[２]ꎮ
对表型可塑性变异机制的研究已初步表明ꎬ 可塑性
变异的发生与发育调控基因在不同环境条件下的选
择性表达密切相关ꎻ ＤＮＡ 甲基化、 组蛋白修饰和
非编码 ＲＮＡ等表观遗传调控因子在改变基因表达
式样、 介导生物对环境的应答反应中发挥重要作
用[３－９]ꎮ
ＤＮＡ甲基化是一种重要的表观遗传调控方
式[１０]ꎬ 通常会抑制基因表达ꎬ 目前有许多研究证
明转录沉默基因的启动子区常伴随胞嘧啶甲基
化[１１ꎬ１２]ꎮ 植物体内胞嘧啶甲基化可发生在对称位
点(ＣＧ和 ＣＮＧꎬ Ｎ 为任意碱基)ꎬ 也可发生在非
对称位点(ＣＨＨꎬ Ｈ 为 Ａ、 Ｃ 或 Ｔ) [１３ꎬ１４]ꎮ 甲基化
状态由一系列 ＤＮＡ甲基化及去甲基化因子动态调
控[１３]ꎮ 植物体内至少含有三类具有不同结构和功
能的胞嘧啶甲基转移酶ꎬ 参与 ＤＮＡ 甲基化的建立
和维持[１５]ꎮ 第一类胞嘧啶甲基转移酶是甲基转移
酶(Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅꎬ ＭＥＴ)ꎬ 主要维持 ＣＧ位点
的甲基化ꎬ 是维持正常甲基化式样的关键酶ꎬ 其中
ＭＥＴ１编码一个与动物甲基转移酶 Ｄｎｍｔ１ 结构相
似的蛋白ꎻ 第二类为染色质域甲基转移酶(Ｃｈｒｏ￣
ｍｏｍｅｔｈｙｌａｓｅꎬ ＣＭＴ)ꎬ 主要保持 ＣＮＧ 位点的甲
基化ꎻ 第三类为域重排甲基转移酶 ( Ｄｏｍａｉｎｓ
Ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅꎬ ＤＲＭ)ꎬ 与哺乳
动物从头甲基转移酶家族的 Ｄｎｍｔ３ 同源[１６]ꎮ 植物
ＤＮＡ去甲基化因子包括 ＤＭＥ 家族的 ＤＥＭＥＴＥＲ
(ＤＭＥ)、 ＤＭＬ２、 ＤＭＬ３ 以及沉默抑制因子(Ｒｅ￣
ｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ １ꎬ ＲＯＳ１)ꎬ 其中 ＲＯＳ１编码
一个 ＤＮＡ转葡糖基酶蛋白ꎬ 并在所有植物组织中
广泛表达ꎬ 可通过碱基切除修复机制完成去甲基
化[１７ꎬ１８]ꎻ ＲＯＳ３同样参与调控 ＤＮＡ 去甲基化ꎬ 它
具有一个 ＲＮＡ识别结合域ꎬ 可能作用于小 ＲＮＡ介
导的 ＤＮＡ 甲基化及 ＲＯＳ１ 介导的 ＤＮＡ 去甲基
化[１９]ꎮ 此外ꎬ 染色质重塑酶 ＤＤＭ１ 和组蛋白去乙
酰化酶 ＨＤＡ６ 等在维持 ＣＧ ＤＮＡ 甲基化过程中也
具有十分重要的作用[２０ꎬ２１]ꎮ
为了解在不同水陆生境中喜旱莲子草的表型可
塑性变异是否伴随着甲基化调控因子表达水平以及
甲基化修饰状态的动态改变ꎬ 我们在水生同质园中
对克隆繁殖的喜旱莲子草个体进行不同时间的淹水
处理ꎬ 并用定量 ＰＣＲ 方法检测 １６ 个 ＤＮＡ 甲基化
调控基因在不同处理条件下的表达水平和变化趋
势ꎻ 与此同时ꎬ 基于本实验室前期研究结果选取了
两个在不同水陆条件下明显差异表达的基因(Ｃｏｎ￣
ｔｉｇ９４２和 Ｃｏｎｔｉｇ２３３３６)ꎬ 以检测甲基化调控基因
表达水平的改变是否伴随着发育调控基因甲基化修
饰状态和表达式样的改变ꎮ 其中ꎬ Ｃｏｎｔｉｇ９４２ 在喜
旱莲子草淹水处理 １ ｈ 时迅速上调表达ꎬ 并在 ３ ｈ
时达到峰值ꎬ 其后持续下调表达ꎬ 呈现“ｕｐｄｏｗｎ”
的表达模式ꎮ 该基因是拟南芥 ＥＳＫ１(Ｅｓｋｉｍｏ１)的
同源基因ꎬ 隶属 ＴＢＬ 基因家族ꎬ 该家族成员具有
保守的 ＤＵＦ２３１(Ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ｕｎｋｎｏｗｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ)及
ＴＢＬ(Ｔｒｉｃｈｏｍｅ Ｂｉｒｅｆｒｉｎｇｅｎｃｅ￣Ｌｉｋｅ)结构域ꎬ 参与
植物细胞次生壁形态建成过程[２２－２４]ꎮ 基因 Ｃｏｎ￣
ｔｉｇ２３３３６在淹水处理 １~１２ ｈ 时表达上调ꎬ 根据序
列特征判断该基因为 ＡＰ２ (Ａｐｅｔａｌａ ２)基因家族
６７４ 植 物 科 学 学 报 第 ３２卷　
ＥＲＦ(Ｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｆａｃｔｏｒ)亚家族成员ꎬ 主
要参与淹水处理相关的乙烯信号通路和可塑性生长
调控过程[２５]ꎮ 运用亚硫酸氢钠测序技术对这两个
基因上游启动子区在淹水处理过程中甲基化修饰状
态进行分析ꎬ 了解与不同水陆处理诱导的甲基化调
控因子差异表达水平及喜旱莲子草表型变异式样的
联系ꎬ 能为揭示与可塑性变异相关的表观遗传信息
形成和维持机制、 解析喜旱莲子草表型可塑性变异
发生的分子机理提供依据ꎮ
１　 材料与方法
１􀆰 １　 植物材料及同质园移栽实验
将采自野外并在复旦大学试验田中种植的喜旱
莲子草(Ａｌｔｅｒｎａｎｔｈｅｒａ ｐｈｉｌｏｘｅｒｏｉｄｅｓ)植株切成长
约 ４ ｃｍ的茎段(每茎段均带有 １~２个不定芽)后ꎬ
斜插入土壤基质(泥炭 ∶蛭石 ∶河沙 ＝１ ∶ １ ∶ １)中培
育ꎻ 待幼苗长至约 ５ ｃｍ高时ꎬ 移栽到盛有洗净的
河沙的花盆(口径 １５ ｃｍꎬ 高 １５ ｃｍ)中养护ꎮ
１􀆰 ２　 不同水陆条件设置及淹水处理
在复旦大学(３１°１４′ Ｎꎬ １２１°２９′ Ｅ)试验田中
建立两个可人工控制水分条件的同质园ꎬ 模拟喜旱
莲子草的两种野生生境ꎬ 即“水生”和“陆生”ꎮ 水
生同质园由一个长 ７ ｍ、 宽 ７ ｍ、 深 ０􀆰 ５ ｍ的人工
池塘组成ꎬ 池塘中灌注自来水ꎻ 陆生同质园是一块
地势较高且排水良好的陆地(长 １０ ｍ、 宽 ５ ｍ)ꎬ
两个同质园彼此相邻ꎮ 取 ３０ 盆喜旱莲子草置于水
生同质园人工池塘中进行完全淹水处理ꎬ 保持水面
高于土面 １０ ｃｍ以上ꎬ 另取 ３０盆置于陆生同质园
陆地上作为对照ꎮ 在淹水处理 ０、 １、 ３、 ６、 ９、
１２、 ２４、 ４８、 １２０、 ２８８ ｈ 时ꎬ 分别收集淹水处理
和陆生对照植株的茎节间材料ꎬ 每一处理时间点及
对照样品各取 １０ 个重复ꎮ 其中 ５ 份样品用 ＲＮＡ￣
ｌａｔｅｒ(Ａｍｂｉｏｎ)固定以提取总 ＲＮＡꎬ 另外 ５ 份样品
用液氮冻存以提取基因组 ＤＮＡꎮ
１􀆰 ３　 甲基化调控基因表达水平检测
１􀆰 ３􀆰 １　 总 ＲＮＡ提取
分别取淹水处理 ０、 １、 ３、 ６、 １２、 ２４、 ４８、
１２０、 ２８８ ｈ时喜旱莲子草的茎节间样品(每一处理
时间点取 ３ 个重复样品)ꎬ 用 ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ( Ｉｎ￣
ｖｉｔｒｏｇｅｎ)提取 ＲＮＡꎬ １􀆰 ２％琼脂糖凝胶电泳检测
ＲＮＡ质量ꎬ 用 ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００Ｃ( Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉ￣
