全 文 ：植物科学学报　 ２０１４ꎬ ３２(４): ３８３~３９３
Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ
　 　 ＤＯＩ: １０􀆰 ３７２４ / ＳＰ􀆰 Ｊ􀆰 １１４２􀆰 ２０１４􀆰 ４０３８３
中国红豆杉ＴｃＮＰＲ１基因的克隆与功能研究
谢 莎１∗ꎬ 许想平１∗ꎬ 张 蒙１ꎬ 付春华１ꎬ２∗∗ꎬ 余龙江１ꎬ２
(１. 华中科技大学生命科学与技术学院生物技术系ꎬ 资源生物学与生物技术研究所ꎬ 武汉 ４３００７４ꎻ
２. 华中科技大学分子生物物理教育部重点实验室ꎬ 武汉 ４３００７４)
摘　 要: 水杨酸(ＳＡ)可诱导红豆杉细胞中紫杉醇的合成ꎬ 病程相关基因非表达子基因(ＮＰＲ１)是 ＳＡ 介导的植
物系统获得性抗性(ＳＡＲ)信号途径中的关键信号分子ꎮ 本研究从中国红豆杉(Ｔａｘｕｓ ｃｈｉｎｅｓｉｓ)细胞中克隆了
ＴｃＮＰＲ１基因ꎬ 该基因完整的开放阅读框大小为 １８５７ ｂｐꎬ 编码蛋白序列由 ６１９ 个氨基酸组成ꎬ 含有典型的
ＮＰＲ１保守结构域、 锌指结构域和锚蛋白结构域ꎮ 进化树分析发现ꎬ ＴｃＮＰＲ１ 蛋白与拟南芥 ＡｔＮＰＲ３ 和 ＡｔＮＰＲ４
类蛋白的亲源关系较近ꎮ ＴｃＮＰＲ１基因表达响应 ＳＡ、 干旱和 ＮａＣｌ胁迫处理ꎬ 且随着处理时间增加ꎬ ＴｃＮＰＲ１ 基
因表达量逐渐增大ꎮ 超表达 ＴｃＮＰＲ１的转基因烟草植株对干旱的耐受力增强ꎬ 叶片内可溶性糖含量达 ４３􀆰 ８ ｍｇ /
ｇ (ＦＷ)ꎬ 比对照高出 ２倍左右ꎬ 说明 ＴｃＮＰＲ１基因具有表达功能ꎬ 此结果为探究中国红豆杉细胞响应 ＳＡ 诱导
大量合成紫杉醇的信号途径提供了依据ꎮ
关键词: 中国红豆杉ꎻ 病程相关基因非表达子基因(ＮＰＲ１)ꎻ 基因克隆ꎻ 表达分析
中图分类号: Ｑ９４３􀆰 ２　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ２０９５￣０８３７(２０１４)０４￣０３８３￣１１
　 　 　 收稿日期: ２０１４￣０５￣２７ꎬ 退修日期: ２０１４￣０６￣１５ꎮ
　 基金项目: 国家自然科学基金面上项目(３１２７０３４２)ꎮ
　 作者简介: 谢莎(１９８８－)ꎬ 女ꎬ 硕士研究生ꎬ 研究方向为植物次生代谢转录调控(Ｅ￣ｍａｉｌ: ４０２７６５３６２＠ｑｑ􀆰 ｃｏｍ)ꎻ 许想平(１９６８－)ꎬ
女ꎬ 中级技师ꎬ 主要从事植物次生代谢研究(Ｅ￣ｍａｉｌ: ５０６５８９８６２＠ｑｑ􀆰 ｃｏｍ)ꎮ
　 ∗同为第一作者ꎮ
　 ∗∗通讯作者(Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ): 付春华 (１９７４－)ꎬ 女ꎬ 副教授ꎬ 主要从事植物次生代谢与调控研究(Ｅ￣ｍａｉｌ: ｆｕｃｈ２００３＠
１２６􀆰 ｃｏｍ)ꎮ
Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ＴｃＮＰＲ１
Ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｔａｘｕｓ ｃｈｉｎｅｓｉｓ
ＸＩＥ Ｓｈａ１∗ꎬ ＸＵ Ｘｉａｎｇ￣Ｐｉｎｇ１∗ꎬ ＺＨＡＮＧ Ｍｅｎｇ１ꎬ ＦＵ Ｃｈｕｎ￣Ｈｕａ１ꎬ２∗∗ꎬ ＹＵ Ｌｏｎｇ￣Ｊｉａｎｇ１ꎬ２
(１. Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ
Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ Ｗｕｈａｎ ４３００７４ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２. Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ｏｆ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ
Ｅｄｕｃａｔｉｏｎꎬ Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ Ｗｕｈａｎ ４３００７４ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ (ＳＡ)ꎬ ａ ｃｏｍｍｏｎ ｐｌａｎｔ ｈｏｒｍｏｎｅꎬ ｃａｎ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ
ｖａｒｉｏｕｓ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓꎬ ｓｕｃｈ ａｓ ｔａｘｏｌ ｉｎ Ｔａｘｕｓ ｃｅｌｌｓ. ＮＰＲ１ ｉｓ ｔｈｅ ｋｅｙ ｇｅｎｅ ｉｎ ＳＡ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｌａｎｔ
ｓｙｓｔｅｍ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ (ＳＡＲ) ｓｉｇｎａｌ ｐａｔｈｗａｙ. Ｔｏ ｃｌａｒｉｆｙ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ＳＡ
ｉｎｄｕｃｅｄ ｔａｘｏｌ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓꎬ ｔｈｅ ＴｃＮＰＲ１ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｔａｘｕｓ ｃｅｌｌｓꎬ ａｎｄ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｔｏ
ｃｏｎｔａｉｎ ａ １８５７ ｂｐ ＯＲＦ (ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ)ꎬ ｗｈｉｃｈ ｍａｙ ｅｎｃｏｄｅ ａ ６１９ ａａ ｐｒｏｔｅｉｎ. Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｈｏｗｅｄ ＴｃＮＰＲ１ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｔｙｐｉｃａｌ ｃｏｎｓｅｒｖｅ ｄｏｍａｉｎｓ ｓｕｃｈ ａｓ Ｂｒｏａｄ￣Ｃｏｍｐｌｅｘꎬ
Ｔｒａｍｔｒａｃｋꎬ ａｎｄ Ｂｒｉｃ￣ａ￣ｂｒａｃ / Ｐｏｘ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ (ＢＴＢ / ＰＯＺ ｄｏｍａｉｎ)ꎬ ＮＰＲ１ / ＮＩＭ１￣ｌｉｋｅ￣
Ｃ ｔｅｒｍｉｎａｌ ａｎｄ ａｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔｓ. Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＴｃＮＰＲ１ ｈａｄ ａ ｃｌｏｓｅ
ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｗｉｔｈ ＡｔＮＰＲ３ ａｎｄ ＡｔＮＰＲ４ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ. Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＴｃＮＰＲ１ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＳＡꎬ ｄｒｏｕｇｈｔ ａｎｄ ＮａＣｌ. Ｉｎ
ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅꎬ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ ｐｌａｎｔｓ ｏｖｅｒ￣ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＴｃＮＰＲ１ ｓｈｏｗｅｄ
ｅｌｅｖａｔｅｄ ｄｒｏｕｇｈｔ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｗｉｔｈ ｓｏｌｕｂｌｅ ｓｕｇａｒ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｏ ４３􀆰 ８ ｍｇ / ｇ ( ＦＷ) ａｆｔｅｒ ４ ｄ ｏｆ
ｄｒｏｕｇｈｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔꎬ ａｂｏｕｔ ｔｗｏ ｔｉｍｅｓ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌꎬ ｒｅｖｅａｌｉｎｇ ｔｈａｔ ＴｃＮＰＲ１ ｗａｓ ａ
ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ. Ｔｈｅ ａｖａｉｌａｂｌｅ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｖｅｒｉｆｉｅｄ ｔｈａｔ ＴｃＮＰＲ１ ｍａｙ ｒｅｓｐｏｎｄ ｔｏ ＳＡ ａｎｄ ｍａｙ ｂｅ
ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ( ＳＡＲ) ｉｎ Ｔａｘｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ. Ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ
ＴｃＮＰＲ１ ｇｅｎｅ ａｒｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｃｌａｒｉｆｙｉｎｇ ｉｔｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔａｘｏｌ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｔａｘｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓꎻ Ｎｏｎ￣ｅｘｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ￣ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ １(ＮＰＲ１)ꎻ Ｇｅｎｅ
ｃｌｏｎｉｎｇꎻ Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ
　 　 紫杉醇是一种高效抗肿瘤药物ꎬ 对治疗卵巢
癌、 子宫癌等多种癌症具有显著疗效ꎮ 红豆杉细胞
培养生产紫杉醇是扩大紫杉醇药源的有效途径之
一ꎬ 但产量不稳定是限制其产业化的瓶颈问题之
一[１－４]ꎮ Ｗａｎｇ等研究发现ꎬ 水杨酸(ＳＡ)可诱导
包括紫杉醇关键酶紫杉二烯合酶 ｔｓ 基因在内的多
个合成基因表达ꎬ 并使得紫杉醇含量增加[５]ꎮ 因
此ꎬ 研究 ＳＡ调控红豆杉细胞中紫杉醇生物合成机
理ꎬ 将为寻找更为有效的措施来调控紫杉醇的合成
提供依据ꎮ
ＳＡ作为植物系统获得性抗性的调控信号分子ꎬ
除了广泛参与由病原菌引起的植物抗性反应外ꎬ 还
介导植物对各种非生物胁迫的响应[６]ꎮ 病程相关
基因非表达子 ＮＰＲ１(ｎｏｎ￣ｅｘｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎ￣
ｅｓｉｓ￣ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ １)是参与植物响应逆境胁迫诱
导的一类防御因子ꎬ 在水杨酸(ＳＡ)介导的植物系
统获得性抗性(ＳＡＲ)反应中起着重要的信号分子
传递作用[７]ꎮ ＮＰＲ１作为 ＳＡ 路径的关键信号分子
已得到广泛研究ꎬ 其作用机理已部分阐明ꎮ ＳＡ 通
过改变胞质内的氧化还原势使 ＮＰＲ１进入核内传递
信号ꎬ ＮＰＲ１在核内充当一个共调控作用因子ꎬ 与
其它转录因子相互结合形成复合体诱导防御基因的
表达[８]ꎻ 也有研究表明ꎬ ＳＡ 可诱导 ＮＰＲ１ 的磷酸
化ꎬ 诱导 ＮＰＲ１ 进入蛋白复合体介导的降解过程
中ꎬ 逐渐终止防御反应[９]ꎮ Ｆｕ等[１０]在拟南芥中发
现了能直接与ＳＡ互作的ＮＰＲ３和ＮＰＲ４ꎬ 并且ＮＰＲ１
浓度的动态平衡依赖于 ＳＡ / ＮＰＲ３ 和 ＳＡ / ＮＰＲ４ 复
合体的浓度ꎮ 而 ＮＰＲ３和 ＮＰＲ４是 ＮＰＲ１的同源基
因ꎬ 说明 ＳＡ能直接与 ＮＰＲ１ 相互结合发生作用ꎮ
自此ꎬ ＮＰＲ１在 ＳＡ介导的防御过程中独特调控与
被调控关系逐渐被人们认识到ꎬ 更加突显了 ＮＰＲ１
这一关键信号节点在 ＳＡ信号转导过程中的独特性
和重要性ꎮ
本实验拟结合课题组前期转录组测序数据ꎬ 设
计特定引物ꎬ 从中国红豆杉细胞中克隆 ＴｃＮＰＲ１
基因ꎬ 并对其功能和分子进化进行研究ꎬ 为进一步
探究红豆杉细胞响应 ＳＡ诱导大量合成紫杉醇的信
号途径提供依据ꎮ
１　 材料与方法
１􀆰 １　 实验材料
中国红豆杉(Ｔａｘｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ)细胞系为华中
科技大学生命科学与技术学院资源生物学与生物技
术实验室保存ꎬ 细胞系保存于 Ｇａｍｂｏｒｇ􀆳ｓ Ｂ５培养
基中ꎬ ２８ ｄ 继代培养一次ꎬ ２５℃ꎬ 暗培养ꎻ 烟草
无菌苗繁殖于 ＭＳ 培养基中ꎬ １５ ｄ 继代一次ꎬ
２５℃ꎬ １２ ｈ光照 / １２ ｈ黑暗培养ꎮ
１􀆰 ２　 实验方法
１􀆰 ２􀆰 １　 ＴｃＮＰＲ１基因克隆
根据从转录组数据库中筛选的序列ꎬ 利用
Ｐｒｉｍｅｒ ６􀆰 ０ 设计引物 (ＴｃＮＰＲ１￣Ｆ: ５′￣ ＡＴＧＧＣＧ￣
ＣＡＧＡＴＡＡＧＣＣＴＡＡＡＴ￣３′和 ＴｃＮＰＲ１￣Ｒ: ５′￣ＴＴＡＴＣ
ＧＡＴＴＴＴＴＣＡＧＡＧＴＣＣＴＧＴＡ￣３′)ꎮ
ＰＣＲ 反应程序为: ９４℃ 预变性 ３ ｍｉｎꎻ ９４℃
变性 ３０ ｓꎬ ５８℃退火 ５０ ｓꎬ ７２℃延伸 ９０ ｓꎬ 共 ３５
个循环ꎻ 最后 ７２℃延伸 ６ ｍｉｎꎮ ＰＣＲ产物用 ０􀆰 ８％
琼脂糖凝胶电泳分离后回收目的片段ꎬ 与 ｐＭＤ１８￣Ｔ
载体连接后转化大肠杆菌菌株 ＤＨ５ａꎬ 挑取单克隆
并测序ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ２　 生物信息学分析
开放阅读框(ＯＲＦ)查找使用ＯＲＦ ｆｉｎｄｅｒ (ｈｔｔｐ: / /
ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ / ｇｏｒｆ / ｇｏｒｆ.ｈｔｍｌ)ꎻ 同源比对
使用 ｂｌａｓｔｐ (ｈｔｔｐ: / / ｂｌａｓｔ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ)ꎻ 亚细
胞定位预测使用 ＷｏＬＦ ＰＳＯＲＴ (ｈｔｔｐ: / / ｗｏｌｆｐｓｏｒｔ.
ｏｒｇ)ꎻ 序列相似性比对及进化树分析分别采用软件
ＤＮＡＭＡＮ和 ＭＥＧＡ ５􀆰 ０ꎮ
４８３ 植 物 科 学 学 报 第 ３２卷　
１􀆰 ２􀆰 ３　 激素及非生物胁迫因素处理
分别使用 １００ μｍｏｌ / Ｌ 茉莉酸甲酯 (ＭＪ)和
２􀆰 ５ ｍｍｏｌ / Ｌ ＳＡꎬ 及非生物胁迫因素(３０％ 聚乙二
醇 ＰＥＧ６０００和 ２００ ｍｍｏｌ / Ｌ ＮａＣｌ)处理预培养 ２ ｄ
的中国红豆杉悬浮细胞ꎬ 并于处理后 ０􀆰 ５、 １、 ３、
６、 １２ ｈ取样提取总 ＲＮＡꎮ 每个处理设置 ３次重复ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ４　 Ｓｅｍｉ￣ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ￣ＰＣＲ 半定量检测基
因表达量
利用软件 Ｐｒｉｍｅｒ ６􀆰 ０ 设计半定量 ＲＴ￣ＰＣＲ 扩
增引物(表 １)ꎬ 并以红豆杉细胞 １８ｓ ｒＤＮＡ 序列为
内参基因ꎮ
表 １　 半定量 ＲＴ￣ＰＣＲ引物
Ｔａｂｌｅ １　 Ｐｒｉｍｅｒｓ ｏｆ ｓｅｍｉ￣ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ￣ＰＣＲ
引物
Ｐｒｉｍｅｒ
碱基序列(５′－３′)
Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ
产物长度(ｂｐ)
Ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ
ｐｒｏｄｕｃｔｓ
ＴｃＮＰＲ１￣ｄｌ￣Ｆ ＡＴＣＴＣＣＡＧＧＡＧＧＣＴＡＡＣＴＡ
ＴｃＮＰＲ１￣ｄｌ￣Ｒ ＣＧＣＴＡＡＣＧＣＡＡＣＴＣＴＡＴＴ
２０７
１８ｓ￣ｄｌ￣Ｆ ＴＣＴＧＧＴＣＣＴＧＴＴＣＣＧＴＴＧＧＣ
１８ｓ￣ｄｌ￣Ｒ ＴＧＣＴＴＴＣＧＣＡＧＴＧＧＴＴＧＴＣＴＴ
１００
ＰＣＲ反应条件: ９４℃预变性 ５ ｍｉｎꎻ ９４℃变性
１５ ｓꎬ ５６℃退火 １５ ｓꎬ ７２℃延伸 ２０ ｓꎬ 共 ４０个循
环ꎻ 最后 ７２℃延伸 １０ ｍｉｎꎮ
利用全自动多色荧光 /化学发光 /可见光凝胶成
像分析系统(ＣｈａｍｐＣｈｅｍｉ ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ)将表达量
数字化ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ５　 超表达 ＴｃＮＰＲ１转基因烟草的获得及分析
根据 ＴｃＮＰＲ１序列设计引物ꎬ 引入相应酶切位点
(ＴｃＮＰＲ１￣ｚＦ: ５′￣ＡＡＣＴＡＧＴＡＴＧＧＣＧＣＡＧＡＴＡＡＧＣＣ
ＴＡＡＡＴ￣３′ꎬ ＳｐｅⅠ位点ꎻ ＴｃＮＰＲ１￣ｚＲ: ５′￣ＡＧＧＴＴＡＣ
ＣＴＴＡＴＣＧＡＴＴＴＴＴＣＡＧＡＴＣＣＴＧＴＡ￣３′ꎬ ＢｓｔＥⅡ位
点)ꎮ 将扩增的 ＴｃＮＰＲ１基因连接到 ｐＣＡＭＢＩＡＩ１３０３
载体中ꎬ 构建超表达载体 ｐ１３０３∷ＴｃＮＰＲ１ꎬ 然后
采用叶盘法[１１]将超表达载体 ｐ１３０３∷ＴｃＮＰＲ１ 导
入烟草中ꎻ 提取转基因烟草基因组 ＤＮＡꎬ 采用 ＰＣＲ
扩增 ＴｃＮＰＲ１ 和潮霉素基因ꎮ 扩增潮霉素基因引
物为 Ｈｙｇ￣Ｆ: ５′￣ＡＴＧＡＡＡＡＡＧＣＣＴＧＡＡＣＴＣ￣３′和
Ｈｙｇ￣Ｒ: ５′￣ＣＴＡＴＴＴＣＴＴＴＧＣＣＣＴＣＧＧ￣３′ꎮ 潮霉素
基因和 ＴｃＮＰＲ１ 基因扩增均为阳性的植株是成功
转化植株ꎬ 用于抗性实验ꎮ 以生长状态较为一致的
Ｔ２代转基因纯系烟草植株及野生型对照烟草为材
料ꎬ 使用 ＰＥＧ６０００ 进行干旱处理ꎬ ４ ｄ 后采用蒽
酮比色法测定烟草叶片中的可溶性糖含量ꎬ 每株测
定 ３次ꎮ
２　 结果与分析
２􀆰 １　 ＴｃＮＰＲ１基因克隆及同源比对分析
依据转录组数据库提供的序列信息ꎬ 设计特异
引物扩增 ＮＰＲ１基因(图 １)ꎬ 并将扩增到的基因经
测序验证正确后命名为 ＴｃＮＰＲ１ꎮ
4500
3000
2000
1200
800
500
200
M 1bp
Ｍ: ＤＮＡ分子量 Ｍａｋｅｒ Ⅲꎻ 泳道 １: ＰＣＲ产物ꎮ
Ｍ: ＤＮＡ Ｍａｋｅｒ Ⅲꎻ Ｌａｎｅ １: Ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ＰＣＲ.