ｆｉｃ)检测 ＲＮＡ浓度ꎬ 并通过 ＯＤ２６０ / ＯＤ２８０比值评价
ＲＮＡ纯度ꎮ
１􀆰 ３􀆰 ２　 ｃＤＮＡ合成
使用 ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ( ＴＡＫＡＲＡꎬ
ＤＡＬＩＡＮ)将 ＲＮＡ 反转录成 ｃＤＮＡꎮ １０ μＬ 反应体
系中含: ５ × ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ Ｂｕｆｆｅｒ ( ｆｏｒ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ)
２ μＬꎬ 总 ＲＮＡ ２ μＬ(约 ３００ ｎｇ)ꎮ 反应条件: ３７℃
温育１５ ｍｉｎꎬ ８５℃变性５ ｓꎮ ｃＤＮＡ在－２０℃下保存ꎮ
１􀆰 ３􀆰 ３　 引物设计和荧光定量 ＰＣＲ分析
根据文献资料[１５－１９]筛选出 １６ 个与 ＤＮＡ 甲基
化调控相关的基因作为检测对象(表 １)ꎬ 并依据本
实验室通过 ＲＮＡ￣Ｓｅｑ分析获得的喜旱莲子草相关
基因序列信息(未发表)设计荧光定量 ＰＣＲ 引物
(表 １)ꎬ 引物由上海生工公司合成ꎮ 以组成型表达
基因 Ｃｏｎｔｉｇ２５６４０(泛素连接酶基因 ＵＢＣ１０)作为
内参ꎬ 参照 ＴａＫａＲａ 公司荧光定量试剂盒 ＳＹＢＲ®
Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＴＭⅡ说明书ꎬ 运用 Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ￣
ｔｅｍｓ ７３００实时荧光定量 ＰＣＲ 仪检测相关基因在
不同植物样品中的表达水平ꎬ 每个样品设置 ３次技
术重复ꎮ 荧光定量 ＰＣＲ 反应体系: ｃＤＮＡ 模板
２ μＬꎬ ２ × ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＴＭ １０ μＬꎬ 正反引
物(１０ μｍｏｌ / Ｌ)各 ０􀆰 ８ μＬꎬ ５０ × ＲＯＸ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
Ｄｙｅ ０􀆰 ４ μＬꎬ ｄｄＨ２Ｏ ６ μＬꎮ 采用两步法标准程序:
９５℃ ３０ ｓꎬ ９５℃ ５ ｓꎬ ５２~６０℃ ３１ ｓꎬ ４０个循环ꎮ
荧光定量 ＰＣＲ反应完成后ꎬ 采集各个反应的
ＣＴ值(扩增产物达到设定阈值所经历的循环数)ꎬ
运用 ２－△△ＣＴ方法比较不同处理样品以及不同处理
时间点目标转录本表达量的相对变化[２６ꎬ２７] ꎮ 以未
经淹水处理的陆生同质园样品为参照因子(ｃａｌｉｂｒａ￣
ｔｏｒ)ꎬ 计算不同处理时间点目标基因在淹水处理下
相对于陆生对照样品的表达量差异ꎮ 具体步骤: 首
先计算各样品中目标基因( ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ)相对于内
参基因 ( ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ)的 ＣＴ 值差异ꎬ △ＣＴ ＝
ＣＴｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ－ＣＴｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ 然后计算淹水处理(ｐｏｎｄ)
样本中目标基因相对于对照样本(ｕｐｌａｎｄ)的△ＣＴ
差异ꎬ △△ＣＴ ＝(ＣＴｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ －ＣＴ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ) ｐｏｎｄ－
(ＣＴｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ－ＣＴ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ) ｕｐｌａｎｄꎻ 最后通过内均
一化处理ꎬ 用目标基因在淹水处理样品中相对于对
照的表达倍数(２－△△ＣＴ)来表示淹水处理(ｐｏｎｄ)相
７７４　 第 ５期　 　 邓 莹等:不同水陆环境中喜旱莲子草甲基化调控因子表达水平和差异表达基因启动子区甲基化状态分析
表 １　 表观遗传调控基因及定量 ＰＣＲ扩增引物
Ｔａｂｌｅ １　 Ａｎａｌｙｚｅｄ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ
基因 Ｇｅｎｅ
引物序列 Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ (５′－３′)
正向引物 Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒｓ (Ｆ) 反向引物 Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒｓ (Ｒ)
ＤＮＡ甲基化
ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ
ＤＲＭ１ ＴＧＡＴＧＡＴＴＣＣＴＧＧＴＣＣＴＣＡＧＡＴＴＡＴ ＣＣＡＴＴＧＣＴＡＴＴＧＡＧＡＣＴＴＣＣＴＣＣＴＴＡ
ＤＲＭ２ ＴＣＣＡＴＣＧＴＣＴＧＧＧＣＡＴＡＣＣＴＣ ＧＣＴＧＣＴＣＴＡＡＣＣＴＡＴＣＡＴＴＣＧＴＣＡ
ＭＥＴ１ ＣＣＡＧＡＴＴＧＴＴＡＣＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧ ＴＡＧＧＴＴＴＧＴＡＧＴＡＡＧＣＡＧＧＧＡＧＧＧ
ＶＩＭ１ ＧＡＴＡＧＣＡＡＡＴＡＣＧＡＧＣＧＡＣＧＡＧＴＴ ＡＡＡＴＧＧＧＴＧＧＧＴＣＡＡＧＧＧＡＡＧ
ＣＭＴ３ ＴＡＡＴＣＡＣＡＡＧＣＡＣＡＡＡＣＡＣＣＣＡＴ ＧＣＣＡＡＣＧＣＡＣＣＴＴＣＡＡＧＴＡＡＡ
ＤＣＬ２ ＴＴＣＣＧＴＴＴＧＡＡＧＡＡＴＴＡＣＣＴＧＣ ＧＡＴＡＴＧＧＧＡＧＡＣＡＴＴＡＴＧＡＣＡＡＧＡＣＡ
ＨＯＧ１ ＣＡＧＡＡＧＧＧＡＡＧＧＧＡＣＧＧＴＧＴＴ ＴＧＣＧＧＡＣＴＡＡＣＣＡＴＣＴＴＡＴＴＣＡＡＡＣ
ＲＯＳ１ ＧＴＴＣＣＴＣＴＴＣＡＡＣＣＣＴＴＡＣＣ ＧＡＡＣＡＴＴＴＴＡＣＡＧＴＧＴＣＴＴＴＴＧＧ
ＲＯＳ３ ＡＡＧＧＧＴＧＣＴＣＴＴＧＡＧＴＴＧＴＧＧＡ ＧＧＡＡＡＣＴＧＡＡＧＡＴＡＧＡＡＡＡＧＧＣＧＡＡ
染色质重塑
Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ＤＤＭ１ ＣＡＴＡＣＧＡＣＣＣＴＣＡＡＣＡＧＡＴＡＧＴＧＣ ＴＣＴＴＴＡＴＧＡＣＡＧＴＧＡＴＴＧＧＡＡＣＣＣ