图 １　 ＴｃＮＰＲ１琼脂糖凝胶电泳图
Ｆｉｇ􀆰 １　 ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＴｃＮＰＲ１
　 　 测序结果显示ꎬ ＴｃＮＰＲ１基因完整的开放阅读
框大小为 １８５７ ｂｐꎬ 编码的蛋白由 ６１９个氨基酸组
成ꎬ 分子量为 ６８ ｋＤꎬ ｐＩ 值为 ５􀆰 ８９ꎬ 其核定位序
列位于第 ３４１位至 ３５５位(图 ２)ꎮ
将 ＴｃＮＰＲ１ 与其它物种的 ＮＰＲ１ 或 ＮＰＲ１￣ｌｉｋｅ
蛋白序列进行同源比对(图 ３)ꎬ 结果显示 ＴｃＮＰＲ１
蛋白含有典型的 ＮＰＲ１ 或 ＮＰＲ１￣ｌｉｋｅ 保守结构域:
ＢＴＢ / ＰＯＺ(Ｂｒｏａｄ￣Ｃｏｍｐｌｅｘꎬ Ｔｒａｍｔｒａｃｋꎬ ａｎｄ Ｂｒｉｃ￣
ａ￣ｂｒａｃ / Ｐｏｘ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ)结构域和锚蛋
白重复结构域ꎮ ＮＰＲ１￣ｌｉｋｅ 结构域覆盖整个蛋白序
列上第 ２５１ 位至 ５８８ 位的氨基酸长度ꎬ 这一结构
域主要存在于真核细胞蛋白序列中ꎬ 是 ＮＰＲ１类蛋
白的标志保守域ꎬ 在植物中含有这一结构域的蛋白
多数是参与植物防御反应的蛋白[１２]ꎮ
　 　 基于 ２ｄｖｗＡ模板ꎬ 通过 ＳＷＩＳＳ￣ＭＯＤＥＦ 在线
预测 ＴｃＮＰＲ１ 三维结构ꎬ 结果显示该蛋白的三维
５８３　 第 ４期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 谢 莎等: 中国红豆杉 ＴｃＮＰＲ１基因的克隆与功能研究
★★
★★★★★★★★★★★★★★★
★: 预测的核定位肽ꎻ : 精氨酸ꎬ 是组装 ＴｃＮＰＲ１复合体的重要残基ꎮ
★ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ＮＬＳｓ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄꎻ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ Ｃｙｓ ｗｈｉｃｈ ｈａｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｆｏｒｍｉｎｇ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ￣ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ
ＴｃＮＰＲ１.
图 ２　 ＴｃＮＰＲ１基因的开放阅读框序列及其推导的氨基酸序列
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ ａｎｄ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＴｃＮＰＲ１
６８３ 植 物 科 学 学 报 第 ３２卷　
黑色代表相同的氨基酸ꎻ 红色和蓝色代表同源的氨基酸残基ꎮ
Ｂｌａｃｋ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄꎻ Ｒｅｄ ａｎｄ ｂｌｕｅ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ.
ＧｈＮＰＲ１(ＡＢＣ５４５５８􀆰１)ꎬ ＲｃＮＰＲ１ ( ＸＰ ＿００２５１４１２７􀆰１)ꎬ ＭｔＮＰＲ１￣１ ( ＸＰ ＿００３５９４４６４􀆰１)ꎬ ＧｍＮＰＲ１￣２ (ＮＰ ＿００１２３８６７４􀆰１)ꎬ ＮｇＮＰＲ３
(ＡＢＮ４５７４７􀆰１)ꎬ ＣｓＮＰＲ３￣ｌｉｋｅ(ＸＰ＿００６４６８４４１􀆰１) .
图 ３　 不同物种间 ＮＰＲ１蛋白氨基酸序列同源性比对
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ ｏｆ ＮＰＲ１ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ
７８３　 第 ４期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 谢 莎等: 中国红豆杉 ＴｃＮＰＲ１基因的克隆与功能研究
结构主要是以螺旋为基本结构单元形成的平行或反
向平行螺旋结构(图 ４)ꎬ 这与其它物种中 ＮＰＲ１蛋
白结构相似ꎮ
对ＮＰＲ１/ ＮＰＲ１￣ｌｉｋｅ蛋白的保守域序列分析发现ꎬ
ＴｃＮＰＲ１蛋白共有 ３４个严格保守的氨基酸(表 ２)ꎮ
图 ４　 ＴｃＮＰＲ１蛋白三维结构预测
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｔｈｒｅｅ￣ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ
ｏｆ ＴｃＮＰＲ１ ｐｒｏｔｅｉｎ
２􀆰 ２　 ＴｃＮＰＲ１进化分析
选取其它物种中功能已确定的 ＮＰＲ１类蛋白与
ＴｃＮＰＲ１蛋白序列构建进化树(图 ５)ꎬ 聚类结果显
示ꎬ 各物种间 ＮＰＲ１蛋白的亚型种类较多ꎬ 如拟南
芥的 ６个同源 ＮＰＲ１ 分布于不同的分支中(Ⅰ、 Ⅱ
和Ⅲ)ꎮ ＮＰＲ１ 蛋白的亚型Ⅰ类以 Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏ￣
ｔｅｉｎ ＮＰＲ１ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ( ＡｔＮＰＲ１ ) 和
Ａｔ４ｇ２６１２０ / ＮＰＲ２ 为代表ꎬ Ⅱ类以 Ａｔ５ｇ４５１１０ /
ＮＰＲ３ 和 Ａｔ４ｇ１９６６０ / ＮＰＲ４ 为 代 表ꎬ Ⅲ 类 以
Ａｔ２ｇ４１３７０ / ＮＰＲ５ 和 Ａｔ３ｇ５７１３０ / ＮＰＲ６ 为代表ꎮ
Ｚｈａｎｇ等[１３]发现Ⅱ类(ＮＰＲ３ 和 ＮＰＲ４)是植物抗
病反应机制中的负调控因子ꎮ Ａｔ３ｇ５７１３０ / ＮＰＲ６ 和
Ａｔ２ｇ４１３７０ / ＮＰＲ５聚在一起ꎬ 形成了与 ＮＰＲ１遗传
距离最远的一个分支ꎬ 这两类蛋白(ＮＰＲ５和ＮＰＲ６)
与植株生长形态有关ꎬ 如叶柄、 花器官和非对称花
朵脱落等[１４－１６ ]ꎬ 这些分析结果揭示 ＮＰＲ１ 在植物
中功能呈现多样性ꎮ
ＴｃＮＰＲ１属于 ＮＰＲ１ 类ꎬ 与 ＡｔＮＰＲ３ 和 ＡｔＮＰＲ４
类蛋白的亲源关系较近ꎮ 对其氨基酸序列进行分析
发现ꎬ ＴｃＮＰＲ１含有较多的 ＮＰＲ１类蛋白的保守氨
基酸ꎻ 同时序列上 Ｃｙｓ２１０是一个重要的保守氨基
酸ꎬ 协助 ＴｃＮＰＲ１定位于植物胞质内[９]ꎮ
２􀆰 ３　 ＴｃＮＰＲ１基因响应激素及非生物胁迫因素诱
导表达分析
研究表明ꎬ 信号分子 ＳＡ 和 ＭＪ 可以激活植物
细胞中 ＮＰＲ１基因的表达ꎮ 利用半定量 ＲＴ￣ＰＣＲ技
术检测了中国红豆杉细胞中 ＴｃＮＰＲ１ 对 ＳＡ 和 ＭＪ
诱导的响应特征ꎬ 分析结果显示ꎬ ＳＡ 处理中国红
豆杉细胞后ꎬ ＴｃＮＰＲ１基因的表达量随着时间的增
加有增强的趋势ꎬ 但 ＭＪ处理后 ＴｃＮＰＲ１的表达量
无明显变化(图 ６)ꎬ 这说明 ＴｃＮＰＲ１基因的表达响
应于 ＳＡ的诱导ꎮ
植物中 ＮＰＲ１基因的主要功能是参与植物的抗
胁迫过程ꎬ 尤其是与植物的抗病虫过程密切相关ꎮ
为了探究中国红豆杉细胞中 ＴｃＮＰＲ１ 基因是否参
与植物的抗逆过程ꎬ 本实验采用非生物胁迫因素
(３０％ ＰＥＧ６０００和 ２００ ｍｍｏｌ / Ｌ ＮａＣｌ)刺激中国红
豆杉细胞ꎬ 并监测 ＴｃＮＰＲ１ 基因表达量变化ꎬ 来
初步验证 ＴｃＮＰＲ１ 的功能ꎮ 半定量 ＲＴ￣ＰＣＲ 检测
结果显示ꎬ ＮａＣｌ和 ＰＥＧ处理后 ＴｃＮＰＲ１基因的表
达量有所增加(图 ７)ꎬ 表明 ＴｃＮＰＲ１基因参与了中
国红豆杉细胞对抗盐、 抗旱胁迫的反应过程ꎮ
２􀆰 ３　 超表达 ＴｃＮＰＲ１烟草遗传转化及鉴定
为了进一步探究 ＴｃＮＰＲ１的功能ꎬ 通过构建组成
型表达载体转化烟草进行抗旱实验ꎬ 分析 ＴｃＮＰＲ１
基因潜在的抗逆功能ꎮ 叶盘法转化烟草叶片后ꎬ 将
表 ２　 ＴｃＮＰＲ１ / ＮＰＲ１￣ｌｉｋｅ蛋白保守域中高度保守的氨基酸
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｈｉｇｈｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ (ａａ) ｉｎ ｔｈｅ ＴｃＮＰＲ１ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
位点
Ｌｏｃｉ
氨基酸
ａａ
位点
Ｌｏｃｉ
氨基酸
ａａ
位点
Ｌｏｃｉ
氨基酸
ａａ
位点
Ｌｏｃｉ
氨基酸
ａａ
位点
Ｌｏｃｉ
氨基酸
ａａ
位点
Ｌｏｃｉ
氨基酸
ａａ
３８５ Ｔ ４３８ Ｌ ４５３ Ｐ ５０６ Ｄ ５３９ Ｆ ５８３ Ａ
３９７ Ｇ ４４２ Ｅ ４７３ Ｅ ５１２ Ｐ ５４０ Ｐ ５８４ Ｆ
４０６ Ｃ ４４３ Ｎ ４７４ Ａ ５２８ Ｌ ５４２ Ｃ ５８７ Ｄ
４１０ Ｌ ４４４ Ｒ ４７８ Ｍ ５３１ Ｔ ５４３ Ｓ ４４５ Ｖ
４１１ Ｅ ４４８ Ａ ４８１ Ａ ５３２ Ｖ ５７５ Ｅ
４１８ Ｐ ４５２ Ｆ ４８６ Ｔ ５３５ Ｇ ５６９ Ｋ
８８３ 植 物 科 学 学 报 第 ３２卷　
72
94
75
91
54
98
68
94
54
83
95
40
0 5. 0 4. 0 3. 0 2. 0 1. 0 0.