组蛋白分子伴侣
Ｈｉｓｔｏｎｅ ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ＦＫＢＰ５３ ＴＣＡＡＧＡＣＣＡＡＣＡＴＣＣＣＡＡＣＣＣ ＧＧＡＡＡＡＧＡＧＣＡＴＣＴＣＧＴＧＧＡＡＡＧ
组蛋白修饰
Ｈｉｓｔｏｎｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ＫＹＰ ＡＡＣＴＡＴＴＧＣＣＡＧＴＣＴＡＡＴＴＴＣＧＣＴＴ ＧＴＴＴＴＧＣＣＡＴＧＴＴＴＣＴＧＣＣＧＴ
ＸＲ６ ＧＴＴＧＡＡＡＡＧＣＣＡＡＴＧＣＣＡＧＡＴＡＣ ＧＣＴＣＧＴＴＧＣＴＡＡＡＣＴＣＡＧＴＣＣＣＴ
ＨＤＡ６ ＧＴＧＴＴＧＧＧＴＧＧＡＧＧＡＧＧＧＴＡＴＡ ＴＣＴＴＴＣＧＧＣＧＡＧＴＴＣＴＧＧＴＴＴ
ＨＤＴ１ ＧＴＣＡＴＣＣＡＴＣＴＴＴＣＴＣＡＧＧＣＴＡＣＴＣ ＴＴＣＣＴＣＧＴＣＧＡＡＴＡＣＣＡＡＡＴＣＡＡ
ＨＡＧ２ ＧＣＴＧＣＴＣＡＡＴＣＡＣＡＴＴＧＣＣＡＴＡ ＧＧＡＡＧＡＡＡＣＴＧＡＧＡＡＡＣＴＴＧＣＧＴＣ
对于对照(ｕｐｌａｎｄ)中目标基因的相对表达量差异ꎮ
以淹水 ０ ｈ为参照因子ꎬ 分析淹水处理不同时间点
目标基因表达的相对量变化ꎮ
１􀆰 ４　 差异表达基因启动子区甲基化修饰动态分析
１􀆰 ４􀆰 １　 目标基因启动子区序列克隆
根据本实验室前期研究结果ꎬ 选取了两个在不
同水陆条件下明显差异表达的基因 Ｃｏｎｔｉｇ９４２ 和
Ｃｏｎｔｉｇ２３３３６作为目标基因ꎮ 首先基于已知序列ꎬ
运用软件 Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５􀆰 ０(ＰＲＥＭＩＥＲ Ｂｉｏｓｏｆｔ)
设计 Ｔａｉｌ ＰＣＲ引物ꎬ 以喜旱莲子草基因组 ＤＮＡ为
模板ꎬ 采 用 Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｉｎｇ Ｋｉｔ ( ＴＡＫＡＲＡꎬ
ＤＡＬＩＡＮ)进行巢式 ＰＣＲ扩增 ５′侧翼序列[２８ꎬ２９]ꎻ 在
３′端设计 ＲＡＣＥ 引物ꎬ 以喜旱莲子草总 ＲＮＡ 为模
板ꎬ 用 ３′￣Ｆｕｌｌ ＲＡＣＥ Ｃｏｒｅ Ｓｅｔ Ｖｅｒ􀆰 ２􀆰 ０(ＴＡＫＡＲＡꎬ
ＤＡＬＩＡＮ)进行巢式 ＰＣＲ扩增 ３′侧翼序列ꎮ 将得到
的扩增产物进行割胶回收后ꎬ 用 ｐＭＤ１８￣Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ
(ＴＡＫＡＲＡꎬ ＤＡＬＩＡＮ)试剂盒克隆ꎬ 并进行测序和
拼接ꎮ 运用 ＯＲＦ Ｆｉｎｄｅｒ 程序(ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. ｎｃｂｉ.
ｎｌｍ. ｎｉｈ. ｇｏｖ / ｐｒｏｊｅｃｔｓ / ｇｏｒｆ / )查找编码区起始及终
止位点ꎮ 利用植物启动子分析程序 ＴＳＳＰ (Ｐｌａｎｔ
Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍ) ( ｈｔｔｐ: / / ｌｉｎｕｘ１.
ｓｏｆｔｂｅｒｒｙ. ｃｏｍ / ｂｅｒｒｙ. ｐｈｔｍｌ? ｔｏｐｉｃ ＝ｔｓｓｐ＆ｇｒｏｕｐ ＝
ｐｒｏｇｒａｍｓ＆ｓｕｂｇｒｏｕｐ ＝ｐｒｏｍｏｔｅｒ)预测启动子区
域ꎻ 用 ＳｃａｎＷＭ￣ＰＬ ( Ｓｏｆｔｂｅｒｒｙ􀆰 Ｉｎｃ)程序搜寻植
物调控元件数据库ꎬ 查找序列中的保守元件ꎻ 用
ＭｅｔｈＰｒｉｍｅｒ 程序(ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. ｕｒｏｇｅｎｅ. ｏｒｇ / ｃｇｉ￣
ｂｉｎ / ｍｅｔｈｐｒｉｍｅｒ / ｍｅｔｈｐｒｉｍｅｒ. ｃｇｉ)分析目标基因上
游序列 ＣＧ含量及分布[３０]ꎬ 再利用 Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉ￣
ｅｒ ５􀆰 ０程序设计亚硫酸氢钠测序引物(表 ２)ꎮ
表 ２　 亚硫酸氢钠测序引物
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
基因
Ｇｅｎｅ
引物
Ｐｒｉｍｅｒ
序列 (５′－３′)
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
产物长度
Ｐｒｏｄｕｃｔ
ｌｅｎｇｔｈ
(ｂｐ)
Ｃｏｎｔｉｇ
９４２
Ｃｏｎｔｉｇ
２３３３６
Ｐ１￣Ｆ ＴＧＡＧＡＧＡＴＴＡＡＧＡＴＴＡＧＧＧＧＴＧＴＧＴＡＡ
Ｐ１￣Ｒ ＡＴＣＣＴＡＡＣＣＣＴＲＡＡＴＴＴＴＣＣＡＴＴＣＣ
Ｐ２￣Ｆ ＧＡＡＴＧＧＡＡＡＡＴＴＹＡＧＧＧＴＴＡＧＧＡＴ
Ｐ２￣Ｒ ＴＴＡＡＡＡＣＲＴＣＡＣＡＡＴＣＣＡＴＡＡＡＴＴＡＴＴＡ
Ｐ３￣Ｆ ＡＴＡＹＴＴＴＴＡＴＴＴＴＡＧＴＴＧＡＡＡＡＧＹＴＧＧＴＴ
Ｐ３￣Ｒ ＡＡＴＴＡＣＴＴＴＴＡＴＡＣＣＣＴＴＡＡＲＡＡＣＡＴＣＡＴ
Ｐ４￣Ｆ ＴＡＴＴＴＡＡＴＴＴＴＡＴＧＡＴＧＴＴＴＴＴＡＡＧＧＧＴＡＴ
Ｐ４￣Ｒ ＴＲＡＴＴＴＴＴＣＣＴＣＣＡＣＡＣＡＴＴＴＴＡＣＡＡ
３０７
４３６
４６２
４７１
１􀆰 ４􀆰 ２　 亚硫酸氢钠测序
分别取淹水处理 ０、 １、 ３、 ６、 ９、 １２ ｈ 及陆
生对照样品各 １００ ｍｇꎬ 用 ＴＧｕｉｄｅ 植物基因组
ＤＮＡ提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)
提取 ＤＮＡꎬ 每一处理取 ４个重复样品ꎻ １􀆰 ２％琼脂
糖凝胶电泳检测 ＤＮＡ 质量ꎬ 用 ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００Ｃ
８７４ 植 物 科 学 学 报 第 ３２卷　
(Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ)检测ＤＮＡ浓度ꎬ 并通过ＯＤ２６０ /
ＯＤ２８０比值评价 ＤＮＡ纯度ꎮ
以亚硫酸氢钠转化试剂盒 Ｅｐｉｔｅｃｔ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｋｉｔ
(ＱＩＡＧＥＮ)处理 ＤＮＡ 后的基因组 ＤＮＡ 为模板ꎬ
进行 ＰＣＲ扩增ꎮ 扩增产物进行电泳鉴定后割胶回
收ꎬ 用 ｐＭＤ１８￣Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ(ＴＡＫＡＲＡꎬ ＤＡＬＩＡＮ)试剂
盒克隆ꎬ 每个样品挑取 １５ 个白色菌落进行测序并
统计所有胞嘧啶位点甲基化状况ꎮ 胞嘧啶位点甲基
化程度 ＝ Ｃ / Ｃ＋Ｔ[３１－３３]ꎬ 其中 Ｃ 为甲基化的胞嘧
啶ꎬ Ｔ为未甲基化的胞嘧啶ꎮ 运用 Ｃｙｍａｔｅ(ｈｔｔｐ: / /
ｗｗｗ. ｃｙｍａｔｅ. ｏｒｇ / )和 Ｋｉｓｍｅｔｈ(ｈｔｔｐ: / / ｋａｔａｈｄｉｎ.