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
NPR1-1 protein Glycine max
NPR1-2 protein
NPR-1 x
NPR-1
Regulatory protein NPR1-putative
Regulatory protein NPR2
NPR1- like3 protein
NPR1- like protein 4
nonexpressor of pathogenesis-related genes 3
At5g45110/NPR3
At4g19660/NPR4
NPR1-like protein ABB Group
Regulatory protein NPR1
TcNPR1
Regulatory protein NPR1
At4g26120/NPR2
Non-expressor of PR1 AAA Group
NPR1
Non-expressor of PR1
NPR1-1
NPR1
NPR1 protein
NPR1
NPR1
At3g57130/NPR6
At2g41370/NPR5
Glycine max
Pyrus bretschneideri
Pyrus pyrifolia
Ricinus communis
Populus deltoides
Theobroma cacao
Theobroma cacao
Nicotiana glutinosa
Musa
Zea mays
Arabidopsis thaliana
Musa acuminata
Medicago truncatula
Theobroma cacao
Populus deltoides
Capsicum annuum
Capsicum chinense
Nicotiana tabacum
Nicotiana glutinosa
Ⅱ
Ⅰ
Ⅲ
图 ５　 ＴｃＮＰＲ１ ＮＪ进化树分析
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣ｊｏｉｎｉｎｇ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｏｆ ＴｃＮＰＲ１ ａｎｄ ＮＰＲ１ ｆｒｏｍ ｏｔｈｅｒ ｐｌａｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ
Ａ: 半定量 ＲＴ￣ＰＣＲ分析 ＴｃＮＰＲ１基因表达量ꎻ Ｂ: 表达量数字化ꎮ
Ａ: Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＴｃＮＰＲ１ ｂｙ ｓｅｍｉ￣ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ￣ＰＣＲꎻ Ｂ: Ｄｉｇｉｔａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ.
图 ６　 ＴｃＮＰＲ１响应 ＳＡ(２􀆰 ５ ｍｍｏｌ / Ｌ)和 ＭＪ(１００ μｍｏｌ / Ｌ)诱导表达分析
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＴｃＮＰＲ１ ｂｙ ｓｅｍｉ￣ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ￣ＰＣＲ ｕｎｄｅｒ
ＳＡ(２􀆰 ５ ｍｍｏｌ / Ｌ) ａｎｄ ＭＪ(１００ μｍｏｌ / Ｌ) ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
９８３　 第 ４期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 谢 莎等: 中国红豆杉 ＴｃＮＰＲ１基因的克隆与功能研究
叶片置于脱分化培养基上ꎬ １０ ｄ 左右出现愈伤组
织(图 ８: Ａ、 Ｂ)ꎻ 将愈伤组织转入分化培养基ꎬ
１０ ｄ左右分化出小苗(图 ８: Ｃ)ꎻ 将生长状况良好
的阳性烟草小苗转入生根培养基(图 ８: Ｄ)ꎬ ７ ｄ
左右生根(图 ８: Ｅ)ꎮ 以再生烟草和野生型烟草
(对照)的基因组 ＤＮＡ 为模板对潮霉素和 ＴｃＮＰＲ１
基因进行扩增来筛选阳性植株ꎬ 然后将筛选出的阳
性烟草植株移至营养钵(市场购买的营养土)中栽
培并收获种子(Ｔ１代)ꎮ
将 Ｔ１代种子播种在含有潮霉素的培养基上筛选ꎬ
获得了 ２株烟草抗性植株ꎬ 再经潮霉素和 ＴｃＮＰＲ１
基因扩增确定为阳性转化植株ꎬ 命名为 Ｔｒ１和 Ｔｒ２１
B2.5
2
1.5
1
0.5
0 0 0.5 1 3 6 12
!"#$ Time ( h )
PEG6000 NaCl
%
&

(
)
R
el
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iv
e
ex
pr
es
si
on
le
ve
l
A
TcNPR1
18s
TcNPR1
18s
PEG6000
NaCl
0 h 0.5 h 1 h 3 h 6 h 12 h
0 h 0.5 h 1 h 3 h 6 h 12 h
Ａ: 半定量 ＲＴ￣ＰＣＲ分析 ＴｃＮＰＲ１基因表达量ꎻ Ｂ: 表达量数字化ꎮ
Ａ: Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＴｃＮＰＲ１ ｂｙ ｓｅｍｉ￣ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ￣ＰＣＲꎻ Ｂ: Ｄｉｇｉｔａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ.
图 ７　 ＮａＣｌ(２００ ｍｍｏｌ / Ｌ)和 ３０％ ＰＥＧ６０００诱导 ＴｃＮＰＲ１的表达分析
Ｆｉｇ􀆰 ７　 Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＴｃＮＰＲ１ ｂｙ ｓｅｍｉ￣ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ￣ＰＣＲ ｕｎｄｅｒ
ＮａＣｌ(２００ ｍｍｏｌ / Ｌ) ａｎｄ ３０％ ＰＥＧ６０００ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
Ａꎬ Ｂ: 烟草愈伤组织ꎻ Ｃ: 烟草丛芽ꎻ Ｄ: 烟草丛芽生根培养ꎻ Ｅ: 转基因烟草生根(箭头所示为根)ꎮ
Ａꎬ Ｂ: Ｔｏｂａｃｃｏ ｃａｌｌｕｓꎻ Ｃ: Ｔｏｂａｃｃｏ ｓｈｏｏｔｓꎻ Ｄ: Ｔｏｂａｃｃｏ ｓｈｏｏｔｓ ｆｏｒ ｒｏｏｔｉｎｇꎻ Ｅ: Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｔｏｂａｃｃｏ ｒｏｏｔｓ(ａｒｒｏｗ ｓｈｏｗｓ ｒｏｏｔｓ) .
图 ８　 叶盘法获得转化烟草
Ｆｉｇ􀆰 ８　 Ｔｏｂａｃｃｏ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｙ ｌｅａｆ ｄｉｓｃ ｍｅｔｈｏｄ
０９３ 植 物 科 学 学 报 第 ３２卷　
(图 ９)ꎮ 将 Ｔｒ１和 Ｔｒ２１移栽到营养钵(市场购买的
营养土)中ꎬ ６个月后收获种子(Ｔ２代)ꎮ 将 Ｔ２代种
子播种到已灭菌的营养体中ꎬ 待其发芽长出新叶
后ꎬ 提取烟草嫩叶的基因组 ＤＮＡ 并作为模板扩增
潮霉素基因ꎬ 选取能扩增出条带的 Ｔ２代转基因烟
草幼苗进行抗旱性试验ꎮ ＰＥＧ６０００ 处理 ４ ｄ 后ꎬ
转 ＴｃＮＰＲ１基因的烟草植株虽在抗性表型上与野
生型烟草(对照)无明显差异ꎬ 但其植株的生长势及
大小显著优于野生型烟草(图 １０)ꎬ 说明转 ＴｃＮＰＲ１
后可提高植株对干旱的耐受力ꎮ 通过对烟草叶片的
A
B
M
M
1
1
2
2
3
3
4
4
5
5
6
6
7
7
8
8
9
9
10
10
11
11
12
12
13
13
14
14
15
15
16
16
17
17
18
18
19
19
20
20
21
21
22
22
23
23
24
24
4500
3000
2000
1200
800
500
200
4500
3000
2000
1200
800
500
200
bp
Ａ: 潮霉素基因扩增ꎻ Ｂ: ＴｃＮＰＲ１基因扩增ꎮ
Ｍ: ＤＮＡ分子量 ＭａｋｅｒⅢꎻ 泳道 １~２２: 转基因烟草ꎻ 泳道 ２３~２４: 未转化烟草ꎮ
Ａ: Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎꎻ Ｂ: ＴｃＮＰＲ１ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ.
Ｍ: ＤＮＡ Ｍａｋｅｒ Ⅲꎻ Ｌａｎｅ１－２２: Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｔｏｂａｃｃｏ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓꎻ Ｌａｎｅ ２３－２４: Ｕｎｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｔｏｂａｃｃｏ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ.
图 ９　 转基因烟草 ＰＣＲ鉴定
Ｆｉｇ􀆰 ９　 ＰＣＲ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｔｏｂａｃｃｏ
A B
C D
Ａꎬ Ｃ: 对照烟草ꎻ Ｂꎬ Ｄ: Ｔ２代转基因烟草ꎻ Ｃꎬ Ｄ: 经 ＰＥＧ６０００处理 ４ ｄꎮ
Ａꎬ Ｃ: Ｃｏｎｔｒｏｌ ｔｏｂａｃｃｏ ｐｌａｎｔｓꎻ Ｂꎬ Ｄ: Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ Ｔ２ ｐｌａｎｔꎻ Ｃꎬ Ｄ: ＰＥＧ６０００ ｔｒｅａｔｅｄ ｆｏｒ ４ ｄ.
图 １０　 转基因烟草抗旱性分析
Ｆｉｇ􀆰 １０　 Ｄｒｏｕｇｈｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｗｉｌｄ￣ｔｙｐｅ ａｎｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ ｐｌａｎｔｓ
１９３　 第 ４期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 谢 莎等: 中国红豆杉 ＴｃＮＰＲ１基因的克隆与功能研究
可溶性糖含量进行分析发现(图 １１)ꎬ 转 ＴｃＮＰＲ１
基因烟草植株内可溶性糖的积累量可达 ４３􀆰 ８ ｍｇ / ｇ
(ＦＷ)ꎬ 比对照高出 ２ 倍左右ꎮ 可溶性糖是植物体
内一种重要的有机渗透调节物质ꎬ 经干旱胁迫诱导
后烟草植株内的可溶性糖受到诱导而积累ꎬ 说明
ＴｃＮＰＲ１基因的导入对可溶性糖含量的积累具有促
进作用ꎬ 进而提高植株对干旱的耐受力ꎮ
10
20
30
40
50
60
Water 30% PEG6000
!"#$
Different treatment
Wild type
Tr1 line
Tr2 line
%
&

(
)
*
(
/
)
m
g
g
FW
So
lu
bl
e
su
ge
r c
on
te
nt
图 １１　 野生型烟草和转基因烟草中可溶性糖含量分析
Ｆｉｇ􀆰 １１　 Ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｓｏｌｕｂｌｅ ｓｕｇａｒｓ ｏｆ ｔｈｅ
ｗｉｌｄ￣ｔｙｐｅ ａｎｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ ｐｌａｎｔｓ
３　 讨论
ＳＡ是植物体内的主要调控激素之一ꎬ 参与调
控其生长发育ꎬ 并响应逆境胁迫等多种生理活动ꎮ
ＳＡＲ防御反应是一个综合复杂的调控过程ꎬ 也是
ＳＡ调控的最重要部分ꎬ ＮＰＲ１类蛋白被认为在 ＳＡ
调控中发挥了关键作用[６ꎬ７]ꎮ 然而ꎬ 目前报道的
ＮＰＲ１蛋白较少ꎬ 且对大多数植物的 ＮＰＲ１ 蛋白没
有进行深入的分析与研究ꎮ 红豆杉能够合成抗癌活
性物质紫杉醇ꎬ 紫杉醇已被广泛应用于各种癌症的
治疗ꎮ 紫杉醇的生物合成显著响应于 ＳＡ 诱导ꎬ 但
其调控机理尚不清楚ꎬ 因此ꎬ 从中国红豆杉中克隆
ＮＰＲ１基因ꎬ 并对其分子进化、 受激素及非生物胁
迫因素诱导表达等进行研究ꎬ 对于阐明该机理具有
重要的意义ꎮ
本实验从中国红豆杉细胞中克隆了ＴｃＮＰＲ１ 基
因ꎬ 它具有 ＮＰＲ１类蛋白的典型结构域: ＢＴＢ/ ＰＯＺ
结构域和 ＡＮＫ结构域ꎮ 其中ꎬ ＡＮＫ这一结构域分
布广泛ꎬ 主要调节蛋白与蛋白之间的相互作用[１７ꎬ １８]ꎮ
ＴｃＮＰＲ１与其它已进行功能验证的 ＮＰＲ１ 蛋白序列
具有很高的同源性ꎬ 表明 ＴｃＮＰＲ１ 是一个典型的
ＮＰＲ１类蛋白ꎮ 进化树分析发现ꎬ 拟南芥的 ＮＰＲ１ /
ＮＰＲ２、 ＮＰＲ３ / ＮＰＲ４、 ＮＰＲ５ / ＮＰＲ６是 ＮＰＲ１ 类蛋
白 ３个不同类型的亚家族ꎬ 它们具有不同的功能ꎻ
ＴｃＮＰＲ１与 ＮＰＲ３ / ＮＰＲ４亚家族具有更近的亲缘关
系ꎬ 可能与拟南芥 ＮＰＲ３ / ＮＰＲ４发挥相同或相似的
功能ꎮ
ＳＡ 和 ＪＡ 分别参与了植物获得系统性抗性
(ＳＡＲ)和诱导系统抗性( ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｒｅｓｉｓｔ￣
ａｎｃｅꎬ ＩＳＲ)信号途径ꎬ 并且这两种信号途径在植
物防御反应中呈现出拮抗现象[１９]ꎮ ＮＰＲ１ 在拮抗
作用中具有重要的调控作用ꎬ 表现为响应于 ＳＡ 诱
导并阻遏 ＪＡ信号路径中的相关基因表达ꎮ 通过对
中国红豆杉细胞的激素处理发现ꎬ ＴｃＮＰＲ１基因受
到 ＳＡ 的显著诱导ꎬ 但对 ＪＡ 不敏感ꎬ 这与 Ｆｅｙｓ
等[２０]的研究结果高度一致ꎮ 本研究通过 ＴｃＮＰＲ１
对干旱 ( ３０％ ＰＥＧ６０００) 和高盐 ( ２００ ｍｍｏｌ / Ｌ
ＮａＣｌ)刺激的响应分析发现ꎬ ＴｃＮＰＲ１ 强烈响应于
逆境胁迫ꎬ 表明该基因可能参与了植物抗旱及抗盐
胁迫的生理活动ꎮ
可溶性糖含量是植物响应抗旱胁迫的主要评价
指标之一ꎮ 将 ＴｃＮＰＲ１ 导入烟草植株中进行超表
达研究ꎬ 发现受干旱刺激后转基因植株的可溶性糖
含量增加程度显著高于对照植株ꎬ 且转基因植株的
抗旱性也有一定提高ꎬ 表明 ＴｃＮＰＲ１ 是植物响应
逆境胁迫的关键调控因子ꎮ 但 ＴｃＮＲＰ１ 基因参与
ＳＡ信号途径的具体调控功能尚不清晰ꎬ 进化树的
分析结果揭示了 ＴｃＮＲＰ１ 可能发挥了与 ＮＰＲ３ /
ＮＰＲ４蛋白相同或相似的作用ꎬ 进而调控了 ＳＡ 响
应基因ꎮ 这些结果为进一步探究红豆杉细胞响应
ＳＡ诱导大量合成紫杉醇的信号途径提供了依据ꎮ
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ｍｅｍｂｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ＴＧＡ / ＯＢＦ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