ｍｓｓｍ. ｅｄｕ / ｋｉｓｍｅｔｈ / ｒｅｖｐａｇｅ. ｐｌ)程序对测序结果
进行分析ꎬ 得到扩增区域所有胞嘧啶位点的甲基化
数据[３４ꎬ３５]ꎮ
２　 结果与分析
２􀆰 １　 不同水陆处理条件下 ＤＮＡ 甲基化调控因子
表达水平的动态变化
运用定量 ＰＣＲ 方法对水陆处理不同时间的
ＤＮＡ甲基化调控因子表达水平进行检测ꎬ 结果显
示大部分基因在不同处理时间点的淹水和陆生对照
样品中的相对表达水平有所改变ꎬ 且多数基因在淹
水处理前期被强烈诱导上调表达ꎬ 其中既包括对
ＤＮＡ 甲基化建立和维持有重要作用的 ＭＥＴ１、
ＣＭＴ３、 ＶＩＭ１、 ＸＲ６、 ＤＤＭ１ 等ꎬ 也包括 ＤＮＡ 去
甲基化的关键调控因子 ＲＯＳ１和 ＲＯＳ３ꎻ 淹水处理
１２ ｈ时ꎬ 这些基因在淹水样品中的表达量相对于
陆生对照有所下降ꎬ 尤其是 ＣＭＴ３、 ＶＩＭ１、 ＸＲ６
和 ＤＤＭ１等ꎬ 但随着淹水处理时间的延长又有所回
升(表 ３ꎬ 图 １)ꎮ 与其它基因不同ꎬ 淹水处理导致
ＨＯＧ１和 ＫＹＰ的表达量相对于陆生对照明显降低ꎬ
尤其是在淹水前期阶段ꎮ 而 ＦＫＢＰ５３和 ＤＲＭ２在不
同淹水处理阶段的表达量与对照均没有显著差异ꎮ
２􀆰 ２　 不同水陆处理条件下 ＤＮＡ 甲基化修饰的动
态变化
２􀆰 ２􀆰 １　 测序区域胞嘧啶平均甲基化程度
通过巢式 ＰＣＲ 扩增得到 Ｃｏｎｔｉｇ９４２ 基因全长
序列(１４２５ ｂｐ)和翻译起始密码子(ＡＴＧ)上游约
表 ３　 不同水陆处理条件下 ＤＮＡ甲基化调控基因差异表达倍数
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ ｕｎｄｅｒ ｐｏｎｄ / ｕｐｌａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ
基因
Ｇｅｎｅ
处理时间　 Ｔｉｍｅ　 (ｈ)
１ ３ ６ １２ ２４ ４８ １２０ ２８８
ＤＮＡ甲基化
ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ
染色质重塑
Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ
ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ
组蛋白分子伴侣
Ｈｉｓｔｏｎｅ
ｃｈａｐｅｒｏｎｅ
组蛋白修饰
Ｈｉｓｔｏｎｅ
ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ＤＲＭ１ ０.５１ ± ０.２４ １.３２ ± ０.２７ ４.１６ ± ０.７３ ３.０８ ± ０.８０ ０.８８ ± ０.２３ １.１５ ± ０.１３ １.８６ ± ０.８１ ７.２１ ± ２.１５
ＤＲＭ２ １.１２ ± ０.４３ １.２６ ± ０.３７ １.３３ ± ０.４７ ０.８１ ± ０.１９ ０.６７ ± ０.１８ ０.８４ ± ０.０１ １.３１ ± ０.４５ ０.９２ ± ０.１１
ＭＥＴ１ １.１９ ± ０.２９ ５.７２ ± １.１８ ３.３５ ± １.２１ １.９１ ± ０.７５ １.９８ ± ０.５０ ０.９３ ± ０.２０ ０.５４ ± ０.１４ ０.９９ ± ０.２５
ＶＩＭ１ ２.１８ ± ０.８７ ３.７３ ± ０.８６ ５.０９ ± ２.３２ ０.９０ ± ０.１９ １.５９ ± ０.４４ １.６５ ± ０.１８ ０.９９ ± ０.３８ １.４１ ± ０.５２
ＣＭＴ３ ０.５４ ± ０.０７ ４.５９ ± １.４０ ４.６９ ± １.０３ ０.２９ ± ０.１１ ２.９０ ± １.２１ ３.１９ ± １.１８ ２.１５ ± １.０１ ７.２３ ± ３.１０
ＤＣＬ２ １.０５ ± ０.２８ ３.０２ ± １.３３ ３.８１ ± １.６８ ０.４６ ± ０.３０ ２.２３ ± ０.４９ １.４４ ± ０.５９ １.３４ ± ０.５１ １.２１ ± ０.３８
ＨＯＧ１ ０.６０ ± ０.１６ ０.４２ ± ０.２１ ０.９４ ± ０.４３ ０.６２ ± ０.１５ １.６９ ± ０.８１ １.４３ ± ０.４２ ０.４５ ± ０.１１ ０.９６ ± ０.２９
ＲＯＳ１ ３.１１ ± ０.１８ ２.２１ ± ０.０３ ５.１２ ± １.３９ １.２９ ± ０.６１ １.８０ ± ０.３１ ２.０４ ± ０.１９ １.９１ ± ０.３９ ４.０３ ± １.１６
ＲＯＳ３ １.２８ ± ０.１６ ３.３２ ± ０.８２ ４.７９ ± ０.４４ １.９５ ± ０.３０ ２.３３ ± ０.２６ ２.５５ ± ０.４５ １.６１ ± ０.４９ ２.８０ ± ０.５８
ＤＤＭ１ １.２２ ± ０.１５ ２.３５ ± ０.６７ ４.２７ ± １.７５ ０.６２ ± ０.１０ １.９１ ± ０.５４ ３.７７ ± ０.６７ １.４６ ± ０.５８ ２.６６ ± ０.６３
ＦＫＢＰ５３ １.４３ ± ０.１４ １.２３ ± ０.００ １.８４ ± ０.６７ １２.６ ± １.２９ ０.７７ ± ０.１４ １.４０ ± ０.１４ ０.６１ ± ０.２１ ０.８９ ± ０.１２
ＫＹＰ ０.５９ ± ０.２５ １.１２ ± ０.０４ ０.６２ ± ０.２０ ０.２８ ± ０.０４ ０.９８ ± ０.２４ １.２６ ± ０.１３ １.１１ ± ０.２９ １.０３ ± ０.３１
ＸＲ６ １.３６ ± ０.３６ ２.６０ ± ０.７１ ６.３１ ± １.２１ ０.２８ ± ０.０１ １０.５５ ± ４.７３ ５.３６ ± ２.５５ １.０８ ± ０.５９ ２.７６ ± ０.９９
ＨＤＡ６ ０.８１ ± ０.２０ ２.６２ ± ０.３７ １４.１５ ± １.００ ８.１５ ± ２.３０ ２.１４ ± ０.３６ １.８９ ± ０.２０ １.１５ ± ０.０８ ０.５５ ± ０.００
ＨＤＴ１ ０.７５ ± ０.１０ ４.８９ ± ０.７６ ２.３６ ± ０.８２ １.５６ ± ０.５７ ２.７２ ± １.２４ ２.５９ ± ０.２９ １.６５ ± ０.３７ １.２７ ± ０.４１
ＨＡＧ２ ０.５４ ± ０.１２ １.９８ ± ０.１７ １.５９ ± ０.２２ １.６８ ± ０.７６ ２.２４ ± ０.８６ １.８６ ± ０.１３ ０.８２ ± ０.２４ １.７４ ± ０.３６
注: 淹水处理 /陆生处理基因表达变化倍数＝ ａｖｇ. ２－△△ＣＴ± ｓ.ｄ.ꎬ其中 ２－△△ＣＴ代表目标基因的相对表达量差异ꎬ ｓ.ｄ.代表重复样品之间的
标准差ꎬａｖｇ.代表平均值ꎮ
Ｎｏｔｅｓ: Ｐｏｎｄ / ｕｐｌａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ ＝ ａｖｇ. ２－△△ＣＴ± ｓ.ｄ.ꎬ ２－△△ＣＴ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅｓꎬ ｓ.ｄ.
ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｓｔａｎｄａｒｄ ｅｒｒｏｒ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｉｎ ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅꎬ ａｖｇ. ｍｅａｎｓ ａｖｅｒａｇｅ.
９７４　 第 ５期　 　 邓 莹等:不同水陆环境中喜旱莲子草甲基化调控因子表达水平和差异表达基因启动子区甲基化状态分析
图 １　 不同水陆处理条件下 １６个 ＤＮＡ甲基化
调控基因的差异表达式样
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ
ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ ｕｎｄｅｒ ｐｏｎｄ / ｕｐｌａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ
１８００ ｂｐ的侧翼序列ꎮ 该基因序列上存在两个 ＣｐＧ
富集区域ꎬ 分别位于 ＡＴＧ上游－１３００~－７００ ｂｐ和
ＡＴＧ下游 ２２００~２３００ ｂｐꎮ 利用 ＳｃａｎＷＭ￣ＰＬ程序
在 Ｃｏｎｔｉｇ９４２基因上游侧翼序列中鉴定了 ２７ 个该
基因与其直系同源基因共有的保守元件ꎬ 其中一
些为已知转录调控因子 (如 Ｍｙｅｌｏｃｙｔｏｍａｔｏｓｉｓ
(ＭＹＣ)、 ＷＲＫＹ)的结合位点ꎻ 有些元件位于 ＣｐＧ
富集区ꎬ 如在转录起始位点上游 １００~３００ ｂｐ间有
一个 ＭＹＢ(Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ)家族转录因子的结合元
件 ＳＭＲＥ ( Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｗａｌｌ ＭＹＢ￣Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ Ｅｌｅ￣
ｍｅｎｔ)ꎬ 其识别位点为[Ｔ / Ｃ]ＡＣＣ[Ａ / Ｔ]Ａ[Ａ / Ｃ]
[Ｔ / Ｃ] [３６]ꎮ 在 Ｃｏｎｔｉｇ９４２ 基因上游侧翼序列还发
现一个次生壁相关 ＮＡＣ 转录因子 ＳＮＤ１(ｓｅｃｏｎｄ￣
ａｒｙ ｗａｌｌ￣ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＮＡＣ ｄｏｍａｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ１)的作用
位点ꎬ 即 ＳＮＢＥ(Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｗａｌｌ ＮＡＣ ｂｉｎｄｉｎｇ ｅｌｅ￣
ｍｅｎｔ)元件[３７]ꎮ 亚硫酸氢钠测序范围为 ＡＴＧ 上游
－１２９８~－５７７ ｂｐ(图 ２: ａ)ꎬ 分成两段(Ｐ１和 Ｐ２)
进行测序ꎮ 根据扩增得到的启动子序列推测在喜旱
莲子草基因组中至少存在 ３个 Ｃｏｎｔｉｇ９４２同源基因
(９４２￣Ａ、 ９４２￣Ｂ、 ９４２￣Ｃ)ꎬ 其启动子序列相似度
大于 ９４％ꎬ 并含有相同的保守元件ꎬ 但胞嘧啶甲
基化修饰状态不完全一致ꎮ 在 Ｐ１区域ꎬ ９４２￣Ａ / Ｂ /
Ｃ胞嘧啶甲基化程度较为一致ꎬ 其中 ＣＧ ９８􀆰 ４％~
９８􀆰 ６％ꎬ ＣＮＧ ７２􀆰 ５％ ~ ７５􀆰 １％ꎬ ＣＨＨ ７􀆰 ４％ ~
９􀆰 ９％ꎻ 淹水处理 １~１２ ｈꎬ ９４２￣Ａ / Ｂ / Ｃ Ｐ１ 区域的
甲基化程度未表现出明显变化ꎮ 但 Ｐ２ 区域不同拷
贝甲基化修饰状态有较明显差异ꎮ 在陆生对照样品
中ꎬ ９４２￣Ａ 的 ＣＧ 和 ＣＮＧ 位点平均甲基化水平
(ＣＧ ９３􀆰 ８％ꎬ ＣＮＧ ６７􀆰 １％)高于 ９４２￣Ｂ / Ｃ (ＣＧ
６７􀆰 ９％~７５􀆰 ８％ꎬ ＣＮＧ ４６􀆰 ４％ ~５４􀆰 ６％)ꎬ ９４２￣Ｃ
的 ＣＨＨ位点甲基化水平(３０􀆰 ５％)显著高于 ９４２￣
Ａ / Ｂ(１３􀆰 １％~１４􀆰 ８％)ꎮ 淹水处理条件下ꎬ ９４２￣Ａ /
Ｂ / Ｃ Ｐ２区域也呈现出不同的变化趋势(图 ３)ꎮ 淹
水处理 １ ｈꎬ ９４２￣Ａ / Ｂ / Ｃ 的 ＣＧ / ＣＮＧ / ＣＨＨ 位点
平均甲基化程度均升高(最大上升幅度约 ２０％)ꎻ
淹水处理 ３ ｈꎬ ９４２￣Ｂ的 ＣＮＧ / ＣＨＨ 位点甲基化程
度降低(下降幅度约 １６％)ꎬ 而 ９４２￣Ａ / Ｃ 的 ＣＮＧ /