ｆａｃｔｏｒｓ ｔｈａｔ ｂｉｎｄ ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ＰＲ￣１ ｇｅｎｅ ｒｅ￣
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[１３] 　 Ｚｈａｎｇ Ｙꎬ Ｃｈｅｎｇ ＹＴꎬ Ｑｕ Ｎꎬ Ｚｈａｏ ＱＧꎬ Ｂｉ ＤＬꎬ ＬＸ.
Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｆｅｎｓｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ Ａｒａｂｉ￣
ｄｏｐｓｉｓ ｂｙ ｔｗｏ ＮＰＲ１ ｐａｒａｌｏｇｓ[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｊꎬ ２００６ꎬ
４８(５): ６４７－ ６５６.
[１４] 　 Ｈａ ＣＭꎬ Ｊｕｎ ＪＨꎬ Ｎａｍ ＨＧꎬ Ｆｌｅｔｃｈｅｒ ＪＣ. Ｂｌａｄｅ￣ｏｎ￣
ｐｅｔｉｏｌｅ１ ｅｎｃｏｄｅｓ ａ ＢＴＢ / ＰＯＺ ｄｏｍａｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅ￣
ｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｌｅａｆ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａ￣
ｌｉａｎａ[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌꎬ ２００４ꎬ ４５(１０): １３６１－
１３７０.
[１５] 　 Ｈｅｐｗｏｒｔｈ ＳＲꎬ Ｚｈａｎｇ Ｙꎬ ＭｃＫｉｍ Ｓꎬ Ｌｉ Ｘꎬ Ｈａｕｇｈｎ
ＧＷ. Ｂｌａｄｅ￣ｏｎ￣ｐｅｔｉｏｌｅ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｃｏｎ￣
ｔｒｏｌｓ ｌｅａｆ ａｎｄ ｆｌｏｒａｌ ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ[ Ｊ] .
Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌꎬ ２００５ꎬ １７(５): １４３４－１４４８.
[１６] 　 Ｎｏｒｂｅｒｇ Ｍꎬ Ｈｏｌｍｌｕｎｄ Ｍꎬ Ｎｉｌｓｓｏｎ Ｏ. Ｔｈｅ ｂｌａｄｅ ｏｎ
ｐｅｔｉｏｌｅ ｇｅｎｅｓ ａｃｔ ｒｅｄｕｎｄａｎｔｌｙ ｔｏ ｃｏｎｔｒｏｌ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ
ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｌａｔｅｒａｌ ｏｒｇａｎｓ [ Ｊ] . Ｄｅｖｅｌｏｐ￣
ｍｅｎｔꎬ ２００５ꎬ １３２(９): ２２０３－２２１３.
[１７] 　 Ｂｏｒｋ Ｐ. Ｈｕｎｄｒｅｄｓ ｏｆ ａｎｋｙｒｉｎ￣ｌｉｋｅ ｒｅｐｅａｔｓ ｉｎ ｆｕｎｃ￣
ｔｉｏｎａｌｌｙ ｄｉｖｅｒｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ: ｍｏｂｉｌｅ ｍｏｄｕｌｅｓ ｔｈａｔ
ｃｒｏｓｓ ｐｈｙｌａ ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌｌｙ [ Ｊ] . Ｐｒｏｔｅｉｎｓꎬ １９９３ꎬ １７
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[１８] 　 Ｓｅｄｇｗｉｃｋ ＳＧꎬ Ｓｍｅｒｄｏｎ ＳＪ. Ｔｈｅ ａｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ: ａ
ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｎ ａ ｃｏｍｍｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ
ｆｒａｍｅｗｏｒｋ [ Ｊ] . Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉꎬ １９９９ꎬ ２４
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[１９] 　 Ｎｉｋｉ Ｔꎬ Ｍｉｔｓｕｈａｒａ Ｉꎬ Ｓｅｏ Ｓꎬ Ｏｈｔｓｕｂｏ Ｎꎬ Ｏｈａｓｈｉ Ｙ.
Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｊａｓｍｏｎｉｃ
ａｃｉｄ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ￣ｒｅｌａｔｅｄ
(ＰＲ) ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｗｏｕｎｄｅｄ ｍａｔｕｒｅ ｔｏｂａｃｃｏ
ｌｅａｖｅｓ[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌꎬ １９９８ꎬ ３９(５): ５００－
５０７.
[２０] 　 Ｆｅｙｓ ＢＪꎬ Ｐａｒｋｅｒ ＪＥ. Ｉｎｔｅｒｐｌａｙ ｏｆ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈ￣
ｗａｙｓ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ[Ｊ] . Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅ￣
ｎｅｔꎬ ２０００ꎬ １６(１０): ４４９－４５５.
(责任编辑: 刘艳玲)
３９３　 第 ４期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 谢 莎等: 中国红豆杉 ＴｃＮＰＲ１基因的克隆与功能研究