ＣＨＨ位点甲基化程度仍维持升高(最大上升幅度约
２８％)ꎻ 淹水处理 ６ ｈꎬ 仅 ９４２￣Ｂ / Ｃ的 ＣＨＨ位点甲
基化程度呈现上升(最大上升幅度约 １５％)ꎻ 淹水
处理 ９ ｈꎬ ９４２￣Ａ 的 ＣＧ / ＣＨＨ 位点出现甲基化程
度降低ꎻ 淹水处理 １２ ｈꎬ ９４２￣Ａ的 ＣＧ / ＣＮＧ / ＣＨＨ
位点甲基化程度又明显升高 (最大上升幅度约
４６％)ꎮ 总体上看ꎬ 淹水处理条件下发生甲基化改
变的位点主要是 ＣＨＧ / ＣＨＨ位点ꎮ
Ｃｏｎｔｉｇ２３３３６基因编码区ｍＲＮＡ全长 ９８４ ｂｐꎬ
扩增得到该基因起始密码子上游 １１８７ ｂｐ 的侧翼
序列ꎮ Ｃｏｎｔｉｇ２３３３６基因上存在两个 ＣｐＧ 富集区
域ꎬ 分别位于 ＡＴＧ 上游约－８００ ~－７００ ｂｐ 以及
－１００ ~－５ ｂｐ 处ꎮ 启动子位于 ＡＴＧ 上游－８０ ｂｐ
处ꎬ ＴＡＴＡ 框位于－１１５ ｂｐ 处ꎮ 利用 ＳｃａｎＷＭ￣ＰＬ
程序在 Ｃｏｎｔｉｇ２３３３６ 基因上游侧翼序列中查找到
２２个该基因与其直系同源基因共有的保守元件ꎮ
亚硫酸氢钠测序范围为 ＡＴＧ 上游－８７３~＋１９ ｂｐꎬ
共 ８９２ ｂｐ(图 ２: ｂ)ꎬ 分成两段(Ｐ３和 Ｐ４)进行测
序ꎮ Ｐ３区域平均甲基化水平为 ＣＧ ９７􀆰 ７％、 ＣＮＧ
６２􀆰 ４％、 ＣＨＨ １３％ꎬ 淹水处理 １ ~１２ ｈ 该区域甲
基化程度未见明显变化ꎮ Ｐ４ 区域平均甲基化水平
较低ꎬ 其中 ＣＧ ２９􀆰 ３％ꎬ ＣＮＧ １５％ꎬ ＣＨＨ １７􀆰 １％ꎬ
ＣＧ和 ＣＮＧ位点甲基化水平显著低于 Ｐ３区域ꎮ 淹
水处理过程中ꎬ 仅 ６ ｈ时 Ｐ４区域 ＣＮＧ位点甲基化
水平出现约 １０％下降ꎬ １２ ｈ时 ＣＧ位点出现约 １２％
上升外ꎬ 总体而言甲基化水平变化不显著(图 ３)ꎮ
２􀆰 ２􀆰 ２　 不同位点甲基化水平变化式样
对 Ｃｏｎｔｉｇ９４２￣Ａ / Ｂ / Ｃ序列中所涉及的转录调控
０８４ 植 物 科 学 学 报 第 ３２卷　
ａ: Ｃｏｎｔｉｇ９４２ (７２２ ｂｐ)ꎻ ｂ: Ｃｏｎｔｉｇ２３３３６ (８９２ ｂｐ)ꎮ 柱状图为陆生对照样品亚硫酸氢钠测序结果ꎬ Ｙ轴代表各胞嘧啶位点甲
基化的克隆数占总克隆数的比例ꎮ
ａ: Ｃｏｎｔｉｇ９４２ (７２２ ｂｐ)ꎻ ｂ: Ｃｏｎｔｉｇ２３３３６ (８９２ ｂｐ) . Ｂａｒ ｇｒａｐｈｓ ｓｈｏｗ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓａｍｐｌｅｓ. Ｖｅｒｔｉ￣
ｃａｌ ａｘｉｓ ｓｈｏｗｓ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅａｃｈ ｓｉｔｅ.
图 ２　 目标基因启动子序列 ＣＧ含量分布及亚硫酸氢钠测序范围
Ｆｉｇ􀆰 ２　 ＣＧ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｉｏｎｓ ｆｏｒ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
元件胞嘧啶甲基化水平分别进行统计ꎬ 发现有 ８个
保守元件的胞嘧啶甲基化水平在淹水处理不同时间
点发生改变(表 ４)ꎬ 其中有些元件在所测序片段中
有多个拷贝ꎬ 但甲基化变异状态不完全一致ꎮ 如变
化位点数较多的 ＧＧＴＣＣ 序列ꎬ 在淹水处理过程
中ꎬ 部分位点出现甲基化水平上升ꎬ 部分位点出现
甲基化水平下降ꎮ 该序列对应植物中已知的 Ｉ￣ｂｏｘ
元件ꎬ 与之结合的转录因子未知ꎮ Ｃｏｎｔｉｇ９４２￣Ａ /
Ｂ / Ｃ的 Ｂｏｘ Ｃ及 ＣＲＥ元件也都发生了甲基化式样
变异ꎬ ＭＹＢ４６/ ＭＹＢ８３等转录因子的结合元件 ＳＭＲＥ
１８４　 第 ５期　 　 邓 莹等:不同水陆环境中喜旱莲子草甲基化调控因子表达水平和差异表达基因启动子区甲基化状态分析
　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 Ｗ: 淹水处理ꎻ Ｄ: 陆生对照ꎻ ＣＧ、 ＣＮＧ、 ＣＨＨ: 三种类型的胞嘧啶ꎮ
　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 Ｗ: Ｔｒｅａｔｅｄ ｓａｍｐｌｅｓꎻ Ｄ: Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓａｍｐｌｅｓꎻ ＣＧꎬ ＣＮＧꎬ ＣＨＨ: Ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｃｙｔｏｓｉｎｅｓ.
图 ３　 测序区域平均甲基化程度
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ａｖｅｒａｇｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｅａｃｈ ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｉｍｅ ｐｏｉｎｔｓ ｏｆ ｗａｔｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
上多个胞嘧啶位点甲基化程度则在淹水处理 ９ ~
１２ ｈ 出现明显降低ꎬ 但在 Ｃｏｎｔｉｇ２３３３６ 的保守元
件上未检测到明显的甲基化式样变异ꎮ
除了保守元件之外ꎬ Ｃｏｎｔｉｇ９４２￣Ａ / Ｂ / Ｃ Ｐ２ 区
域多个连续 ＣＨＨ位点在淹水处理不同时间点出现
胞嘧啶甲基化程度上调的现象ꎬ 而在淹水处理 ３ ｈꎬ
Ｃｏｎｔｉｇ９４２￣Ｂ Ｐ２区域有 １３ 个 ＣＨＨ 位点出现甲基
化程度下调ꎬ 这 １３ 个连续的 ＣＨＨ 位点位于基因
５′端 ＣｐＧ富集区下游ꎬ 且紧邻 ＣｐＧ富集区ꎬ 在这
些位点上含一个转录因子结合元件 ＣＡＡＴＴＴＴＡＴＣ
(ＲＥ: ＣＲＥ / ＢＦ: ｕｎｋｎｏｗｎ ) ( 图 ４ )ꎮ 在 Ｃｏｎ￣
ｔｉｇ２３３３６启动子区域同样检测到连续 ＣＨＨ 位点胞
嘧啶甲基化程度发生上调的现象ꎬ 这些位点都与
ＣｐＧ富集区域相重叠ꎮ
２８４ 植 物 科 学 学 报 第 ３２卷　
表 ４　 不同水陆处理条件下 Ｃｏｎｔｉｇ９４２启动子区保守元件甲基化修饰状态
Ｔａｂｌｅ ４　 Ｄｙｎａｍｉｃ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｍｏｔｉｆｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｉｇ９４２
保守元件(ＲＥ: 调控元件ꎬ ＢＦ: 结合因子)
Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｅｌｅｍｅｎｔｓ
(ＲＥ: Ｒｅｇｕｌａｔｅ ｅｌｅｍｅｎｔꎬ ＢＦ: Ｂｉｎｄｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ)
序列　 　 　
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　 　 　
位置　 　
Ｓｉｔｅ　 　
区域
Ｒｅｇｉｏｎ
处理时间 Ｔｉｍｅ (ｈ)
１ ３ ６ ９ １２
ＲＥ: Ｉ￣ｂｏｘ / ＢＦ: ｕｎｋｎｏｗｎ
ＧＧＴＣＣ ７２ Ａ＿Ｐ１ ▲
ＧＧＴＣＣ １６４ Ａ＿Ｐ１ ▽
ＧＧＴＣＣ １７３ Ａ＿Ｐ１ ▽
ＧＧＴＣＣ １１３ Ｂ＿Ｐ１ ▲
ＧＧＴＣＣ １０３ Ｃ＿Ｐ１ ▲
ＧＧＴＣＣ １６３ Ｃ＿Ｐ１ ▲
ＧＧＴＣＣ １５ Ｃ＿Ｐ２ ▲
ＲＥ: ＣＡＲＧＣＷ８ＧＡＴ / ＢＦ: ｐｌａｎｔ ＭＡＤＳ
ｄｏｍａｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ＡＧＬ１５
ＣＴＡＡ ＡＴＴＡＴＧ １５７ Ａ＿Ｐ２ ▲
ＣＴＡＡ ＡＴＴＡＴＧ １５７ Ｃ＿Ｐ２ ▲
ＲＥ: ＣＵＲＥＣＯＲＥＣＲ ( ｃｏｐｐｅｒꎻ ｏｘｙｇｅｎꎻ ｈｙ￣
ｐｏｘｉｃꎻ Ｏｘｙｇｅｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｇｅｎｅ)
ＧＴＡＣ １８９ Ａ＿Ｐ２ ▽
ＧＴＡＣ １８９ Ｃ＿Ｐ２ ▲
ＲＥ: Ｂｏｘ Ｃ / ＢＦ: ｕｎｋｎｏｗｎ
ＣＴＣＣＣＡＣ １９４ / １９８ Ａ＿Ｐ２ ▲１ ▽２ ▲１▲２
ＣＴＣＣＣＡＣ １９７ / １９８ Ｃ＿Ｐ２ ▲１ ▽２
ＲＥ: ＳＭＲＥ ｅｌｅｍｅｎｔ / ＢＦ: ＭＹＢ４６ꎻ ＭＹＢ８３
[Ｔ / Ｃ]ＡＣＣ[Ａ / Ｔ]Ａ[Ａ / Ｃ][Ｔ / Ｃ] １９８ / ２０１ Ａ＿Ｐ２ ▽１ ▲１▽２
[Ｔ / Ｃ]ＡＣＣ[Ａ / Ｔ]Ａ[Ａ / Ｃ][Ｔ / Ｃ] １９８ Ｃ＿Ｐ２ ▽
ＲＥ: ＣＲＥꎬ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ / ＢＦ: ｕｎｋｎｏｗｎ
ＣＡＡＴＴＴＴＡＴＣ ３３６ / ３４５ Ａ＿Ｐ２ ▲２ ▲１
ＣＡＡＴＴＴＴＡＴＣ ３３８ / ３４７ Ｂ＿Ｐ２ ▽１ ▲２ ▲１ ▽２
ＣＡＡＴＴＴＴＡＴＣ ３４７ Ｃ＿Ｐ２ ▽ ▲
ＲＥ: ＲＹ / ＢＦ: ＡＢＩ３
ＣＡＴＧＣＡ ２８ Ｂ＿Ｐ２ ▽
ＣＡＴＧＣＡ ３２ Ｃ＿Ｐ２ ▲
ＲＥ: ＲＹ２ / ＢＦ: ｕｎｋｎｏｗｎ
ＣＡＴＧＣＡＡ ２８ Ｂ＿Ｐ２ ▽
ＣＡＴＧＣＡＡ ３２ Ｃ＿Ｐ２ ▲
注: 甲基化变化胞嘧啶位点用下划线标示ꎻ 甲基化修饰状态变化: ▲上调ꎬ ▽下调ꎬ 上标 １和 ２分别代表序列中第 １和第 ２个胞嘧啶ꎮ
Ｎｏｔｅｓ: Ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｓｉｔｅｓ ｗｉｔｈ ｃｈａｎｇｅｄ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ ａｒｅ ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄꎻ ▲ꎬ Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎꎻ ▽ꎬ Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ
ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎꎻ Ｓｕｐｅｒｃｒｉｐｔｓ １ ａｎｄ ２ ｄｅｎｏｔｅ ｆｉｒｓｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.
３　 讨论
采用定量 ＰＣＲ 方法对不同水陆处理条件下喜
旱莲子草 ＤＮＡ甲基化调控基因的表达水平进行检
测ꎬ 结果显示除 ＨＯＧ１、 ＫＹＰ 和 ＤＲＭ２ 三个基因
外ꎬ 其余 １３个基因均在淹水处理不同时间点被诱
导上调表达(差异表达倍数大于 ２)ꎬ 且在水淹 ３~
６ ｈ 期间被强烈诱导上调表达ꎬ 此后有些基因持续
上调ꎬ 另一些基因则维持相对稳定的表达水平ꎬ 少
量基因下调表达ꎮ 这说明喜旱莲子草对淹水胁迫的
响应及表型可塑性变异与不同 ＤＮＡ 甲基化调控因
子介导的表观遗传调控作用有一定关联ꎬ 且不同
ＤＮＡ甲基化调控因子的活动既有相关性ꎬ 也有其
独立性ꎮ
对 Ｃｏｎｔｉｇ９４２和 Ｃｏｎｔｉｇ２３３３６两个基因启动子
区胞嘧啶甲基化修饰状态进行测序分析ꎬ 揭示了淹
水处理导致部分位点甲基化程度改变ꎬ 其中既包括
保守调控元件的胞嘧啶位点ꎬ 也包括一些连续的非
对称甲基化位点ꎮ 保守元件甲基化状态的改变可能
影响相关基因的表达调控ꎮ 例如ꎬ 目前已知与
ＳＭＲＥ相结合的 ＭＹＢ４６ꎬ 它是次生壁发育调控通
路的“开关”ꎬ 并调控多个转录因子及次生壁合成
相关基因ꎬ Ｃｏｎｔｉｇ９４２基因启动子区域中 ＳＭＲＥ 元
件甲基化修饰状态的改变有可能影响 ＭＹＢ４６ 的结
合ꎬ 进而影响该基因在不同水陆处理条件下特殊的
差异表达式样ꎮ 本研究结果表明ꎬ Ｃｏｎｔｉｇ９４２ 基因
启动子 Ｐ２区域对淹水处理较为敏感ꎬ 该区域多个
胞嘧啶位点甲基化程度在不同处理时间点出现特异
变化ꎻ 三个同源基因 Ｃｏｎｔｉｇ９４２￣Ａ / Ｂ / Ｃ的 Ｐ２区域
在淹水处理条件下呈现出不完全一致的变化动态ꎬ
表明 Ｃｏｎｔｉｇ９４２的三个不同拷贝在功能上已有所分
化ꎮ 其中 Ｃｏｎｔｉｇ９４２￣Ｂ Ｐ２区域与 ＣｐＧ富集区相邻
的多个胞嘧啶位点在淹水处理 ３ ｈ时甲基化程度呈
现一致下调ꎬ 结合该基因在淹水处理下“ｕｐｄｏｗｎ”
３８４　 第 ５期　 　 邓 莹等:不同水陆环境中喜旱莲子草甲基化调控因子表达水平和差异表达基因启动子区甲基化状态分析
虚线标示 ＣｐＧ富集区ꎻ 实线标示调控元件ꎻ 黑体标示甲基化修饰程度出现特异下调的胞嘧啶位点ꎮ
Ｄａｓｈｅｄ ｕｎｄｅｒｌｉｎｅ: ＣｐＧ ｉｓｌａｎｄꎻ Ｒｅａｌ ｕｎｄｅｒｌｉｎｅ: Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｔｉｆꎻ Ｂｏｌｄ ｌｅｔｔｅｒ: Ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｓｉｔｅ.
图 ４　 Ｃｏｎｔｉｇ９４２ Ｐ２测序区域
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｐ２ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｎｔｉｇ９４２
的表达模式ꎬ 推测该现象与其在 １~３ ｈ 表达上调
之间存在相关性ꎬ 在该区域可能存在未知的转录调
控元件ꎻ 同时ꎬ Ｃｏｎｔｉｇ９４２￣Ｂ Ｐ２ 区域连续的 ＣＨＨ
位点在淹水处理过程中甲基化程度也发生一致的改
变ꎬ 反映了这些连续胞嘧啶位点之间的功能相关
性ꎬ 也可能是通过改变该区域 ＤＮＡ 链空间结构影
响与蛋白因子的互作ꎬ 进而影响相关基因的表达和
喜旱莲子草对外界环境的响应ꎮ Ｃｏｎｔｉｇ２３３３６ 基因
甲基化测序区域调控元件上未出现显著甲基化式样
改变ꎬ 表明该基因在淹水处理条件下的持续上调表
达与受检测区域甲基化式样无直接关联ꎬ 该基因的
调控元件可能在检测区域以外ꎬ 远离转录起始位
点ꎬ 或受到其它调控因素的影响ꎮ
表观遗传调控作用是研究生态￣发育 ( Ｅｃｏ￣
Ｄｅｖｏ)和可塑性变异机制的重要环节ꎬ 涉及不同的
调控策略和不同调控因子的活动ꎬ 包括 ＤＮＡ 甲基
化、 组蛋白共价修饰、 染色体重塑和非编码 ＲＮＡ
调控等ꎬ 但目前对不同调控因素之间相互协调的关
系以及在不同生物类群中的作用特点还缺乏深入的
了解ꎬ 即使在人、 酵母或拟南芥等模式生物中要将
环境诱导因素、 表观遗传变异式样与基因差异表达
水平以及表型发育状态直接关联起来也有一定难
度ꎮ 喜旱莲子草是一种非模式生物ꎬ 目前尚无完整
的基因组信息ꎬ 对该物种表观遗传调控因子的类型
及其作用特点也还缺乏基本的了解ꎮ 本研究揭示了
喜旱莲子草响应不同水陆条件过程中 ＤＮＡ 甲基化
４８４ 植 物 科 学 学 报 第 ３２卷　
相关调控因子的动态表达式样ꎬ 初步证实了表观遗
传变异与发育调控基因差异表达及表型可塑性变异
的相关性ꎬ 但基于目前的数据尚不能准确阐明喜旱
莲子草表型可塑性变异和广泛适应不同水陆生境的
分子机制ꎬ 不能明确表观遗传调控因素与可塑性基
因差异表达水平的对应关系ꎬ 因为即使在同质园条
件下对单一水分因子变动的响应也涉及大量基因的
差异表达ꎬ 涉及不同表观遗传调控因子的协调作
用ꎮ 要系统阐明喜旱莲子草适应水淹环境的表观遗
传学基础ꎬ 需要对不同环境条件下喜旱莲子草的表
观基因组特点进行整体的比较分析ꎬ 鉴定由环境因
子导致的表观遗传转变ꎬ 并寻找与基因表达式样、
表型及生态适应性的关联特征ꎬ 进而在整体水平阐
明表观遗传调控体系在喜旱莲子草适应不同自然生
境中的重要调节作用ꎮ
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ｉｓｌａｎｄ ｉｓ ｉｎｉｔｉａｔｅｄ ｐｏｓｔ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ
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５８４　 第 ５期　 　 邓 莹等:不同水陆环境中喜旱莲子草甲基化调控因子表达水平和差异表达基因启动子区甲基化状态分析
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Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌꎬ ２０１０ꎬ ６３１: １－１１.
[３２] 　 Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ ＩＲꎬ Ｃｈａｎ ＳＲꎬ Ｃａｏ Ｘꎬ Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｌꎬ Ｊａ￣
ｃｏｂｓｅｎ ＳＥ. Ａｃｃｕｒａｔｅ ｓｏｄｉｕｍ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
ｉｎ ｐｌａｎｔｓ[Ｊ] . Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓꎬ ２０１０ꎬ ５(１): ４７－４９.
[３３] 　 Ｗａｒｎｅｃｋｅ ＰＭꎬ Ｓｔｉｒｚａｋｅｒ Ｃꎬ Ｓｏｎｇ Ｊꎬ Ｇｒｕｎａｕ Ｃꎬ
Ｍｅｌｋｉ ＪＲꎬ Ｃｌａｒｋ ＳＪ. Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ
ａｒｔｉｆａｃｔｓ ｉｎ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ [ Ｊ ] . Ｍｅｔｈｏｄｓꎬ
２００２ꎬ ２７(２): １０１－１０７.
[３４] 　 Ｇｒｕｎｔｍａｎ Ｅꎬ Ｑｉ Ｙꎬ Ｓｌｏｔｋｉｎ ＲＫꎬ Ｒｏｅｄｅｒ Ｔꎬ Ｍａｒ￣
ｔｉｅｎｓｓｅｎ ＲＡꎬ Ｓａｃｈｉｄａｎａｎｄａｍ Ｒ. Ｋｉｓｍｅｔｈ: ａｎａｌｙ￣
ｚｅｒ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｔａｔｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｓｅ￣
ｑｕｅｎｃｉｎｇ [ Ｊ ] . ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓꎬ ２００８ꎬ ９:
３７１.
[３５] 　 Ｆｏｅｒｓｔｅｒ ＡＭꎬ Ｈｅｔｚｌ Ｊꎬ Ｍｕｌｌｎｅｒ Ｃꎬ Ｍｉｔｔｅｌｓｔｅｎ ＳＯ.
Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄａｔａ ｆｒｏｍ ｐｌａｎｔ
ＤＮＡ ｕｓｉｎｇ ＣｙＭＡＴＥ[Ｊ] . Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌꎬ ２０１０ꎬ
６３１: １３－２２.
[３６] 　 Ｚｈｏｎｇ Ｒꎬ Ｙｅ ＺＨ. ＭＹＢ４６ ａｎｄ ＭＹＢ８３ ｂｉｎｄ ｔｏ ｔｈｅ
ＳＭＲＥ ｓｉｔｅｓ ａｎｄ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ａｃｔｉｖａｔｅ ａ ｓｕｉｔｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐ￣
ｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｗａｌｌ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｇｅｎｅｓ
[Ｊ]. Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌꎬ ２０１２ꎬ ５３(２): ３６８－３８０.
[３７] 　 Ｚｈｏｎｇ Ｒꎬ Ｌｅｅ Ｃꎬ Ｙｅ ＺＨ. Ｇｌｏｂａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｄｉｒｅｃｔ
ｔａｒｇｅｔｓ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｗａｌｌ ＮＡＣ ｍａｓｔｅｒ ｓｗｉｔｃｈｅｓ ｉｎ
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ[Ｊ] . Ｍｏｌ Ｐｌａｎｔꎬ ２０１０ꎬ ３(６): １０８７－
１１０３.
(责任编辑: 刘艳玲)
６８４ 植 物 科 学 学 报 第 ３２卷